專利名稱：一種編碼木糖異構(gòu)酶的核酸分子及其編碼的木糖異構(gòu)酶的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種新的編碼木糖異構(gòu)酶的核酸分子及其編碼的木糖異構(gòu)酶。本發(fā)明涉及木糖異構(gòu)酶酶學性質(zhì)的研究。本發(fā)明涉及木糖異構(gòu)酶在酶基因工程技術(shù)領域的應用。 本發(fā)明還涉及用編碼木糖異構(gòu)酶的核酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
背景技術(shù)：
石油價格的持續(xù)上漲和溫室效應引起的全球變暖，使得人們越來越重視可再生能源的開發(fā)和利用。生物質(zhì)能便是一種重要的可再生能源，以生物質(zhì)為原料生產(chǎn)燃料乙醇具有廣闊的發(fā)展空間。長期以來，人們利用淀粉和糖類發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。這些原料成本較高，大大限制了生物質(zhì)燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。在全球每年光合作用生產(chǎn)的高達1500億噸 2000 億噸的生物質(zhì)中80%以上為木質(zhì)纖維素類物質(zhì)，它十分廉價且容易獲得，因此以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)燃料乙醇，具有重要的實踐意義。木質(zhì)纖維素是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等的聚合物。利用酸解或酶解的方法可將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為大量的五碳糖(木糖和阿拉伯糖)和六碳糖(葡萄糖、半乳糖和甘露糖)。木糖在大多數(shù)木質(zhì)纖維素水解物中是含量僅次于葡萄糖的一種單糖，可達30 %。分析表明，充分利用木質(zhì)纖維素原料中的木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇能使乙醇產(chǎn)量在原有基礎上提高25% (Nigam et al.，J Appl Microbiol, 2001,90 (2) 208-21 。但是，大部分能夠進行乙醇發(fā)酵的釀酒酵母(Saccharomyce cerevisise)不能夠以木糖作為碳源。所以，如何通過對已有菌株進行改造使其能高效利用木糖產(chǎn)乙醇已成為使木質(zhì)纖維素資源得以充分利用的關(guān)鍵問題之一。自然界利用木糖的酵母菌同化木糖的最初兩步反應是在木糖還原酶(xylose reductase, XR)及木糖醇脫氫酶(xylitoldehydrogenase，XDH)催化下完成的。木糖首先在)(R的催化下，還原成木糖醇，隨后由》)H氧化成木酮糖(Tdff et al.，Appl Environ Microbiol,2001,67 :5668-5674)。在大多數(shù)細菌，如 E. coli 和 Bacillus 等中，木糖通過木糖異構(gòu)酶(XI)直接轉(zhuǎn)化為木酮糖(Tdffet al.，Appl Environ Microbiol, 2001,67 5668-5674)。然后，木酮糖在木酮糖激酶(XK)的作用下轉(zhuǎn)變成5-磷酸木酮糖，進入磷酸戊糖途徑。釀酒酵母(Saccharomyce cerevisise)具有高的酒精產(chǎn)量和產(chǎn)率，對抑制因子以及發(fā)酵過程中的不利因素的高耐受性，對高濃度酒精的耐受以及非致病性等優(yōu)良特性。但由于缺乏木糖代謝的最初兩個酶)(R和》)H而不能代謝木糖。為了使釀酒酵母具有發(fā)酵木糖的能力，將依賴NAD⑵H的)(R及依賴NAD+的畢赤酵母)(DH克隆到其中，得到能夠發(fā)酵木糖生產(chǎn)酒精的重組菌(Walfridsson et al. ,Appl Environ Microbiol, 1995,61 :4184-4190 ； Sedlak et al.，Appl Biochem Biotechnol，2004，113-116 :403-416)。但同時帶來的問題是:)(R對NADPH的親和性遠遠大于NADH，這就導致在)(DH催化的木糖醇氧化成木酮糖的過程中，輔因子的不平衡，其直接后果就是副產(chǎn)物木糖醇的積累和甘油等的生成，從而影響終產(chǎn)物酒精的產(chǎn)量。