專利名稱：一種纖維素酶及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種纖維素酶，特別涉及一種耐熱性纖維素酶，還涉及該纖維素酶的應用。
背景技術：
纖維素是植物細胞壁的主要組成成分，也是地球上主要生物質能(biomassenergy)的來源，因此，目前許多能 夠有效分解纖維素的酶蛋白在不同工業(yè)上的應用也十分廣泛。纖維素是以葡萄糖為單位，通過β-1，4_糖苷鍵(i3-l，4-glyC0SidiCb0nd)將葡萄糖分子連接而形成的長鏈多糖，這些多糖體共同組織排列成緊密的結晶型纖維素，進而抵抗外界的分解作用。然而，生物界中許多草食動物以及微生物等需要將植物細胞壁中的多糖纖維素分解成可以被體內吸收的葡萄單糖，以作為生存能量來源。例如，草食性瘤胃動物的腸胃道中存在著許多不同的共生微生物，包含細菌與真菌，而這些微生物通常通過不同種類的多糖分解酶，例如，纖維素酶或木聚糖酶等共同作用去分解植物細胞壁，進而產生可使動物體內吸收的單糖。纖維素酶的催化機制主要是通過酸堿反應，將連接兩個單糖的β-1，4_糖苷鍵進行水解作用，進而分解多糖纖維素。而纖維素酶基本上可分成三類，分別為內切葡聚糖酶(endo-glucanase)、外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase)以及葡萄糖苷酶(β-glucosidase)。內切葡聚糖酶能夠隨機地將長鏈纖維素切成許多小片段的寡糖；而外切葡聚糖酶則可從長鏈纖維素的還原端或非還原端進行分解，其主要產物為纖維二糖；葡萄糖苷酶則可把纖維二糖分解為單糖的葡萄糖。纖維素酶在工業(yè)上的應用十分廣泛，無論是在食品、飼料或紡織業(yè)，甚至可運用到現在最受關注的生物能源。針對不同工業(yè)的應用，纖維素酶也需有符合其不同的適用條件與范圍。例如，飼料工業(yè)上需要偏酸性以及耐溫性的纖維素酶，然而，紡織工業(yè)上則側重于偏堿性的纖維素酶。因此，能夠找出更加符合不同工業(yè)上所需的纖維素酶也是目前無論是學術或產業(yè)界都在努力的目標。目前在許多相關的研究中，為了得到更佳的酶，除了從自然界中篩選出來之外，就是將現有的酶蛋白加以改造。目前主要有兩大改造策略，其一是隨機突變或將酶基因隨機排列，在特定的作用條件下，篩選出更符合其作用條件的酶蛋白。此策略的好處是無須深入研究酶的結構或作用機制，而是直接在特定的條件下隨機去找出更好的酶蛋白。然而，其缺點是需要大量的人力以及時間去進行大量篩選或要有很好的大量篩選方法來配合。另一種改造策略則是通過研究酶結構與作用機制找出對于酶活性或特性具有關鍵性的氨基酸，并針對這些特定氨基酸進行突變并測試，進而得到功能性更強的改造酶蛋白。此優(yōu)點是不需花費時間與人力在大量突變與篩選的步驟，但需要先了解此酶的蛋白結構以及其作用機制，才能找出具有改造潛力的特定氨基酸。不同的工業(yè)制備流程需要符合其不同作用環(huán)境的酶蛋白來配合且參與。即使纖維素酶在工業(yè)上被廣泛應用已久，然而許多工業(yè)用纖維素酶是從嗜常溫菌，如里式木霉(Trichoderma reesei)所篩選出來的，因此耐熱性也較差。與此相反,耐熱性纖維素酶能夠有效地應用于需要高溫作用環(huán)境的產業(yè)上，例如，啤酒制造業(yè)或生物能源工業(yè)等。耐熱性的纖維素酶蛋白相對地其蛋白穩(wěn)定性也會較高，因此能夠在高溫環(huán)境中穩(wěn)定存在，甚至作用更好。因此，無論是在作用環(huán)境或是后期處理過程中，也不需擔心因為高溫而破壞了該酶蛋白本身。此外，提高該酶蛋白的活性也是改良工業(yè)酶的重點，酶活性越高就代表成本的下降以及利潤的提聞。