專(zhuān)利名稱(chēng)：補(bǔ)體因子h基因型、載脂蛋白上氧化磷酸膽堿和血漿補(bǔ)體因子h定量測(cè)定試劑盒及測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及補(bǔ)體因子H(CFH)的基因型鑒定，CFH對(duì)氧化特異性抗原的結(jié)合，以及低密度脂蛋白(LDL)上氧化磷脂的檢測(cè)，并且通過(guò)以上檢測(cè)所得到的數(shù)據(jù)，對(duì)年齡相關(guān)性黃斑變性進(jìn)行預(yù)警性診斷和治療指導(dǎo)。具體涉及有關(guān)的定量檢測(cè)方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
全基因組研究(GWAS)促進(jìn)了復(fù)雜性狀疾?、欧肿踊A(chǔ)方面的研究。但是，對(duì)于疾病發(fā)病機(jī)制和遺傳變異相關(guān)性的研究仍不足。比如年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的發(fā)病機(jī)制與補(bǔ)體因子H基因(CFH)的相關(guān)性。AMD在老年致盲性眼病中占首位，世界各地大約有3000多萬(wàn)AMD患者。AMD患者視カ的嚴(yán)重?fù)p失大多是由于脈絡(luò)膜新生血管(CNV)出血及滲出，或濕性AMD。AMD發(fā)病機(jī)制與CFH基因復(fù)制有密切相關(guān)性。在CFH基因位點(diǎn)包含兩種常見(jiàn)患病風(fēng)險(xiǎn)單倍型即rsl0611170(Y402H)和rs2274700[2345678]。超過(guò)60% AMD患者據(jù)有這兩種風(fēng)險(xiǎn)單倍型標(biāo)簽。已有研究表明許多疾病與氧化損傷有夫，包括動(dòng)脈粥樣硬化，老年癡呆癥和AMD[9’101112]。視網(wǎng)膜感光細(xì)胞含有豐富的多不飽和脂肪酸磷脂，如卵磷脂(Ptc)，PtC易在氧化作用下被修飾或產(chǎn)生多種分解產(chǎn)物。例如，在氧化修飾作用下，Ptc的頭端——磷酸膽堿(PC)，會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化而暴露一氧化表位，這種結(jié)構(gòu)可被PC的自然抗體——T15識(shí)別(附圖I)。T15是天然免疫系統(tǒng)的一部分，它能識(shí)別某些細(xì)菌，如同肺炎球菌，細(xì)胞壁表面的PC并與之發(fā)生相互作用，，這種機(jī)制為保護(hù)宿主避免致命的感染[13]。T15 antibody通常不能結(jié)合正常細(xì)胞膜或脂蛋白上的PC結(jié)合。但是，當(dāng)發(fā)生氧化損傷之后，如氧化低密度脂蛋白(oxLDL)，被氧化的光感細(xì)胞外節(jié)(OS)或凋亡的細(xì)胞，其脂膜結(jié)構(gòu)中的PC，會(huì)發(fā)生構(gòu)像的改變，由先前的隱形狀態(tài)，改變?yōu)轱@性狀態(tài)。所以能夠被抗磷酸膽堿(PC)的自然抗體T15所識(shí)別與結(jié)合，從而達(dá)到清除氧化損傷結(jié)構(gòu)，維系機(jī)體平衡的功能。氧化反應(yīng)也會(huì)導(dǎo)致多不飽和脂肪酸側(cè)鏈的進(jìn)ー步氧化分解，并產(chǎn)生ー些高活性分子，如丙ニ醛(MDA)，這些活性中間體將進(jìn)ー步與蛋白質(zhì)和脂肪反應(yīng)而形成復(fù)合物。例如，MDA與こ醒反應(yīng)生成丙ニ酸-こ醒(MAA)并與蛋白質(zhì)或者脂質(zhì)相偶聯(lián)。這些與oxPC和MAA相關(guān)的結(jié)構(gòu)能夠刺激并引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[14’15]。兩者通過(guò)與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)和巨噬細(xì)胞表面受體——如CD36結(jié)合，激發(fā)下游級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)。因此，天然抗體不僅在機(jī)體抵抗細(xì)菌感染中起重要作用，在氧化損傷中也能保護(hù)細(xì)胞和分子結(jié)構(gòu)，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的，消除不健康的細(xì)胞；如清除凋亡細(xì)胞或光感受器的氧化光感受器外節(jié)。已有研究證明這些天然抗體所識(shí)別的靶位正是這些分子上的氧化表位，如oxPC，MDA和MAA的相關(guān)結(jié)構(gòu)[13 14]。鑒于先天免疫系統(tǒng)中天然抗體和補(bǔ)體共同形成機(jī)體防御系統(tǒng)，抵抗多種外源性致病因素的，如感染以及清除內(nèi)源性的氧化損傷；同時(shí)，在基因水平上，AMD發(fā)病與era具有較強(qiáng)的相關(guān)性。
脂蛋白是血漿膽固醇和甘油三酯的主要載體。低密度脂蛋白(LDL)是由磷脂、ApoB多肽鏈、膽固醇、甘油三酷、碳水化合物等組成的(附圖I)。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)低密度脂蛋白的氧化態(tài)變化與許多疾病有夫，如糖尿病、腎衰竭和驚厥前期。人們還發(fā)現(xiàn)氧化低密度脂蛋白與心血管疾病有密切的關(guān)系。例如，在動(dòng)脈壁中以及其他位點(diǎn)，LDL被氧化成氧化低密度脂蛋白(OxLDL)。OxLDL不再被正常細(xì)胞上的LDL受體識(shí)別，反而被巨噬細(xì)胞上的清道夫受體識(shí)別。使巨噬細(xì)胞攝取OxLDL不受調(diào)控，結(jié)果OxLDL中的脂類(lèi)(包括被氧化的脂類(lèi))就在巨噬細(xì)胞中越積越多直到巨噬細(xì)胞變?yōu)榕菽?xì)胞。據(jù)信這種泡沫細(xì)胞分泌各種導(dǎo)致血小板不穩(wěn)和血液凝結(jié)的因子。另外，這些泡沫細(xì)胞的死亡導(dǎo)致脂類(lèi)沉積并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。盡管目前人們已經(jīng)知道氧化損傷與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有一定的聯(lián)系，也針對(duì)OxLDL提出了一些檢測(cè)方法，但這些檢測(cè)方法都不能做到將OxLDL含量與氧化損傷的程度與疾病的程度直接聯(lián)系起來(lái)，因此其實(shí)用性不是很大。