專利名稱：一種混合營養(yǎng)無菌培養(yǎng)微藻快速積累油脂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藻類生物培養(yǎng)技術(shù)，尤其涉及一種混合營養(yǎng)培養(yǎng)小球藻快速生長并大量積累生物油脂的方法。
背景技術(shù)：
近年來，全球能源需求不斷擴大，尋求可以替代石油的可再生清潔能源是目前急需解決的重要問題。藻類具有光合作用效率高、環(huán)境適應(yīng)能力強、生長周期短、生物產(chǎn)量高、 油脂含量豐富的特點，因此藻類是制備生物油燃料的良好材料。但目前生產(chǎn)微藻生物燃料的主要問題是培養(yǎng)成本較高。只有首先解決快速生長和高油脂含量微藻品種的選育，優(yōu)化培養(yǎng)條件和工藝，改良大規(guī)模生產(chǎn)條件，提高目標(biāo)產(chǎn)物脂質(zhì)的高效分離才能有效降低生產(chǎn)成本。普通小球藻(Chlorella vulgaris)是一種可利用有機碳源異養(yǎng)培養(yǎng)的綠藻，生長速度比光照條件下快，類似于細菌的代謝生長，通過異養(yǎng)轉(zhuǎn)化可獲得高脂肪含量的異養(yǎng)小球藻。迄今為止大規(guī)模培養(yǎng)小球藻主要采用開放池式戶外培養(yǎng)系統(tǒng)以及各種半密閉和密閉培養(yǎng)系統(tǒng)，由于仍然采用光照自養(yǎng)方式，成本高，生產(chǎn)效率偏低。以有機物作為小球藻的唯一碳源進行異養(yǎng)培養(yǎng)，具有無需光照，細胞增殖快，濃度高，生產(chǎn)系統(tǒng)易于實現(xiàn)自動控制，可利用現(xiàn)有的發(fā)酵設(shè)備等優(yōu)點。但藻細胞異養(yǎng)生長的培養(yǎng)液極易染菌，目前發(fā)酵設(shè)備的通氣經(jīng)過濾膜簡單過濾裝置除菌，無法徹底除去空氣中的其他雜菌，且濾膜需要定期更換，成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種混合營養(yǎng)無菌培養(yǎng)高密度小球藻的方法和油脂提取方法，其制備過程為a.采用小球藻自養(yǎng)通氣培養(yǎng)獲得較高生物量在50mL改良SE液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)小球藻細胞，再逐步移至250mL，500mL，3000mL的三角瓶中無菌通氣擴大培養(yǎng)，溫度25 27°C，培養(yǎng)時間4-5天。其中，所述改良SE液體培養(yǎng)基成分為每IOOOmL培養(yǎng)基中含有NaNO3 0. 25g, CaCl2. 2H20 0. 025g, MgSO4 · 7H20 0. 075g, K2HPO4 0. 075g, KH2PO4 0. 175g, NaCl 0. 025g, FeCl3 · 6H20 0. 005g, Fe-EDTA 2mL, A5 微量元素混合液 lmL。其中，所述無菌通氣擴大培養(yǎng)方法為用磁力空氣壓縮泵通入的硫酸銅溶液除菌，再經(jīng)無菌水除去空氣中的微量硫酸銅成分，最后無菌空氣通入3000mL三角瓶提供細胞所需ω2及懸浮和攪拌。其中，所述通氣培養(yǎng)為磁力空氣壓縮泵通氣流量10-15L/min，培養(yǎng)溫度22 27°C，光照 120μπιο1 · πΓ2 · s-1。b.采用添加有機物的通氣異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻快速獲得油脂積累添加有機物為濃度40g/L的無菌葡萄糖溶液，并進行遮光通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22 27。C。