因此，本發(fā)明通過改造基因而改良纖維素酶的活性，相對地減少制造成本，進而有效地提高耐熱性纖維素酶在工業(yè)上應用價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于改造現有的纖維素酶，通過結構分析的方法及點突變技術，有效地提高纖維素酶的作用活性，進而增加纖維素酶的產業(yè)價值，并大幅降低成本。為達到上述目的，本發(fā)明的一個實施方式是提供一種纖維素酶，其包含將野生型Cell2A纖維素酶原始蛋白(wild type Cell2Acellulase)第61位置的酪氨酸(Tyrosine)以另外一個氨基酸取代的突變的氨基酸序列，其中所述的用于取代的氨基酸選自苯丙氨酸(Phenylalanine)、丙氨酸(Alanine)或甘氨酸(Glycine)。


圖I為編碼野生型Cell2A纖維素酶的全長的核苷酸序列和由此推導的氨基酸序列。圖2A至圖2C為野生型Cell2A纖維素酶的三維蛋白立體結構及其與寡糖結合的復合體的三維立體結構。圖3為本發(fā)明定點突變所采用的引物。圖4為編碼突變型Cell2A/Y61F纖維素酶的全長的核苷酸序列和由此推導的氨基酸序列。圖5為編碼突變型Cell2A/Y61A纖維素酶的全長的核苷酸序列和由此推導的氨基酸序列。圖6為編碼突變型Cell2A/Y61G纖維素酶的全長的核苷酸序列和由此推導的氨基酸序列。圖7為野生型Cel 12A纖維素酶原始蛋白與其不同突變型纖維素酶的活性測定結果比較。圖8為野生型Cell2A纖維素酶原始蛋白與突變型Y61G的纖維素酶的最適作用溫度活性的比較分析。
具體實施方式

本發(fā)明的特征與優(yōu)點的實施例將在本文得以詳述。應該理解的是本發(fā)明在不同實施方式下會有各種變化，但是所述的變化并不脫離本發(fā)明的保護范圍，而且，其中的說明和附圖是在本質上對本發(fā)明加以說明，而并非限制本發(fā)明。
為了增加耐熱性纖維素酶的工業(yè)應用價值，本發(fā)明從耐高溫菌種之一的海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)篩選出Cell2A基因,其所表現的纖維素酶蛋白為一種葡聚糖酶(3-l，4-endoglucanase)，解析所述的纖維素酶蛋白的三維立體結構，再詳加分析此結構的活性區(qū)，并且將其中的關鍵性氨基酸突變成其他氨基酸，由此改造蛋白特性，進而提高所述的纖維素酶蛋白的作用活性。以下將詳述本發(fā)明改造纖維素酶蛋白的方法及由此方法得到的改良纖維素酶蛋白。首先，選擇海棲熱袍菌種來源的Cell2A基因(Genbank CAA93273)作為目標基因，如圖I所示的Cell2A纖維素蛋白的全長編碼區(qū)包含774個核苷酸序列(序列號I)和由其推導的257個氨基酸序列(序列號2)。利用限制酶XbaI和NdeI將Cell2A基因構建到pET16b載體中，并且在基因前端接上6個組氨酸(Histidine)以便于之后的純化。構建步驟中，聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)所用的引物為5' -GCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCCACCACCACCACCACCACATGGTACTGATGACAAAA-3'(正向引物)和 5' -GGAATTCCATATGTTATCATTCTCTCACCTCCAGATCAAT-3'(反向引物)。接著，將構建好的Cell2A pET16b質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞(competent cells)內，并由含有l(wèi)OOyg/mlAmpicillin的LB培養(yǎng)皿來篩選菌株。把菌株接種到5mlLB培養(yǎng)液中，再放大菌量至200ml LB培養(yǎng)，最終放大到6L的LB培養(yǎng)基中。在OD值到達