例如Young等(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，460，947)公開(kāi)了使用免疫分析方法檢測(cè)血清中ApoB的含量。但這種方法測(cè)定的是氧化和非氧化LDL之和,而不能將氧化的和非氧化的LDL區(qū)別開(kāi)。此外,LDL的氧化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其被氧化的程度目前尚沒(méi)有定量的標(biāo)準(zhǔn)。因此，用體外催化獲得的OxLDL來(lái)作為標(biāo)準(zhǔn)物，確定體內(nèi)產(chǎn)生的OxLDL，既缺乏堅(jiān)實(shí)的理論支持，又會(huì)造成毎次測(cè)量間的系統(tǒng)誤差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的ー個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于鑒定人組織樣本DNA中補(bǔ)體因子H基因型的試劑盒。該試劑盒包含下列成分a、從人組織樣本中提取DNA模板的試劑；b、用于從DNA模版中擴(kuò)增補(bǔ)體因子H基因片段的引物；包括補(bǔ)體因子H rs2274700基因型的擴(kuò)增引物對(duì)上游引物5’-CAGCCCCCACAAAAAGACTA-3’ (SEQ ID No I)；下游引物5，-TGCTTGTCTTTTTCTTATTCTCTTCC-3’(SEQ ID No 2)；和補(bǔ)體因子H rsl061170基因型的擴(kuò)增引物對(duì)上游引物5’-TTTTTGGATGTTTATGCAATCTT-3’ (SEQ ID No 3)；下游引物5’-GGATGCATCTGGGAGTAGGA-3’ (SEQ ID No 4)；以及C、用于對(duì)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷進(jìn)行基因型鑒定的引物序列，包括CFH rsl0611170基因型鑒定的引物序列5’-TTG TTA TGG TCC TTA GGA MA TGT TAT TTT CCT TAT TTG GAA AAT GGATA TAAT CAA AAT-3，(SEQ ID No 5)；CFH rs2274700基因型鑒定的引物序列5’ -ATC CTG ATG TTT CAC CAT CTG CTG TTA CAT ATC CTA GTT TGC ATT GATATTT-3，(SEQ ID No 6)。其中，上述的試劑盒種所述的人組織樣本為外周血樣本。本發(fā)明還提供了一種鑒定人組織樣本DNA中補(bǔ)體因子H基因型的方法，其特征在于該方法包括以下步驟a、從人組織樣本中提取和純化DNA模板；b、從DNA模板中擴(kuò)增補(bǔ)體因子H的基因片段，擴(kuò)增用引物包括
補(bǔ)體因子H rs2274700基因型的擴(kuò)增引物對(duì)上游引物5，-CAGCCCCCACAAAAAGACTA-3，；下游引物5，-TGCTTGTCTTTTTCTTATTCTCTTCC-3 ；和補(bǔ)體因子H rsl061170基因型的擴(kuò)增引物對(duì)
上游引物5’-TTTTTGGATGTTTATGCAATCTT-3 下游引物5，-GGATGCATCTGGGAGTAGGA-3，；C、使用基因型鑒定的引物序列對(duì)步驟b得到的補(bǔ)體因子H的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物測(cè)序進(jìn)行基因型SNP鑒定，如果其中保護(hù)性等位基因?yàn)榧兒献訕?biāo)記為T(mén)T ;其中如果致病性等位基因?yàn)榧兒献訕?biāo)記為CC ;其中如果保護(hù)性與致病性等位基因?yàn)殡s合子標(biāo)記為T(mén)C ；所述的基因型鑒定的引物序列包括CFH rsl0611170基因型鑒定的引物序列5’-TTG TTA TGG TCC TTA GGA MA TGT TAT TTT CCT TAT TTG GAA AAT GGATA TAAT CAA AAT-3，；CFH rs2274700基因型鑒定的引物序列5’ -ATC CTG ATG TTT CAC CAT CTG CTG TTA CAT ATC CTA GTT TGC ATT GATATTT-3，。本發(fā)明另外還提供了ー種定量檢測(cè)載脂蛋白B上氧化磷脂的試劑盒。該試劑盒包含下列成分a、抗載脂蛋白B抗體，用以將血漿中低密度脂蛋白俘獲；b、抗磷酸膽堿的抗體，用以與俘獲的含有氧化低密度脂蛋白的樣品接觸；其中，上述試劑盒中所述抗體的編碼基因含有S107VH重鏈可變區(qū)和V_kappa22VL輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明同時(shí)也提供了定量檢測(cè)載脂蛋白B上氧化磷脂的方法。該方法包括以下步驟a、用抗載脂蛋白B抗體將血漿中低密度脂蛋白俘獲；b、將抗磷酸膽堿的抗體與含有氧化低密度脂蛋白的樣品接觸；C、使所述抗體與氧化磷酸膽堿結(jié)合；d、測(cè)定所述抗體與氧化低密度脂蛋白的結(jié)合量。其中，上述方法中所述的抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體可變區(qū)片段中的任意ー種。其中，上述方法中所述的抗體的編碼基因含有S107VH重鏈可變區(qū)和V_kappa22VL輕鏈可變區(qū)。其中，上述方法中所述的含有氧化低密度脂蛋白樣品為血清、血漿、組織勻漿液或組織提取液。其中，上述方法中所述的步驟d可采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、生物素-親和素系統(tǒng)測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法中的至少ー種方法來(lái)所述抗體氧化低密度脂蛋白的結(jié)合量。其中，上述方法中還可包括步驟e，即根據(jù)以磷酸膽堿化合物為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定氧化低密度脂蛋白表面的氧化特異抗原決定簇的量。本發(fā)明還提供了ー種定量測(cè)定補(bǔ)體因子H(外周血或血漿中的補(bǔ)體因子H)與氧化特異性抗原結(jié)合的試劑盒。該試劑盒包含有氧化特異性抗原；抗補(bǔ)體因子H的抗體。所述的氧化特異性抗原為低密度脂蛋白上的氧化磷脂(oxPL on LDL oroxLDL)、丙ニ醛(MDA)與蛋白質(zhì)和脂肪反應(yīng)而形成復(fù)合物(MDA-LDL，MDA-BSA，etc)、MDA與こ醛反應(yīng)生成丙ニ酸-こ醒(MAA)并與蛋白質(zhì)或者脂質(zhì)反應(yīng)而形成復(fù)合物(MAA-LDL,MAA-BSA,etc)中的至少ー種。本發(fā)明還提供了ー種定量測(cè)定補(bǔ)體因子H與氧化特異性抗原結(jié)合的方法。該方法還包含下列操作步驟a、制備氧化特異性抗原；