其中，所述無菌葡萄糖溶液經(jīng)80°C蒸汽壓力滅菌，滅菌時間20分鐘。其中，所述遮光通氣培養(yǎng)的通氣流量為20-25L/min。c.小球藻干藻粉采用堿催化的無水乙醚-石油醚方法提取油脂取適量小球藻藻粉于5mL離心管中，充分研磨后加入3mL無水乙醚-石油醚混合液，40°C條件下適當(dāng)振蕩浸提，加入10%的氫氧化鉀溶液靜止30min，將混合溶液4000rpm離心IOmin收集上清液于已恒重的離心管中，60°C水浴蒸去多余的溶劑，稱量并計算油脂含量。其中，所述無水乙醚-石油醚混合液的體積比為1 2。本發(fā)明提供的方法與現(xiàn)有技術(shù)方法相比的積極效果如下(1).所述混合營養(yǎng)無菌通氣培養(yǎng)小球藻方法，能有效除去通氣時帶入的病菌和其他微生物。通氣不僅提供細胞懸浮攪拌的作用，而且在培養(yǎng)過程中提供有效碳源，使小球藻在無機培養(yǎng)基中快速大量繁殖，此時小球藻迅速形成生長優(yōu)勢，也不利于雜菌生長。(2).所述第二階段添加少量葡萄糖進行小球藻異養(yǎng)暗培養(yǎng)，能迅速提高微藻油脂積累，藻細胞中油脂含量大大增加。通過混合營養(yǎng)無菌培養(yǎng)小球藻，每升藻液可得小球藻粉約為3. 77g。完全自養(yǎng)條件下培養(yǎng)得到的小球藻，每升藻液所得藻粉僅為0. 123g。(3).所述混合營養(yǎng)無菌通氣培養(yǎng)小球藻方法，培養(yǎng)液中藻細胞濃稠、顏色變黃， 藻細胞葉綠素消失，細胞體積增大，藻細胞中油脂含量大大增加，是自養(yǎng)條件下油脂含量的 4. 8倍。完全自養(yǎng)條件下培養(yǎng)得到的小球藻顏色深綠，細胞數(shù)量相對較多但油脂含量低。(4).由于微藻含有較高的葉綠素，所提取油脂顏色較深，需進行脫色處理，既增加成本，又損失油脂。所述堿催化的無水乙醚-石油醚方法提取小球藻藻粉油脂方法，提取的油脂含量高，色澤好，可以不用脫色處理。


圖1是本發(fā)明提供的混合營養(yǎng)無菌培養(yǎng)微藻快速積累油脂方法的一個實施例的方法流程圖。圖2是本發(fā)明提供的混合營養(yǎng)無菌培養(yǎng)微藻快速積累油脂方法的一個實施例的無菌通氣混合培養(yǎng)小球藻裝置示意圖。圖3是本發(fā)明提供的混合營養(yǎng)無菌培養(yǎng)微藻快速積累油脂方法的一個實施例的 3L小球藻培養(yǎng)圖。圖4是本發(fā)明提供的混合營養(yǎng)無菌培養(yǎng)微藻快速積累油脂方法的一個實施例的自養(yǎng)和混合營養(yǎng)條件下的細胞干重和油脂含量比較圖。圖5是本發(fā)明提供的混合營養(yǎng)無菌培養(yǎng)微藻快速積累油脂方法的一個實施例的不同提取方法所得油脂含量圖。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明提供的混合營養(yǎng)無菌培養(yǎng)微藻快速積累油脂方法的方法流程圖 (參考圖1)1.微藻第一段通氣自養(yǎng)培養(yǎng)方法為所述微藻可以從環(huán)境中分離，也可向國內(nèi)外藻種庫購買。本實施例以小球藻為例，在改良SE液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)小球藻細胞，溫度25 27°C，光照120μπιΟ1 · m_2 · s—1，培養(yǎng)時間4_5天。所述改良SE液體培養(yǎng)基成分特征為所述每 IOOOmL 培養(yǎng)基中含有 NaNO3 0. 25g, CaCl2. 2H20 0. 025g, MgSO4 · 7H20 0. 075g, K2HPO4 0. 075g, KH2PO4 0. 175g, NaCl 0. 025g, FeCl3 · 6H20 0. 005g, Fe-EDTA 2mL, A5 微量元素混合液 ImL。2.所述小球藻無菌通氣擴大培養(yǎng)方法為參考圖2所示，用磁力空氣壓縮泵通入1 %的硫酸銅溶液除菌，再經(jīng)無菌水除去空氣中的微量硫酸銅成分，最后無菌空氣通入 3000mL三角瓶提供細胞所需CO2及懸浮和攪拌，所述磁力空氣壓縮泵通氣流量10-15L/ min，培養(yǎng)溫度 22 27°C，光照 120 μ mol · πΓ2 · s—1。