O.6至O. 8時，利用ImM的IPTG誘導而使該野生型Cell2A酶蛋白大量表達。然后，將菌液以6000rpm轉速離心10分鐘收集起來。利用超音波細胞粉碎機(sonicator)破菌,再以16000rpm離心30分鐘，并收集上清液用以準備下一步的純化。為了得到高純度的Cell2A酶蛋白，我們通過快速蛋白質液相層析色譜(fast protein liquid chromatography, FPLC)依序利用鎳離子層析柱以及DEAE陰離子交換柱分離出蛋白純度達95 %以上的Cel 12A酶蛋白，并以5mg/ml蛋白濃度在25mM Tris、150mM NaCl.pH 7. 5條件下保存于_80°C。為了利用X-ray結晶學技術解析出Cell2A的蛋白結構，首先通過蒸氣擴散法，在室溫下以座滴式(sitting drop method)進行養(yǎng)晶。利用不同的晶體篩選組來篩選養(yǎng)晶條件，并通過調整修正方法找出最佳的養(yǎng)晶條件，其為O. 2M Ammonium sulfate>25% w/vPEG3350、0. IM Bis_Tris、pH 5.5。另外，我們利用多重同形取代法(multipleisomorphousreplacement,MIR)解出相位角。當中，通過不同萊原子衍生物等與蛋白晶體同時浸泡后,將X-ray光源打在晶體上得到不同衍射圖譜，再經由計算機運算之后得出正確的相位角，進而解出Cell2A蛋白立體結構。此外，更進一步地將Cell2A蛋白晶體浸泡于含有IOmM纖維二糖或纖維四糖的溶液中，再利用X-ray獲得衍射圖譜，進而得出Cell2A與寡糖物質結合的復合體結構，以深入研究耐高溫纖維素酶Cell2A與其分解底物的作用機制。圖2A至圖2C表示本發(fā)明利用X-ray結晶學技術解析出Cell2A的三維蛋白立體結構及其與寡糖結合的復合體三維立體結構。Cell2A蛋白立體結構屬于瑞士卷形式折迭(β-jellyroll fold),主要由兩片β -折迭平板(β-sheet)所組成(如圖2A所示)。蛋白結構中的裂縫凹陷處是可容納底物(substrate)進入的活性區(qū)(如圖2B所示)，其中有兩個氨基酸，分別為第60位置的精氨酸(Arg60)和第61位置的酪氨酸(Tyr61)所組成的彎曲處比較特殊(如圖2C所示)，而且從Ramachandran plot中可看到Tyr61是采用一種一般蛋白結構不允許存在的角度，而且這兩個氨基酸都能與寡糖產生作用力，由此推測Tyr61的結構對酶活性有重大的意義，于是針對Tyr61進行定點突變(site-directedmutagenesis),以此找出比野生型Cell2A纖維素酶活性較高的突變蛋白。
為了得到特定氨基酸突變的酶蛋白，我們利用定點突變技術，首先進行聚合酶鏈式反應步驟，其中所用的突變引物列于圖3，其中Y61F指的是第61位點的酪氨酸突變成苯丙氨酸；Y61A是突變成丙氨酸；Y61G是突變成甘氨酸。接著加入限制酶DpnI于37°C下作用，將未突變的野生型模板去除。把限制酶DpnI處理后的質粒轉入至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，并通過測序確認突變成功的突變基因，圖4至圖6分別表示Cell2A/Y61F、Cell2A/Y61A和Cell2A/Y61G纖維素酶蛋白的核苷酸序列(序列號分別為3、5和7)與由其推導的氨基酸序列(序列號分別為4、6和8)。