b、包被氧化特異性抗原在微孔板上；C、將血漿中補(bǔ)體因子H與氧化特異性抗原結(jié)合；d、用抗補(bǔ)體因子H的抗體測(cè)定補(bǔ)體因子H與氧化特異性抗原的結(jié)合量。其中，上述方法中所述的抗補(bǔ)體因子H的抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體可變區(qū)片段中的任ー種。其中，上述方法中所述的抗體的編碼基因含有S107VH重鏈可變區(qū)和V_kappa22VL輕鏈可變區(qū)。其中，上述方法中所述的步驟d可采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、生物素-親和素系統(tǒng)測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法中的至少ー種方法來(lái)所述抗體氧化低密度脂蛋白的結(jié)合量。其中，上述方法中還包括步驟e，即根據(jù)純化CFH為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定CFH的定量，以及CFH與氧化特異性抗原結(jié)合量與CFH含量的比值。根據(jù)本法明的第一個(gè)方面，我們的研究發(fā)現(xiàn)有兩種基因型的CFH與年齡相關(guān)性黃斑變性，我們分別以單獨(dú)和組合的方式檢測(cè)每ー種疾病單倍型。通過(guò)我們建立的計(jì)算公式，我們可以推斷出AMD發(fā)病的幾率。本發(fā)明試劑盒的使用包括下列的步驟和材料。a)外周血基因組DNA作為測(cè)定模版的制備；b)基因型鑒定引物的制備；c)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物片斷的基因型鑒定序列。本發(fā)明中外周血基因組DNA的提取與純化，可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的生物工程方法制備，我們建議使用Qiagen公司的血液DNA純化試劑盒。測(cè)定模版的制備的方法為10XNEB Buffer IuldNTP(IOuM) 0. 25ulPrimer-F (IOuM) 0. 25ulPrimer-R(IOuM) 0. 25ulNEB Taq(5U/ul) 0. 05ulDNA(25-50ng/ul) 1-1. 5ulH20補(bǔ)充至 IOul
PCR 95 度 5min95 度 30s58 度3Os，72 度 30s 30-32cycle72 度 5min跑膠驗(yàn)證PCR是否成功 本發(fā)明中DNA模版制備的引物為CFH rs2274700 基因型上游引物5’-CAGCCCCCACAAAAAGACTA-3’ (SEQ ID No I)下游引物5，-TGCTTGTCTTTTTCTTATTCTCTTCC-3’(SEQ ID No 2)；CFH :rsl061170 基因型上游引物5，-TTTTTGGATGTTTATGCAATCTT-3J(SEQ ID No 3)下游引物5，-GGATGCATCTGGGAGTAGGA-3，(SEQ ID No 4)；本發(fā)明中SNPs測(cè)定的反應(yīng)為SNaPShot mix 0. 5 U IPurified PCR mix IulSnapShot primer (n)0.2 U I X nH2O to Total 5 U I96°C IOsec50°C 5sec60°C 30sec25cycles本發(fā)明中所采用的基因型(SNP)鑒定的引物為CFH rsl0611170 基因型鑒定的引物序列60-Forward_C/T5’-TTG TTA TGG TCC TTA GGA MA TGT TAT TTT CCT TAT TTG GAA AAT GGATA TAAT CAAAAT-3，(SEQ ID No 5)CFH rs2274700 基因型鑒定的引物序列52-Forward_A/G5’ -ATC CTG ATG TTT CAC CAT CTG CTG TTA CAT ATC CTA GTT TGC ATT GATATTT-3，(SEQ ID No 6)本發(fā)明中DNA擴(kuò)增產(chǎn)物片斷的基因型鑒定序列，我們采用(但不限制干)ABI3100XL分析儀(ABI，F(xiàn)oster City, CA,USA)根據(jù)說(shuō)明進(jìn)行基因分型。所有的SNPs進(jìn)行基因分型的成功率> 99. 9%，準(zhǔn)確度> 99%，由20%隨機(jī)重排序列判斷。CFH rs2274700保護(hù)性基因型(T)的鑒定序列為(SEQ ID No 7)ATAOXiACTTTATGAGAATATCTATATAATTTATACATCTATTAATTATAAAAACTAAAGATAAGTAATATTGMTATTGATATTTCmTTGTGCMACCTTTGTTAGTMCTTTAGTTOGTCTTCAGTTATACATTATTTTTGGATGTTTATGCMTCTTATTTMATATTGTMMATMTTGTMTATACTATTTTGAGCAMTTTATGTTTCTCATTTACTTTATTTATTTATCATTGTTATGGTCCTTAGGMMTGTTATTTTCCTTATTTGG