木糖異構(gòu)酶因不需要輔助因子，因此它再次受到研究者們的注意(Kuyper et al. , FEMS Yeast Research,2004，4 :655-664)。木糖異構(gòu)酶(Xylose isomerase，XI) (EC5. 3. 1. 5)可以催化五碳糖D-木糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖，微生物體內(nèi)的糖代謝工程起著重要的作用；在體外亦能催化D-葡萄糖到 D-果糖的異構(gòu)化反應，所以又稱為葡萄糖異構(gòu)酶。在基礎研究方面，由于該酶的結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系較好的模型之一(Bhosale et al. , Protein Eng Des Sel, 12004,17(12) :861-869)。更重要的是，木糖異構(gòu)酶所具有的極其重要的工業(yè)應用價值，使它和蛋白酶及淀粉酶并稱為重要的工業(yè)用酶(田沈等微生物學通報，2007,34 ) 355-358 ；Bhosale et al. ,Microbiol Rev, 1996,60(2) :280-300)而引起科學家們的關(guān)注， 并對其開展了較為廣泛的研究。從上個世紀70年代以來，木糖異構(gòu)酶的應用主要集中在高果糖漿生產(chǎn)和燃料乙醇產(chǎn)生兩個方面。然而，近幾年，科學家研究發(fā)現(xiàn)，在一定條件下木糖異構(gòu)酶可以轉(zhuǎn)化生產(chǎn)許多制藥工業(yè)重要的原料稀有糖，如核糖、甘露糖、阿拉伯糖、來蘇糖等(Karimaki et al. ,Protein Eng Des Se，12004，17 (12) :861-869)。這些發(fā)現(xiàn)為木糖異構(gòu)酶的研究注入新的活力。據(jù)報道，雖然多種細菌來源的木糖異構(gòu)酶基因都曾被插入到釀酒酵母中，但是常見嗜溫性原核生物的XI在釀酒酵母中不能表達有活性的XI。在目前已公布的約450個木糖異構(gòu)酶氨基酸序列中，兩種來自嗜熱細菌的XI在釀酒酵母中表達產(chǎn)物在 85°C下具有l(wèi)U/mg的木糖異構(gòu)酶特異活性，但是，在釀酒酵母的生理溫度(30°C)僅僅保留這種活性的極少部分。其他來源的能夠在釀酒酵母中活性表達的木糖異構(gòu)酶基因來源包括真菌 Piromyces sp-E2, Orpinomyces sp-Ukkl, Cyllamyces aberensis 禾口細菌 Clostridium phytofermentans, Clostridium difficile, Bacteroides fragilis, Fusobacterium-mortiferum及 Ciona intestinalis。其中，僅僅有真菌 Piromyces sp_E2, 細菌Clostridium phytofermentans來源的木糖異構(gòu)酶在釀酒酵母中得到較高活性表達， 尤其是前者的活性更高。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種新來源的嗜溫性木糖異構(gòu)酶，及編碼該酶的基因，以及表達該酶的宿主細胞。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種編碼木糖異構(gòu)酶的核酸分子，其序列為以下核苷酸序列之一(I)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；(2) SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一個或多個核苷酸的具有至少40%序列一致性的同源序列；(3)在嚴格條件下，與(1)或O)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；(4)由于遺傳密碼子的簡并性區(qū)別于(3)的核苷酸序列的核苷酸序列。一種木糖異構(gòu)酶，其序列為以下氨基酸序列之一(I)SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列；(2) SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一個或多個氨基酸的具有至少40%序列一致性的同源序列。本發(fā)明的編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸編碼的氨基酸不包括選自以下各組的氨基酸序列(I)Piromyces sp_E2木糖異構(gòu)酶在WO 03/062340中公開的序列；