將突變成功的Cell2A基因轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞(competent cells)內，并且進行與如上所述的野生型Cell2A纖維素酶蛋白的相同的表達與純化步驟而分別得到Cell2A/Y61F、Cell2A/Y61A和Cell2A/Y61G纖維素酶蛋白。纖維素酶的活性測定方法主要是將1% β_葡聚糖與適當濃度的纖維素酶蛋白(緩沖液為O. IM醋酸鈉，pH 5. O)以I : I比例混合在一起，在85°C下作用10分鐘。接著加入I. 5倍體積的1% DNS于100°C沸水中作用5分鐘，以停止反應且呈色。在0D540波長測定吸光值，再換算成酶活性單位(unit)。其中，酶活性的標準曲線是由葡萄糖標準溶液0-0. 25mg/ml制定,而Iunit的定義為每分鐘釋放I μ mole產物所需的酶蛋白量。圖7表示野生型Cell2A纖維素酶(wild type Cell2A)原始蛋白與不同突變型的纖維素酶活性結果分析測定比較。活性檢測是將這些蛋白樣本調整為約150ng/ml的相等蛋白濃度，并以1% 葡聚糖做為底物，在85°C下反應10分鐘。圖中不同酶活性是以原始蛋白的酶活性作為100%的基準的條件下進行比較而得。統計分析是利用T-test的雙尾分析。在P < O. 05時判定為顯著性差異(*) ；P < O. 001時判定為顯著性差異(**)。圖中的誤差線是以測定的各種酶蛋白活性值的平均值的標準誤差(standard error of themean, SEM)來表示的。由分析結果可知，將Tyr61突變成苯丙氨酸(Y61F)、丙氨酸(Y61A)或甘氨酸(Y61G)的突變纖維素酶的比活性(unit/mg)都比野生型纖維素酶的比活性高，且都具有顯著性差異，其中最高的是將Tyr61突變成甘氨酸(Y61G)的纖維酶，其活性明顯地高于野生型纖維素酶活性將近兩倍。另外，為了分析各種酶蛋白的活性的最適溫度，將各種酶蛋白分別在55°C至100°C，以每5°C的間隔，在不同溫度下進行反應10分鐘，然后計算比活性。圖8表示野生型Cell2A纖維素酶原始蛋白與其突變型Y61G的最適作用溫度活性分析。檢測方法中，將兩者蛋白濃度均等為約150ng/ml,并以1% β _葡聚醣為底物(substrate),在不同作用溫度之下反應10分鐘。圖中的Y軸表示是以野生型Cell2A纖維素酶原始蛋白樣品在100°C作用溫度的活性作為100%，比較該兩者蛋白在不同作用溫度下的活性。圖中的誤差線是以測定的各種酶蛋白活性值的平均值的標準誤差來表示。由分析結果可知，野生型原始蛋白的作用與突變型Y61G酶蛋白的作用溫度趨勢沒有很大差異，而且Y61G的作用溫度適用范圍比野生型原始蛋白更寬，例如，70°C時的突變型Y61G作用的活性還有最適作用活性的一半，然而80°C時的野生型Cell2A的作用活性只剩最適作用活性的一半。由上述結果，將Cell2A中Tyr61突變成Glycine后，不僅能夠明顯地提高作用活性也有擴大作用溫度范圍的趨勢，而且最適作用溫度仍然維持在高溫95°C以上。為了驗證Y61G活性較高的結果是否能在工業(yè)常用的畢赤酵母表達系統中再現，本發(fā)明進一步將包含有野生型Cel 12A的酶蛋白的質 粒與包含有突變型Y61G的質粒分別轉化到畢赤酵母(Pichia pastoris)內表達,再檢測其細胞外酶活性。其方法詳述如下。首先，分別將編碼Cell2A與Cell2A/Y61G的突變基因利用限制酶EcoRI與NotI構建到PPICZ a A載體中，再利用限制酶PmeI把DNA質粒進行線性化后，通過電轉化方法將DNA質粒轉化到畢赤酵母內。