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其中如果保護(hù)性等位基因?yàn)榧兒献訕?biāo)記為(TT)；其中如果致病性等位基因?yàn)榧兒献訕?biāo)記為(CC)；其中如果保護(hù)性/致病性等位基因?yàn)殡s合子標(biāo)記為(TC)。根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，我們研究發(fā)現(xiàn)低密度脂蛋白經(jīng)氧化修飾后表面呈現(xiàn)與游離狀磷酸膽堿(PC)的抗原決定簇ー樣的抗原決定簇，或稱(chēng)表位結(jié)構(gòu)。因此，抗磷酸膽堿抗體只能與氧化低密度脂蛋白(OxLDL)結(jié)合，而不與未經(jīng)氧化的低密度脂蛋白結(jié)合，并且結(jié)合的量與低密度脂蛋白氧化的程度成正比。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)這種PC表位在載脂蛋白B 呈現(xiàn)的量與era致病性基因型相關(guān)，這種抗磷酸膽堿的抗體與血漿載脂蛋白B上PC表位結(jié)合的量在純合子CFH rsl0611170致病性基因型(CC)為最高；在保護(hù)性/致病性等位基因?yàn)殡s合子(TC)為次高；在保護(hù)性等位基因?yàn)榧兒献?TT)最低。(參見(jiàn)附圖2A)。因此，本發(fā)明提供了抗磷酸膽堿的抗體的新應(yīng)用，即通過(guò)抗原抗體的特異反應(yīng)定量檢測(cè)出樣品中載脂蛋白B上PC表位的含量用于檢測(cè)人體內(nèi)氧化損傷的程度。井根據(jù)該含量可判斷出AMD的發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。故本發(fā)明提供了一整套定量檢測(cè)載脂蛋白B上PC表位的試劑和操作方法，其包括下列步驟a)用抗載脂蛋白B抗體將血漿中低密度脂蛋白俘獲；b)將抗磷酸膽堿的抗體與含有氧化低密度脂蛋白的樣品接觸；c)使所述抗體與氧化磷酸膽堿結(jié)合；d)測(cè)定所述抗體與氧化磷酸膽堿的結(jié)合量。在本發(fā)明的方法中，所述抗載脂蛋白B抗體和抗磷酸膽堿的抗體可從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)也可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的生物工程方法制備。例如，購(gòu)自Sigma化學(xué)公司的Anti-humanApoB(LDL)和TEPC15即可用做本發(fā)明方法中的抗體。此外，可以用常規(guī)免疫學(xué)方法制備抗載脂蛋白B抗體(即用純化人載脂蛋白B注射山羊制備抗血清純化IgG的方法)，或者用生物工程方法制備抗磷酸膽堿的抗體，優(yōu)選編碼所述抗磷酸膽堿的抗體的基因含有S107 VH重鏈可變區(qū)和V-kappa 22VL輕鏈可變區(qū)。有關(guān)這方面的具體內(nèi)容，可麥見(jiàn)又獻(xiàn)(Shaw, et al. :Natural antibodieswith the T15 idiotype may act inatherosclerosis, apoptotic clearance，andprotective immunity. J.し丄in. Invest. 105 1731-1740 (2000)13。這些抗體可以是選自抗磷酸膽堿單克隆抗體、抗磷酸膽堿多克隆抗體或單鏈抗體可變區(qū)片段。如 TEPC15 (見(jiàn)文獻(xiàn)Moragan G,Berek C,Miller JF. An idiotypicdetermmantformed by both immunoglobulin constant and variable regions. Nature1983 ；301 (5902) :720-2)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“磷酸膽堿”(Phosphocholine)指的是磷脂酰膽堿(卵磷脂)的兩條脂肪酸尾巴被去掉后所余下的結(jié)構(gòu)部分。本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)任何含有帶PC表位的氧化低密度脂蛋白的生物樣品。所述樣品優(yōu)選為血清、血漿、組織勻漿液、組織提取液，最優(yōu)選為血清。本發(fā)明的方法基于抗原抗體間反應(yīng)的特異性和標(biāo)記物檢測(cè)的靈敏性，是ー種免疫標(biāo)記測(cè)定方法。即采用酶、熒光劑、放射性同位素、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)行抗原抗體間的特異性反應(yīng)，從而能定量檢測(cè)抗體或抗原的量。其中將抗原特異性抗體標(biāo)記后進(jìn)行檢測(cè)的方法是直接法，采用標(biāo)記的第二抗體對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行放大的方法為間接法。因此，在本發(fā)明的方法中，步驟(d)可采用直接化學(xué)發(fā)光免疫分析法、間接化學(xué)發(fā)光免疫分析法、直接放射免疫測(cè)定法、間接放射免疫測(cè)定法、直接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、直接生物素-親和素系統(tǒng)測(cè)定法、間接生物素-親和素系統(tǒng)測(cè)定法中的任ー種來(lái)完成。而上述這些直接法和間接法又分別可進(jìn)一歩地分為夾心法和非夾心法。雙抗體夾心法可如 下完成先將抗磷酸膽堿抗體固定在固相載體上，加入含有氧化低密度脂蛋白的樣品，使二者接觸，再加入抗ApoB抗體(或稱(chēng)抗LDL抗體，Sigma)，使之與氧化低密度脂蛋白接觸，測(cè)定抗ApoB抗體的量而定量氧化低密度脂蛋白的含量?；蛘?，先將抗ApoB抗體固定在固相載體上，加入含有氧化低密度脂蛋白的樣品，使二者接觸，再加入抗磷酸膽堿抗體，使之與氧化低密度脂蛋白接觸，測(cè)定抗磷酸膽堿抗體的量而定量氧化低密度脂蛋白的含量。非夾心法可如下完成先用含有氧化低密度脂蛋白的樣品包被固相載體，再加入抗磷酸膽堿的第一抗體，使之與氧化低密度脂蛋白接觸(如有必要還可進(jìn)ー步加入抗磷酸膽堿抗體的第二抗體，使之抗磷酸膽堿的第一抗體接觸并結(jié)合)，然后測(cè)定抗磷酸膽堿抗體的量而定量氧化低密度脂蛋白的含量。為了避免人為操作、試劑盒不同批次和試驗(yàn)儀器不同而導(dǎo)致的誤差，在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選還包括步驟(e)以磷酸膽堿化合物為標(biāo)準(zhǔn)品制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，井根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。所測(cè)得的結(jié)合量所代表的載脂蛋白B表面的氧化特異抗原的量。即，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出単位數(shù)量的ApoB中所呈現(xiàn)的PC表位的含量，從而確定低密度脂蛋白在體內(nèi)被氧化的程度。各種磷酸膽堿化合物均可用做在步驟(d)中所用的磷酸膽堿化合物，例如但不限于磷酸膽堿、氯化磷酸膽堿、こ?；姿崮憠A、與血清白蛋白或匙孔血藍(lán)素偶聯(lián)的磷酸膽堿、與血清白蛋白或匙孔血藍(lán)素偶聯(lián)的磷酸膽堿、氯化磷酸膽堿或こ?