3.所述小球藻第二段添加有機物的通氣異養(yǎng)培養(yǎng)模式為添加有機物為無菌的 40g/L葡萄糖溶液，并進行遮光通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22 27°C。所述補加葡萄糖經(jīng)80°C蒸汽壓力滅菌，滅菌時間20分鐘，所述磁力空氣壓縮泵通氣流量20-25L/min。4.所述小球藻藻粉的制備通氣暗培養(yǎng)5天后，5500-7500rpm離心收集藻泥，-50°C冷凍干燥藻粉至恒重制得干藻粉。5.所述堿催化的有機溶劑混合液方法提取小球藻藻粉油脂方法為取適量小球藻藻粉于離心管中，充分研磨后加入適量無水乙醚-石油醚混合液，40°C條件下適當(dāng)振蕩浸提，加入10%的氫氧化鉀溶液，將混合溶液離心收集上清液，60°C水浴蒸去多余的溶劑， 稱量并計算油脂含量。所述無水乙醚-石油醚混合液的體積比為1 2。油脂百分含量用以下公式計算油脂含量(％ )=(總脂含量/藻細胞干重)X 100%。實施例2.本實施例一次混合營養(yǎng)無菌培養(yǎng)小球藻快速積累油脂的具體步驟如下1.小球藻第一段通氣自養(yǎng)培養(yǎng)方法步驟所述小球藻來自于環(huán)境并經(jīng)平板劃線分離純化。先在50m L改良SE液體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)藻細胞，培養(yǎng)4-5天后，將富集的藻細胞劃線于SE固體培養(yǎng)基的平板上，其中瓊脂量2.0%，培養(yǎng)溫度25 27°C，光照 120 μ mol · m_2 · s—1。2周左右固體平板上長出綠色的單個藻落，挑取單藻落在SE固體培養(yǎng)基平板反復(fù)進行劃線分離2次后，得到純藻種。所述改良SE液體培養(yǎng)基成分特征為所述每 IOOOmL 培養(yǎng)基中含有 NaNO3 0. 25g, CaCl2. 2H20 0. 025g, MgSO4 · 7H20 0. 075g, K2HPO4 0. 075g, KH2PO4 0. 175g, NaCl 0. 025g, FeCl3 · 6H20 0. 005g, Fe-EDTA 2mL, A5 微量元素混合液 ImL。2.所述小球藻無菌通氣擴大培養(yǎng)步驟為在50mL SE液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)純化好的小球藻細胞至對數(shù)生長期，細胞密度為1. 5-2. 5X108個/mL。按照10%接種量再逐步擴大至無菌的250mL，500mL三角瓶中光照振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度22 27°C，光照120μπιΟ1 ·πΓ2 · s—1。小球藻在3000mL三角瓶中采用無菌通氣培養(yǎng)，其步驟為用磁力空氣壓縮泵輸出空氣(參考圖2中|0所示)，將空氣通入的硫酸銅溶液除菌(參考圖2中所示)，再經(jīng)無菌水除去空氣中的微量硫酸銅成分(參考圖2中0所示)，最后無菌空氣通入3000mL三角瓶提供細胞所需(X)2及懸浮和攪拌(參考圖中0所示)，所述磁力空氣壓縮泵通氣流量15L/min，培養(yǎng)溫度22 27°C，光照120 μ mol · m_2 · s-1。3.所述小球藻第二段添加有機物的通氣異養(yǎng)培養(yǎng)步驟為自養(yǎng)通氣培養(yǎng)4天后， 向3000mL三角瓶中添加濃度為40g/L的葡萄糖溶液，所述補加葡萄糖經(jīng)80°C蒸汽壓力滅菌，滅菌時間20分鐘。添加葡萄糖溶液后進行遮光通氣培養(yǎng)，所述磁力空氣壓縮泵通氣流量25L/min，培養(yǎng)溫度27°C。所述小球藻第二段添加有機物的通氣異養(yǎng)后，藻細胞濃稠、顏色變黃，藻細胞葉綠素消失，細胞體積增大，藻細胞中油脂含量大大增加(參考圖3中所示)。