(2)Bacteroides thetaiotaomicron 木糖異構(gòu)酶在 WO 04/099381 和 WO 06/009434中公開的序列；(3) Cyllamyces aberensis 木糖異構(gòu)酶在 WO 04/099381 中公開的序列；(4) Orpinomyces sp-Ukkl 木糖異構(gòu)酶在 Madhavan et al. (2008，supra)中公開的序列；(5)Clostridium difficile,Fusobacterium-mortiferum及Ciona intestinalis 的木糖異構(gòu)酶在WO 2010/074577中公開的序列。本發(fā)明的編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸編碼的氨基酸序列，其序列不包括選自以下各組的氨基酸序列序列一致性高于選自以下各組的氨基酸序列的99，98，97，96，95，94，93， 92，91，90，89，88，87，86，85，84，83，82，81，80，79，78，77，76，75，74，73，72，71 或 70 % 的氨
基酸序列。(I)Piromyces sp_E2木糖異構(gòu)酶在WO 03/062340中公開的序列；(2)Bacteroides thetaiotaomicron 木糖異構(gòu)酶在 WO 04/099381 和 WO 06/009434中公開的序列；(3) Cyllamyces aberensis 木糖異構(gòu)酶在 WO 04/099381 中公開的序列；(4) Orpinomyces sp-Ukkl 木糖異構(gòu)酶在 Madhavan et al. (2008，supra)中公開的序列；(5)Clostridium difficile,Fusobacterium-mortiferum及Ciona intestinalis 的木糖異構(gòu)酶在WO 2010/074577中公開的序列。所述木糖異構(gòu)酶在化工、食品和醫(yī)療等領域的應用。本發(fā)明的木糖異構(gòu)酶具有的極其重要的工業(yè)應用價值，其應用主要集中在高果糖漿生產(chǎn)和燃料乙醇產(chǎn)生兩個方面。在一定條件下木糖異構(gòu)酶還可以轉(zhuǎn)化生產(chǎn)許多制藥工業(yè)重要的原料稀有糖，如核糖、甘露糖、阿拉伯糖、來蘇糖等。在基礎研究方面，由于該酶的結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系較好的模型之一。一種重組載體，其含上述的編碼木糖異構(gòu)酶的核酸分子的完整編碼閱讀框序列。一種重組細胞，其宿主細胞為細菌、酵母或絲狀真菌，優(yōu)選具有厭氧乙醇發(fā)酵能力的酵母；宿主細胞內(nèi)含有上述的重組載體，編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列被可操作地連接于宿主細胞中引起木糖異構(gòu)酶充分表達的啟動子，從而賦予了宿主胞將木糖異構(gòu)化木酮糖的能力。所述宿主細胞優(yōu)選含有主動糖酵解、戊糖磷酸途徑和含有木酮糖激酶活性使得從木糖異構(gòu)得到的木酮糖可以被代謝為丙酮酸的宿主細胞。所述宿主細胞優(yōu)選含有將丙酮酸轉(zhuǎn)化為期望的分解代謝物如乙醇、乙烯或乳酸的酶的宿主細胞。所述宿主細胞優(yōu)選具有厭氧乙醇發(fā)酵能力的酵母；所述宿主細胞還優(yōu)選對乙醇和有機酸如乙酸、乳酸或蟻酸及糖分解代謝物如糠醛和羥甲基糠醛具有耐受能力的宿主細胞。上述宿主細胞的這些特征或活性之一可以是天然存在于宿主細胞或通過遺傳修飾被引入或改進。所述宿主細胞包含一種遺傳修飾，該遺傳修飾降低非特異性醛糖還原酶活性。
所述宿主細胞具有將L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖5-磷酸的能力。所述宿主細胞包含一種或多種遺傳修飾，該遺傳修飾產(chǎn)生選自如下一組的特征(1)增加木糖轉(zhuǎn)運到宿主細胞內(nèi)；(2)木酮糖激酶活性增強；(3)戊糖磷酸途徑的流量增加；(4)對分解代謝物阻遏的敏感性降低；(5)對乙醇、滲透性或有機酸的耐受力增強；(6)副產(chǎn)物生成下降；(7)細胞電子鏈傳遞和氧化呼吸鏈阻斷。所述副產(chǎn)物被理解為是指含碳分子而不是期望的發(fā)酵產(chǎn)物，包括如木糖醇、甘油或乙酸。所述遺傳修飾由過度表達內(nèi)源基因、表達異源基因或其組合組成，且所述基因選自下列基因己糖或戊糖轉(zhuǎn)運蛋白基因、木酮糖激酶基因、來自戊糖磷酸途徑的酶的基因、 糖酵解酶的基因或/和乙醇發(fā)酵相關(guān)的酶的基因。