接著將菌液涂布于含有100 μ g/ml zeocin抗生素的YPD培養(yǎng)皿于30°C下進行培養(yǎng)兩天。再挑選菌落并接種到5ml YPD的液體培養(yǎng)基中，在30°C下培養(yǎng)，再次接種到50ml BMGY中于30°C下培養(yǎng)過夜。接著，將培養(yǎng)基換成含有O. 5%甲醇的20mlBMMY以誘導蛋白表現，同樣培養(yǎng)于30°C下。每隔24小時取樣并補充O. 5%甲醇。此外，將取樣的菌液進行離心并收集上清液，按照如上所述的纖維素酶活性測定方法測定酶活性。結果發(fā)現，Y61G纖維素酶的活性顯著地高于野生型Cell2A將近兩倍。另外，在此真菌系統中兩者蛋白的表達量差異不大，因而可推測Y61G活性明顯地高于野生型蛋白而并非主要受底物蛋白量多少所影響，而其結果與在大腸桿菌系統中的一致。為了進一步地放大纖維素酶生產量，我們先將菌株接種到5mlYPD培養(yǎng)至過夜，接著放大到2L于30°C下培養(yǎng)之后，再次放大到含有19L發(fā)酵培養(yǎng)基(FBSM)的50L發(fā)酵槽內。畢赤酵母的發(fā)酵操作，基本上是參考Invitrogen公司的操作手冊。發(fā)酵過程中，會全程監(jiān)控溫度在30°C并通過添加氨水控制pH值在5. O左右，而溶氧的調控則通過進氣量以及轉速維持在40%以上。在分批培養(yǎng)(batchculture)后,添加50%甘油讓酵母生長到一定的菌量。再把甲醇以梯度遞加的方式加進發(fā)酵槽中，進而誘導酶蛋白表現。每隔12小時取樣一次并收集上清液，進而檢測纖維素酶的表達量與活性。結果發(fā)現，與野生型Cell2A酶蛋白同樣在50L發(fā)酵槽下所被誘導出來的活性相比，突變型Y61G酶蛋白的活性隨著誘導時間有增加趨勢，并且與野生型Cell2A活性的差異越來越大。而最大差距約在誘導120小時，Y61G活性可高于野生型Cel 12A將近兩倍。綜上所述，為了增加耐熱性纖維素酶的工業(yè)應用價值，本發(fā)明通過Cell2A纖維素酶蛋白的三維立體結構解析，從結構推測在氨基酸序列上第61位置的酪氨酸對此纖維素酶的活性有重大的意義，于是針對Tyr61進行定點突變成苯丙氨酸(Y61F)、丙氨酸(Y61A)或甘氨酸(Y61G)，結果發(fā)現Y61F、Y61A或Y61G三種突變蛋白皆能有效地提高纖維素酶的活性。其中，Y61G更能顯著性地提升酶活性至將近兩倍，并且也不會影響到酶本身的高溫作用特性，甚至有擴大作用溫度范圍的趨勢，進而增加了所述的纖維素酶的應用在不同工業(yè)上的價值。除了大腸桿菌表達系統外，在工業(yè)常用的畢赤酵母表達系統中，無論是在小量搖瓶或是大量生產的發(fā)酵技術上，皆能看到突變后的Y61G纖維素酶蛋白活性明顯高于野生型纖維素酶蛋白，而非單純只是酶蛋白產量的提高。因此，由于本發(fā)明提供的Y61F、Y61A及Y61G三種突變蛋白皆能有效地提升纖維素酶的作用活性，故能增進此纖維素酶的應用價值。尤其對于一些需要耐熱纖維素酶所參與的工業(yè)而言，更能大大地降低生產成本，因此與野生型的Cell2A相比，更有實際應用在產業(yè)上的潛力。再者，纖維素酶在工業(yè)上的應用十分廣泛，不論是在食品、飼料或紡織業(yè)，甚至可運用到現在最受關注的生物能源。在食品工業(yè)上，例如果汁生產方面，必須要藉由果膠酶分解水果中大量的果膠質，然而果膠質會與纖維素等其他物質共同存在。因此生產制備中，在待澄清的果汁內加入纖維素酶能夠幫助果膠酶的作用，進而提高果汁的澄清度。