；姿崮憠A。根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，我們研究發(fā)現(xiàn)鑒于先天免疫系統(tǒng)中天然抗體和補(bǔ)體共同形成機(jī)體防御系統(tǒng)，抵抗多種外源性致病因素的，如感染以及清除內(nèi)源性的氧化損傷；同時(shí)，在基因水平上，AMD發(fā)病與CFH具有較強(qiáng)的相關(guān)性。我們的研究驗(yàn)證這種假說(shuō)——即WH可能與具有氧化特異性的分子抗原表位，如oxPC、MAA相結(jié)合，從而對(duì)由此引發(fā)的炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)并控制AMD的進(jìn)程。故本發(fā)明據(jù)此提供了一整套定量測(cè)定血與氧化特異性抗原結(jié)合的試劑和操作方法，其包括下列步驟a)氧化特異性抗原的制備；b)氧化特異性抗原在微孔板的包被；c)血漿中CFH與氧化特異性抗原的結(jié)合；d)用抗CFH抗體測(cè)定CFH與氧化特異性抗原的結(jié)合量。本發(fā)明所使用的氧化特異性抗原包括(但不限制于)低密度脂蛋白上的氧化磷脂(oxPL on LDL or oxLDL)；丙ニ醛(MDA)與蛋白質(zhì)和脂肪反應(yīng)而形成復(fù)合物(MDA-LDL，MDA-BSA，etc)；MDA與こ醛反應(yīng)生成丙ニ醛-こ醛(MAA)并與蛋白質(zhì)或者脂質(zhì)反應(yīng)而形成復(fù)合物(MAA-LDL, MAA-BSA, etc)。這些抗原的制備或已有文獻(xiàn)表述，但在本發(fā)明的試劑中將其標(biāo)準(zhǔn)化。其中LDL用正常志愿者所捐獻(xiàn)的血漿，通過(guò)分部離心法分離制備得到_。天然LDL保存在含有0. 27mMEDTA的磷酸緩沖液(PBS)中，4°C保存，2周內(nèi)使用。將LDL(lmg/mL)加入IOy M的硫酸銅，37°C孵化18小時(shí)，得到OxLDL。MDA-LDL用由1，1，3，3-四甲丙醚，新鮮制成的MDA加入LDL而得到。MAA-LDL 由新鮮制備的 MDA 和こ醛(LDL/MDA/AA = lmg/50 u mol/100 u mol)在 pH
5.0和37°C 4小時(shí)的條件下合成。這些氧化特異性抗原的特異性必須用兩種抗體檢測(cè)后方可使用TEPC15 (Sigma)與Anti-MDA-OxLDL(Abeam Cat #abl7354)。天然LDL必須不能夠 被兩種抗體的任何一種結(jié)合；用于氧化磷脂的OxLDL只能夠被TEPC15結(jié)合而不能夠被Anti-MDA-OxLDL結(jié)合；MDA-LDL，MDA-BSA，MAA-LDL,或者 MAA-BSA 只能夠被 Anti-MDA-OxLDL 結(jié)合而不能夠被TEPC15結(jié)合。(見(jiàn)附圖3)如有交叉結(jié)合，則不能夠使用。本發(fā)明上述b)中，需將氧化特異性抗原溶解于含有0. 27mM EDTA的磷酸緩沖液(PBS)中，先將抗原(5iig/ml，溶于PBS中)包被于微孔酶標(biāo)板，置于4°C過(guò)夜。將血漿I 100稀釋(與MAA-LDL結(jié)合I : 1000稀釋)后加入微孔板中，然后用生物素標(biāo)記抗-CFH作為第一抗體，并用堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的第二抗體來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。將所得數(shù)據(jù)中每個(gè)相同稀釋倍數(shù)的血漿樣品中CFH的量作為標(biāo)準(zhǔn)，用于修正該樣品CFH與抗原結(jié)合的的絕對(duì)值，而得到CFH與抗原結(jié)合的的百分比。本發(fā)明的方法基于抗原抗體間反應(yīng)的特異性和標(biāo)記物檢測(cè)的靈敏性，是ー種免疫標(biāo)記測(cè)定方法。即采用酶、熒光劑、放射性同位素、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)行抗原抗體間的特異性反應(yīng)，從而能定量檢測(cè)抗體或抗原的量。其中將抗原特異性抗體標(biāo)記后進(jìn)行檢測(cè)的方法是直接法，采用標(biāo)記的第二抗體對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行放大的方法為間接法。因此，在本發(fā)明的方法中，步驟(d)可采用直接化學(xué)發(fā)光免疫分析法、間接化學(xué)發(fā)光免疫分析法、直接放射免疫測(cè)定法、間接放射免疫測(cè)定法、直接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、直接生物素-親和素系統(tǒng)測(cè)定法、間接生物素-親和素系統(tǒng)測(cè)定法中的任ー種來(lái)完成。


附圖I l_a表示低密度脂蛋白的結(jié)構(gòu)，TEPC15的氧化特異性抗原決定族。l_b表示氧化磷脂上的磷酸膽堿(圏內(nèi)部分)。附圖2(A)血漿中CFH與氧化特異性抗原的結(jié)合。⑶和(C)不同基因型的CFH，包括其 rsl0611170(Y402H) /rs2274700 為 CC/CC(19 例)，TT/CC(13 例)和 TT/TT 型(16 例)的組合，與OxLDL(B)或者M(jìn)AA-LDL(C)都有具有非常明顯差異的不同結(jié)合。所得值由相同稀釋度血漿樣品中CHU賣(mài)數(shù)進(jìn)行調(diào)整，取其百分百。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)光単位(RLU)/100毫秒，平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。附圖3 T15和抗MAA/MDA-LDL (Abeam Cat#abl7354)與LDL上的氧化抗原表位結(jié)合，但不結(jié)合天然的(未修飾的)LDL，數(shù)據(jù)記錄方式——相對(duì)光單位(RLU)/100毫秒，取重復(fù)測(cè)量三次的平均值。
附圖4(4_a)不同基因型的CFH的血漿的oxPL/載脂蛋白B水平(用RLU相當(dāng)光単位表示)。(4-b)相對(duì)基因型血漿CFH與氧化特異性抗原的結(jié)合。附圖5. CFH rsl0611170 基因型的鑒定圖譜。5_a 為 IT，5_b 為 CT，5_c 為 CC.