而完全自養(yǎng)條件下培養(yǎng)得到的小球藻顏色深綠，細胞數(shù)量相對較多但油脂含量低(參考圖3中0，g，@所示)。4.所述小球藻藻粉的制備小球藻暗培養(yǎng)5天后，轉(zhuǎn)速7000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘收集藻泥于培養(yǎng)皿中，_50°C冷凍干燥藻粉至恒重制得干藻粉，藻粉干重為3. 77g/L，是自養(yǎng)條件下的30. 65倍(參考圖4)。5.所述堿催化的有機溶劑混合液方法提取小球藻油脂步驟為取0. 3g藻粉于5mL 離心管中，充分研磨，加入體積比為1 2的3mL無水乙醚-石油醚混合液，40°C水浴條件下萃取浸提，期間加入0.5mL濃度為10%的氫氧化鉀溶液適當(dāng)振蕩混勻。待池提取結(jié)束后，將混合溶液在4000轉(zhuǎn)/分鐘離心lOmin，收集上清液于已恒重的離心管中，于60°C水浴中迅速蒸去多余的溶劑，按照以下公式計算油脂含量油脂含量(％)=(總脂含量/藻細胞干重)X100%。本實施例方法所得小球藻油脂顏色呈清澈淡黃色(參考圖5中第2樣管)，油脂含量為51. 08%，是自養(yǎng)條件下油脂含量的4. 84倍。實施例3另取3份藻粉分別用氯仿-甲醇法、正己烷-乙醇法以及氫氧化鉀-甲醇法提取小球藻油脂，本實施例主要比較各方法的提取效果(參考圖5)。1.所述氫氧化鉀-甲醇法提取油脂步驟取0. 3g小球藻藻粉加入少許蒸餾水，-20°C下冷凍與40°C水中溶解5min，反復(fù)兩次。將凍融法處理的藻粉，加入4mL的IM氫氧化鉀-甲醇混合液，75°C水浴ΙΟπ η,ΜΛ ^iL正己烷，混勻，4000r/min離心lOmin，取上清液，加入正己烷洗滌殘渣，合并上清液，60°C揮發(fā)溶劑稱重，按照以下公式計算油脂含量: 總脂百分含量(％)=(總脂含量/藻細胞干重)X 100%。本實施例所述氫氧化鉀-甲醇法提取小球藻油脂顏色呈清澈淺綠色(參考圖5中第1樣管)，油脂含量為28. 57%。2.所述氯仿-甲醇法提取油脂步驟為取0.3g小球藻藻粉加入少許蒸餾水，-20°C下冷凍與40°C水中溶解5min，反復(fù)兩次。將凍融法處理的藻粉，加入體積比1 2 的3mL氯仿-甲醇混合液，充分震蕩2min，再加入ImL氯仿震蕩混勻，加1. 5mL蒸餾水， 4000r/min離心lOmin，取上清液加入等體積0. 1 %的氯化鈉溶液，混勻，4000r/min離心 lOmin，取上清液60°C揮發(fā)除去氯仿稱重，計算油脂含量。本實施例所述氯仿-甲醇法提取小球藻油脂顏色呈墨綠色(參考圖5中第3樣管)，油脂含量為46. 98%。3.所述正己烷-乙醇法提取油脂步驟取0.3g小球藻藻粉加入少許蒸餾水，-20°C下冷凍與40°C水中溶解5min，反復(fù)兩次。將凍融法處理的藻粉，加入體積比1 2 的3mL正己烷-乙醇混合液，以下提取步驟如本實施例中2所述各步驟。本實施例所述正己烷-乙醇法提取小球藻油脂顏色呈藍綠色(參考圖5中第4樣管)，油脂含量為19. 09%。
權(quán)利要求
1.一種混合營養(yǎng)無菌培養(yǎng)高密度小球藻的方法，該方法采用兩段式混合營養(yǎng)培養(yǎng)，即第一段采用小球藻通氣自養(yǎng)培養(yǎng)方法，第二段采用添加有機物的通氣異養(yǎng)培養(yǎng)模式。
2.—種小球藻干藻粉提取油脂的方法，該方法采用堿催化的無水乙醚-石油醚方法提取藻粉油脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述小球藻通氣自養(yǎng)培養(yǎng)方法，其特征在于在50mL改良SE液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)小球藻細胞，再逐步移至250mL，500mL，3000mL的三角瓶中無菌通氣擴大培養(yǎng)， 溫度25 27°C，培養(yǎng)時間4-5天。