另外在啤酒制成方面，在糖化過程中加入纖維素酶能夠有效地分解大麥或小麥等主要原料，尤其制備中是在高溫條件下作用，故本發(fā)明的耐熱纖維素酶更能符合其需求。在飼料工業(yè)方面，將液體纖維素酶噴在麩皮類載體上，再與飼料一同拌混，便能幫助動物分解這些含有大量纖維素的飼料，進而促進動物腸道對于植物纖維素的消化與吸收。紡織工業(yè)上，纖維素酶主要可應用于紡織品后處理加工，而酶蛋白作用在紡織品的表面上，像是主要對于棉織品的生物拋光(biopolishing),能夠增加其光澤感與手感；還有針對牛仔布的生物石磨(biostoning)，能夠不均勻地消除染料，進而形成布料刷色等效果。另外，造紙工業(yè)對于纖維素酶的需求同樣傾向于耐高溫，其中酶的應用則可分為兩大方面其一是在制作紙漿過程中加入纖維素酶將木材等原料分解處理；另外則是在廢紙資源利用上的脫墨過程中加入纖維素酶能夠有效地將油墨去除。最后，在生物質能工業(yè)方面，由于在植物纖維原料的前處理過程是以高溫熱處理方式居多，因此耐熱纖維素酶能夠符合其需求。在糖化過程中加入纖維素酶能夠有效地將植物纖維素原料分解成可被微生物利用的單糖，讓特定的微生物能夠利用單糖進行發(fā)酵作用，以制造出大量的生物酒精。由此可知，纖維素酶能夠應用在許多不同的工業(yè)上。其中有些制備的條件是高溫環(huán)境，也是目前工業(yè)常用纖維素酶無法有效作用或是長期耐受的限制，凸顯了本發(fā)明耐熱性纖維素酶的優(yōu)勢，不但大幅增加酶蛋白的活性，更進一步地降低生產成本。故本發(fā)明所提出的耐熱性纖維素酶極具產業(yè)價值。
本發(fā)明可為熟知本領域技術人員做各種修飾，但修飾后的技術特征也落入本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種纖維素酶，其包含將序列號2的第61位置的酪氨酸用另外一個氨基酸取代的突變的氨基酸序列，其中所述取代的氨基酸選自苯丙氨酸、丙氨酸或甘氨酸。
2.如權利要求I所述的纖維素酶，其中編碼序列號2所表示的氨基酸序列的基因是來源于海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)的Cell2纖維素酶基因。
3.如權利要求I所述的纖維素酶，其中所述的酶是葡聚糖酶。
4.如如權利要求I所述的纖維素酶，其中所述的酶是耐熱性纖維素酶。
5.如權利要求I所述的纖維素酶，其中所述的纖維素酶具有序列號4的氨基酸序列。
6.如權利要求I所述的纖維素酶，其中所述的纖維素酶具有序列號6的氨基酸序列。
7.如權利要求I所述的纖維素酶，其中所述的纖維素酶具有序列號8的氨基酸序列。
8.一種編碼如權利要求I所述的纖維素酶的核酸分子。
9.一種重組質粒，其包含權利要求8所述的核酸分子。
10.如權利要求1-7中任意一項所述的纖維素酶在工業(yè)中的應用，其中所述的工業(yè)選自食品工業(yè)、飼料工業(yè)、紡織工業(yè)、造紙工業(yè)或生物質能工業(yè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種纖維素酶，其包括將Cel12A酶蛋白第61位置的酪氨酸以另外一個氨基酸取代的突變的氨基酸序列，其中所述的用于取代的氨基酸選自苯丙氨酸、丙氨酸或甘氨酸。該纖維素酶可用于食品工業(yè)、飼料工業(yè)、紡織工業(yè)、造紙工業(yè)或生物質能工業(yè)中。
文檔編號C12N15/56GK102643789SQ201110042600
公開日2012年8月22日 申請日期2011年2月17日 優(yōu)先權日2011年2月17日
發(fā)明者吳姿慧, 林正言, 賴惠琳, 鄭雅珊, 郭瑞庭, 黃建文 申請人:東莞泛亞太生物科技有限公司