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I CFH基因型的鑒定。外周血基因組DNA的提取采用Qiagen的方法。a)基因型鑒定模版用PCR法制備體系如下10XNEB Buffer IuldNTP(IOuM) 0. 25ulPrimer-F (IOuM) 0. 25ulPrimer-R(IOuM) 0. 25ulNEB Taq(5U/ul) 0. 05ulDNA(25-50ng/ul) 1-1. 5ulH20補(bǔ)充至 IOulDNA模版制備的引物為CFH rs2274700 基因型Primer-F CAGCCCCCACAAAAAGACTAPrimer-R TGCTTGTCTTTTTCTTATTCTCTTCCCFH :rsl061170 基因型Primer-F TTTTTGGATGTTTATGCAATCTTPrimer-R GGATGCATCTGGGAGTAGGAPCR 條件95 度 5min95 度 30s58 度 30s，72 度 30s 30-32cycle72 度 5min跑膠驗(yàn)證PCR是否成功PCR產(chǎn)物純化這時(shí)的體系要看做幾個(gè)snp，如果只做ー個(gè)，就PCR產(chǎn)物都純化。如果要做幾個(gè)snp在ー個(gè)體系里的，就要每個(gè)PCR產(chǎn)物加不同的量進(jìn)行純化。具體情況要根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。PCR (n) 8-9 illSAP 2 u l(lU/u I)ExoI I u I (lU/u I)Total 11-12 u I37 °C Ih75 °C 15min
lcycleb) SNaPShot 反應(yīng)系統(tǒng)SNaPShot mix 0. 5 U IPurified PCR mix I u ISnapShot primer (n)0.2 U I X nH20 to Total 5 U I96°C IOsec50°C 5sec60°C 30sec25cycles這里的n就是,如果是I個(gè)snp,就是I,如果幾個(gè)snp —起做,就要姆個(gè)primer都要加。這樣體系有所不同。SNaPShot產(chǎn)物的純化Iul SAP per well37 °C Ih75 °C 15minlcycleSNaPShot產(chǎn)物的變性Product IulHiDi 7u I95 °C 5minIce chill immediatelyc)上ABI sequencer測(cè)序儀進(jìn)行操作結(jié)果的讀取，是根據(jù)snp的原理，我們?cè)O(shè)計(jì)的引物長(zhǎng)度和所帶熒光不同而讀取。比如rsl061170，是C還是T，我們就在圖里面，根據(jù)顏色不同區(qū)分。如果是ー個(gè)黑峰，就讀CC，如果是ー個(gè)紅峰，就讀TT，或者是2個(gè)峰，讀成CT (附圖5)。實(shí)施例2酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定載脂蛋白B上的氧化磷脂
采用雙抗體法測(cè)定血清樣品中ApoB上的氧化特異性抗原OxPC。材料MicroFluor微滴板，山羊抗人源ApoB抗體，PBS,檢測(cè)樣本，BSA, TEPCl5,喊性憐酸酶(AP)標(biāo)記的抗 TEPC15 第二抗體，LumiPhos 530 (Lumigen Inc.，Southfield,Michigan, USA), Glomax 亮度計(jì)(Promega),磷酸膽堿(PC)化合物。方法用俘獲抗體，即抗ApoB抗體包被MicroFluor微滴板的孔。這些抗體可以是選自單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體。用PBS洗滌孔三次，然后將檢測(cè)樣本-血漿用含I % BSA的PBS (BSA-PBS)稀釋(I 50至I 1000)后，加入微滴板的孔。室溫孵育20-60分鐘，優(yōu)選50分鐘。用PBS洗滌孔三次，將BSA-PBS稀釋的第一抗體TEPC15加入孔中，并于室溫下溫育。用PBS洗滌孔三次。加入堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的抗TEPC15第二抗體。用PBS洗滌孔三次后，接著用水漂洗，并加入LumiPhos 530溶液。使用Glomax亮度計(jì)以相對(duì)光単位(RLU)測(cè)定光發(fā)射。同時(shí)以已知濃度的磷酸膽堿(PC-Cl)化合物連續(xù)10倍梯度稀釋后包被孔，以BSA-PBS稀釋的第一抗體TEPC15加入孔中，并于室溫下溫育。用PBS洗滌孔三次。加入堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的抗TEPC15第二抗體。接著用水漂洗，并加入LumiPhos530溶液，測(cè)定RLU，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的測(cè)定值查找出OxPC氧化表位的含量。我們用此法測(cè)定了血漿中OxPL/ApoB的值并且發(fā)現(xiàn)了他們與CFH基因型的反向相關(guān)。我們對(duì)AMD病人血漿中OxPL/apoB的測(cè)定表明，其OxPL/apoB值與該病人的CFH基因型相關(guān)。由于CFH疾病型單倍體I (Y402H)是最主要的疾病型單倍體，我們的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，具有CFH風(fēng)險(xiǎn)型Y402H基因型(CC)的血漿的oxPL/載脂蛋白B水平(用RLU相當(dāng)光單位表示)，高于具有CFH保護(hù)型Y402H基因型(TT)的血漿(CC型為46006±2333 Vs. CT型為40806±1363，P 值為 0. 018 ；Vs. TT 型為 34706±1929，P 值為 0. 00027，RLU土標(biāo)準(zhǔn)差)(見(jiàn)附圖4)。這表明CFH與oxPL的親和カ與血漿oxPL的水平呈反向相關(guān)。這可以解釋為CFH與OxPL的結(jié)合，降低了血液中氧化損傷的整體狀態(tài)。 實(shí)施例3酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定CFH與氧化特異性抗原的結(jié)合材料MicroFluor微滴板，氧化特異性抗原，PBS,檢測(cè)樣本，BSA,抗CFH抗體，喊性憐酸酶(AP)標(biāo)記的抗 CFH 第二抗體，LumiPhos 530 (Lumigen Inc. , Southfield,Michigan, USA), Glomax 亮度計(jì)(Promega)。方法用氧化特異性抗原，包括天然LDL(作為陰性對(duì)照)，OxLDL，MDA-LDL，MAA-LDL以2微克/毫升稀釋于PBS，加入每孔50微升包被MicroFluor微滴板的孔。用PBS洗滌孔三次，然后將檢測(cè)樣本-血漿用含I % BSA的PBS(BSA-PBS)稀釋(I 50至I 1000)后，加入微滴板的孔。室溫孵育20-60分鐘，優(yōu)選50分鐘。用PBS洗滌孔三次，加入生物素標(biāo)記的抗CFH抗體。用PBS洗滌孔三次，加入堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的Neutravdin第二抗體。用PBS洗滌孔三次后，接著用水漂洗，并加入LumiPhos 530溶液。使用Glomax亮度計(jì)以相對(duì)光単位(RLU)測(cè)定光發(fā)射。實(shí)驗(yàn)觀察到，CFH與OxLDL，MDA-LDL和MAA-LDL有較強(qiáng)的結(jié)合力。將血漿(含CFH) I 100稀釋后，其中的CFH會(huì)與與吸附在微孔板上的抗原相結(jié)合，CFH與未氧化-LDL,0x-LDL,MDA-LDL 和 MAA-LDL 的結(jié)合力分別為 7. 9±0. 19，19. 9±0. 80,37. 7±1. 60和102. 4± 1.44(平均值土標(biāo)準(zhǔn)差)，均具有顯著差異性(AN0VA統(tǒng)計(jì)結(jié)果N = 70，P =