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述改良SE液體培養(yǎng)基，其成分特征在于所述每IOOOmL培養(yǎng)基中含有 NaNO3 0. 25g, CaCl2. 2H20 0. 025g, MgSO4 · 7H20 0. 075g, K2HPO4 0. 075g, KH2PO4O. 175g, NaCl 0. 025g, FeCl3 · 6H20 0. 005g, Fe-EDTA 2mL, A5 微量元素混合液 lmL。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述無菌通氣擴大培養(yǎng)方法，其特征在于用磁力空氣壓縮泵通入1 %的硫酸銅溶液除菌，再經(jīng)無菌水除去空氣中的微量硫酸銅成分，最后無菌空氣通入 3000mL三角瓶提供細胞所需CO2及懸浮和攪拌，所述磁力空氣壓縮泵通氣流量10-15L/ min，培養(yǎng)溫度 22 27°C，光照 120 μ mol · πΓ2 · s—1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述小球藻添加有機物的通氣異養(yǎng)培養(yǎng)模式，其特征在于所述小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)添加有機物為無菌的40g/L葡萄糖溶液，并進行遮光通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 22 27°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述小球藻通氣異養(yǎng)培養(yǎng)模式，其特征在于所述補加葡萄糖經(jīng) 80°C蒸汽壓力滅菌，滅菌時間20分鐘，所述磁力空氣壓縮泵通氣流量20-25L/min。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述堿催化的無水乙醚-石油醚方法提取小球藻藻粉油脂，其特征在于取0. 3g小球藻藻粉于5mL離心管中，充分研磨后加入3mL無水乙醚-石油醚混合液， 40°C條件下適當(dāng)振蕩浸提，加入10%的氫氧化鉀溶液靜止30min，將混合溶液4000rpm離心 IOmin收集上清液于已恒重的離心管中，60°C水浴蒸去多余的溶劑，稱量并計算油脂含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述堿催化的無水乙醚-石油醚提取小球藻藻粉油脂方法，其特征在于所述無水乙醚-石油醚混合液的體積比為1 2。
全文摘要
本發(fā)明涉及藻類生物培養(yǎng)技術(shù)，尤其涉及一種混合營養(yǎng)培養(yǎng)小球藻快速生長并大量積累生物油脂的方法。該方法采用兩段式培養(yǎng)，即第一段采用小球藻自養(yǎng)通氣培養(yǎng)獲得較高生物量，第二段采用添加有機物的通氣異養(yǎng)培養(yǎng)模式，改變小球藻的單純營養(yǎng)方式，在大量生物量基礎(chǔ)上快速積累油脂，同時采用新穎的空氣除菌方法有效解決培養(yǎng)液染菌問題，無需濾膜，降低了培養(yǎng)成本。藻粉油脂的提取采用堿催化的無水乙醚-石油醚提取方法。本發(fā)明的優(yōu)點為整個過程操作簡單，實驗和生產(chǎn)成本低，培養(yǎng)周期短，能迅速提高微藻油脂積累濃度，提取的油脂含量高，純度好，不用脫色處理。本發(fā)明適應(yīng)于實驗室或工業(yè)上制備微藻油脂，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/89GK102174409SQ20111004316
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月23日
發(fā)明者宋東輝, 朱義平, 楊國蘭 申請人:天津科技大學(xué)