所述宿主細胞表達一種或多種酶，所述的酶賦予宿主細胞產(chǎn)生乳酸、乙酸、琥珀酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β-內(nèi)酰胺抗生素或/和頭孢菌素等系列代謝產(chǎn)物的能力。一種利用上述重組細胞生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法宿主細胞發(fā)酵含有木糖原料或/和葡萄糖原料的培養(yǎng)基，然后分離純化發(fā)酵產(chǎn)物，所述發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸、乙酸、琥珀酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β -內(nèi)酰胺抗生素或/和頭孢菌素。上述被轉(zhuǎn)化的宿主細胞異構(gòu)木糖為木酮糖的能力是直接將木糖異構(gòu)化為木酮糖， 不同于木糖通過木糖醇過度兩步轉(zhuǎn)化為木酮糖，其分別由木糖還原酶和木糖醇脫氫酶催化。本發(fā)明的編碼木糖異構(gòu)酶的核苷酸序列以活性形式在被轉(zhuǎn)化的宿主細胞中表達， 因此，核苷酸序列在宿主細胞中表達生成具有特定活性的木糖異構(gòu)酶。在被轉(zhuǎn)化的宿主細胞中表達的木糖異構(gòu)酶特異性活性在此定義為宿主細胞的無細胞溶解產(chǎn)物如酵母的無細胞溶解產(chǎn)物中的每mg蛋白的木糖異構(gòu)酶活性單位量。木糖異構(gòu)酶活性的確定、蛋白含量和無細胞溶解產(chǎn)物的制備在下述實施例2中描述。新木糖異構(gòu)酶在釀酒酵母中高活性表達。 30°C下，采用 XI-SDH—步法測定木糖異構(gòu)酶酶活(Kuyper et al. ,FEMS Yeast Research, 2003，4 :69-78)，該酶酶活為1. 3U/mg，高于Piromyces sp_E2來源的木糖異構(gòu)酶酶活1. IU/ mg (Kuyper et al. ,FEMS Yeast Research，2003，4 :69-78)。但是新來源的木糖異構(gòu)酶是一種嗜溫性木糖異構(gòu)酶，最適酶活溫度在60°C (圖3)。


圖1 驗證重組細胞中含有木糖異構(gòu)酶基因RuXI。以反提重組酵母質(zhì)粒為模板，特異性引物 BamHI-GXI-F，SbfI-GXI-R(表 1)擴增 RuXI。M Marker，IkbDNA ladder 1 =RuXI ；圖2 驗證重組細胞中含有木糖異構(gòu)酶基因RuXI。將反提質(zhì)粒反轉(zhuǎn)到大腸桿菌 DH5a 中，提取質(zhì)粒，BamHI 和 Sbf I 雙酶切驗證結(jié)果。M :Marker，IkbDNA ladder 1 約 1. 3kb 為RuXI，約61Λ的為線性載體PJFE3 ；
圖3 釀酒酵母轉(zhuǎn)化子的新木糖異構(gòu)酶最適酶活溫度測定；圖4 釀酒酵母轉(zhuǎn)化子在含有20g/L葡萄糖、20g/L木糖作為碳源的培養(yǎng)基中的生長曲線；圖5 釀酒酵母轉(zhuǎn)化子在含有20g/L木糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中的生長曲線；圖6 釀酒酵母轉(zhuǎn)化子在含有20g/L木糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中的限氧乙醇發(fā)酵結(jié)果分析。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例1克隆來自牛瘤胃液宏基因組文庫的木糖異構(gòu)酶的DNA序列木糖異構(gòu)酶保守區(qū)域間的部分糖異構(gòu)酶的DNA序列的克隆以構(gòu)建好的牛瘤胃液宏基因組文庫為模板，以簡并引物XIcF和XIcR(表1)為引物，PCR擴增，得到大約400bp的片段，將清晰的條帶純化并連接到T載體上，任意挑取22個采用通用引物驗證的克隆送去測序。測序結(jié)果表明22個克隆的DNA插入片段的序列全屬于木糖異構(gòu)酶的特有序列。其中21個克隆的DNA插入片段的序列為大腸桿菌的木糖異構(gòu)酶基因保守序列，只有一個克隆的DNA插入片段屬于新來源的木糖異構(gòu)酶基因保守序列。該片段命名為2PXI-3，374bp。表1所用的引物序列
權(quán)利要求