6.4xE-164)(圖 2A)。由于有兩種主要類(lèi)型AMD疾病單倍型與CFH有夫，我們分別以單獨(dú)和組合的方式檢測(cè)每ー種疾病單倍型的結(jié)合力。純合rsl0611170CC(402H風(fēng)險(xiǎn)等位基因)較之保護(hù)性TT (402Y)的 O7H對(duì)于 OxLDL(16. 3±0. 77Vs. 23. 3±1. 21,P = I. 06xE_5)或MAA(99. 2±1. 93Vs. 105. 2±2. 18，P = 0. 04)的結(jié)合力均較弱。同樣，O7H純合rs2274700CC等位基因的結(jié)合力具有比等位基因TT的結(jié)合力弱，兩者與oxLDL的結(jié)合分別為(CC對(duì)TT為16. 3±0. 94比 25. 8±1.67，P = 0.00034)，兩者與 MAA-LDL 的結(jié)合分別為(CC 對(duì) IT 為 97. 6 ±2. 10 比109. I±4. 09，P = O. 028)。我們進(jìn)一歩分析當(dāng)兩個(gè)單倍型同時(shí)作用時(shí)是否存在結(jié)合作用的附加效應(yīng)。與OxLDL結(jié)合相比的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示一對(duì)保護(hù)單倍型TT/TT與一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)單倍型相比(TT/TT比TT/CC 為 27. 7±1. 05 比 21. 7±1. 83，P = 0. 010)，TT/TT 與一對(duì)風(fēng)險(xiǎn)單倍型相比(TT/TT 比CC/CC，為 27. 7±1. 05 比 16. 8±0. 97,P = 4. 68xE_8)(圖 2B)，即單倍型 TT/TT 與 OxLDL 的結(jié)合力顯著增高。由于CFH與MAA-LDL的結(jié)合在I : 100稀釋幾乎已經(jīng)達(dá)到飽和，我們?cè)趯⒀獫{I : 1000比例稀釋后，檢測(cè)其對(duì)結(jié)合力的影響。與MAA-LDL結(jié)合相比的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，一對(duì)保護(hù)單倍型TT/TT與一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)單倍型TT/CC相比(TT/TT比TT/CC為59. 7±2. 46Vs.50.1±3.13，P = 0.026)，一對(duì)保護(hù)單倍型TT/TT與一對(duì)風(fēng)險(xiǎn)單倍型相比(TT/TT比CC/CC為 59. 7±2. 46Vs. 40. 8±2. 46，P = 3. 37xE_6)即ー對(duì)保護(hù)單倍型 TT/TT 與 MAA-LDL 的結(jié)合力顯著增高(附圖2C).參考文獻(xiàn)I. Manolio TA，Brooks LD,Collins FS.A HapMap harvest of insights into thegeneticsof common disease.J Clin Invest 2008 ；118 :1590-605.2. Klein RJ, Zeiss C，Chew EY, et al. Complement factor H polymorphism inage—relatedmacular degeneration. Science 2005 ；308 :385-9.
3. Mailer J，George S，Purcell S，et al. Common variation in three genes，includinga noncoding variant in CFH, strongly influences risk of age-relatedmaculardegeneration. Nat Genet 2006 ；38 :1055-9.4. Haines JL, Hauser MA, Schmidt S，et al. Complement factor H variantincreasesthe risk of age-related macular degeneration.Science 2005 ；308 419-21.5. Hageman GS, Anderson DH, Johnson LV, et al. A common haplotype inthe complementregulatory gene factor H(HFI/CFH)predisposes individuals toage-related maculardegeneration. Proc Natl Acad Sci USA 2005 ；102 :7227-32.6. Edwards A0, Ritter R，3rd，Abel KJ, Manning A，Panhuysen C，F(xiàn)arrerLA. Complementfactor H polymorphism and age-related macular degeneration.Science 2005 ；308 :421-4.7. Li M，Atmaca-Sonmez P，Othman M，et al. CFH haplotypes without theY402H codingvariant show strong association with susceptibility to age-relatedmaculardegeneration. Nat Genet 2006 ；38 :1049-54.8. Raychaudhuri S，Ripke S，Li M，et al. Associations of CFHRl-CFHR3deletion anda CFH SNP to age—related macular degeneration are not independent.Nat Genet ；42 :553-5 ；author reply 5-6.9. Binder CJ, Chang MK, Shaw PX, et al. Innate and acquired immunity inatherogenesis. Nat Med 2002 ；8 1218-26.10. Brewer GJ. Iron and copper toxicity in diseases of aging，particularlyatherosclerosis and Alzheimer’s disease. Exp Biol Med(Maywood)2007 ；232 :323-35.11. Beatty S，Koh H，Phil M，Henson D，Boulton M. The role of oxidativestress in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Surv0phthalmol2000 ；45 :115-34.12. Ho llyfield JG, Bonilha VL, Rayborn ME，et al. Oxidativedamage-inducedinflammation initiates age-related macular degeneration. Nat Med2008 ；14 :194-8.13. Shaw PX, Horkko S，Chang MK, et al. Natural antibodies with theTlD idiotype mayact in atherosclerosis, apoptotic clearance， and protectiveimmunity. J Clin Invest2000 ;105 :1731-40.14. Chou MY, Hartvigsen K，Hansen LF, et al. Oxidation-specific epitopesare importanttargets of innate immunity. J Intern Med 2008 ；263 :479-88.15.Thiele GM, Duryee MJ, Willis MS，et al. Malondialdehyde-acetaldehyde(MAA)modified proteins induce pro-inflammatory and pro-fibrotic responses byliverendothelial cells. Comp Hepatol 2004 ；3 Suppl I S25.16. Havel RJ, Eder HA, Bragdon JH. The distribution and chemicalcomposition ofultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J ClinInvestl955 ；34 :1345-53.