1.一種編碼木糖異構(gòu)酶的核酸分子，其特征在于，其序列為以下核苷酸序列之一(1)SEQID NO. 1所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一個或多個核苷酸的具有至少40%序列一致性的同源序列；(3)在嚴格條件下，與(1)或O)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；(4)由于遺傳密碼子的簡并性區(qū)別于(3)的核苷酸序列的核苷酸序列。
2.一種木糖異構(gòu)酶，其特征在于，其序列為以下氨基酸序列之一(1)SEQID NO. 2所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一個或多個氨基酸的具有至少40%序列一致性的同源序列。
3.—種重組載體，其特征在于所述重組載體含有權(quán)利要求1所述的編碼木糖異構(gòu)酶的核酸分子的完整編碼閱讀框序列。
4.一種重組細胞，其特征在于所述宿主細胞為細菌、酵母或絲狀真菌，宿主細胞內(nèi)含有權(quán)利要求3所述的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組細胞，其特征在于所述宿主細胞包含一種遺傳修飾，該遺傳修飾降低非特異性醛糖還原酶活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組細胞，其特征在于所述宿主細胞包含一種或多種遺傳修飾，該遺傳修飾產(chǎn)生選自如下一組的特征(1)增加木糖轉(zhuǎn)運到宿主細胞內(nèi)；(2)木酮糖激酶活性增強；(3)戊糖磷酸途徑的流量增加；(4)對分解代謝物阻遏的敏感性降低；(5)對乙醇、滲透性或有機酸的耐受力增強；(6)副產(chǎn)物生成下降；(7)細胞電子鏈傳遞和氧化呼吸鏈阻斷。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組細胞，其特征在于所述遺傳修飾由過度表達內(nèi)源基因、 表達異源基因或其組合組成，且所述基因選自下列基因己糖或戊糖轉(zhuǎn)運蛋白基因、木酮糖激酶基因、來自戊糖磷酸途徑的酶的基因、糖酵解酶的基因或/和乙醇發(fā)酵相關(guān)的酶的基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求5、6或7所述的重組細胞，其特征在于所述宿主細胞表達一種或多種酶，所述的酶賦予宿主細胞產(chǎn)生乳酸、乙酸、琥珀酸、氨基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β 一內(nèi)酰胺抗生素或/和頭孢菌素的能力。
9.利用權(quán)利要求8所述的重組細胞生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其特征在于所述宿主細胞發(fā)酵含有木糖原料或/和葡萄糖原料的培養(yǎng)基，然后分離純化發(fā)酵產(chǎn)物，所述發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸、乙酸、琥珀酸、氨基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β —內(nèi)酰胺抗生素或/和頭孢菌素。
10.權(quán)利要求2所述的木糖異構(gòu)酶在燃料乙醇生產(chǎn)或高果糖漿生產(chǎn)中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了從牛瘤胃液宏基因組文庫中獲得的一種新的木糖異構(gòu)酶核苷酸序列，還提供了該核苷酸序列編碼的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及含有該核苷酸序列的載體及轉(zhuǎn)化體。當該木糖異構(gòu)酶被表達時，賦予宿主細胞將木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的能力，木酮糖進一步被宿主細胞代謝。因此，宿主細胞能夠以木糖作為碳源生長。新來源的木糖異構(gòu)酶在釀酒酵母內(nèi)高活性表達，且該酶為嗜溫性酶，最適酶活溫度為60℃。本發(fā)明還涉及木糖異構(gòu)酶可作為模式蛋白在理論研究上的應用，及在燃料乙醇、高果糖漿等實際生產(chǎn)上的應用。
文檔編號C12P7/20GK102174549SQ201110042170
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月22日
發(fā)明者沈煜, 葛瑞蕾, 鮑曉明 申請人:山東大學