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定人組織樣本DNA中補(bǔ)體因子H基因型的試劑盒，該試劑盒包含下列成分 a、從人組織樣本中提取DNA模板的試劑； b、用于從DNA模版中擴(kuò)增補(bǔ)體因子H基因片段的引物；包括 補(bǔ)體因子H rs2274700基因型的擴(kuò)增引物對(duì) 上游引物5’ -CAGCCCCCACAAAAAGACTA-3’ ； 下游引物5’ -TGCTTGTCTTTTTCTTATTCTCTTCC-3’ ； 和補(bǔ)體因子H rsl061170基因型的擴(kuò)增引物對(duì) 上游引物5’ -TTTTTGGATGTTTATGCAATCTT-3， 下游引物5’ -GGATGCATCTGGGAGTAGGA-3’ ； 以及 C、用于對(duì)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的片斷進(jìn)行基因型鑒定的引物序列，包括 CFH rsl0611170基因型鑒定的引物序列5’ -TTG TTA TGG TCC TTA GGA AAA TGT TAT TTT CCT TAT TTG GAA AATGGA TAT AATCAA AAT-3，； CFH rs2274700基因型鑒定的引物序列5’-ATC CTG ATG TTT CAC CAT CTG CTG TTA CAT ATC CTA GTT TGC ATTGAT ATT T-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求所述的試劑盒,其特征在于所述的人組織樣本為外周血樣本。
3.鑒定人組織樣本DNA中補(bǔ)體因子H基因型的方法，其特征在于該方法包括以下步驟 a、從人組織樣本中提取和純化DNA模板； b、從DNA模板中擴(kuò)增補(bǔ)體因子H的基因片段，擴(kuò)增用引物包括 補(bǔ)體因子H rs2274700基因型的擴(kuò)增引物對(duì) 上游引物5’ -CAGCCCCCACAAAAAGACTA-3’ ； 下游引物5’ -TGCTTGTCTTTTTCTTATTCTCTTCC-3’ ； 和補(bǔ)體因子H rsl061170基因型的擴(kuò)增引物對(duì) 上游引物5’ -TTTTTGGATGTTTATGCAATCTT-3， 下游引物5’ -GGATGCATCTGGGAGTAGGA-3’ ； C、使用基因型鑒定的引物序列對(duì)步驟b得到的補(bǔ)體因子H的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物測(cè)序進(jìn)行基因型SNP鑒定，如果其中保護(hù)性等位基因?yàn)榧兒献訕?biāo)記為T(mén)T ;其中如果致病性等位基因?yàn)榧兒献訕?biāo)記為CC ;其中如果保護(hù)性/致病性等位基因?yàn)殡s合子標(biāo)記為T(mén)C ； 所述的基因型鑒定的引物序列包括 CFH rsl0611170基因型鑒定的引物序列5’ -TTG TTA TGG TCC TTA GGA AAA TGT TAT TTT CCT TAT TTG GAA AATGGA TAT AATCAA AAT-3，； CFH rs2274700基因型鑒定的引物序列5’-ATC CTG ATG TTT CAC CAT CTG CTG TTA CAT ATC CTA GTT TGC ATTGAT ATT T-3’。
4.ー種定量檢測(cè)載脂蛋白B上氧化磷脂的試劑盒，該試劑盒包含下列成分a、抗載脂蛋白B抗體，用以將血漿中低密度脂蛋白俘獲； b、抗磷酸膽堿的抗體，用以與俘獲的含有氧化低密度脂蛋白的樣品接觸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述抗體的編碼基因含有S107VH重鏈可變區(qū)和V-kappa 22VL輕鏈可變區(qū)。
6.定量檢測(cè)載脂蛋白B上氧化磷脂的方法 a、用抗載脂蛋白B抗體將血漿中低密度脂蛋白俘獲； b、將抗磷酸膽堿的抗體與含有氧化低密度脂蛋白的樣品接觸； C、使所述抗體與氧化磷酸膽堿結(jié)合； d、測(cè)定所述抗體與氧化低密度脂蛋白的結(jié)合量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體可變區(qū)片段中的任意ー種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述抗體的編碼基因含有S107VH重鏈可變區(qū)和V-kappa 22VL輕鏈可變區(qū)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述有氧化低密度脂蛋白樣品為血清、血漿、組織勻漿液或組織提取液。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟(d)可采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、生物素-親和素系統(tǒng)測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法中的至少ー種方法來(lái)所述抗體氧化低密度脂蛋白的結(jié)合量。
11.根據(jù)權(quán)利要求6 10任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于還包括步驟e，即根據(jù)以磷酸膽堿化合物為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定氧化低密度脂蛋白表面的氧化特異抗原決定簇的量。
12.ー種定量測(cè)定補(bǔ)體因子H與氧化特異性抗原結(jié)合的試劑盒，該試劑盒含有氧化特異性抗原；抗補(bǔ)體因子H的抗體。
13.ー種定量測(cè)定補(bǔ)體因子H與氧化特異性抗原結(jié)合的方法，包含下列操作步驟 a、制備氧化特異性抗原； b、包被氧化特異性抗原在微孔板上； C、將血漿中補(bǔ)體因子H與氧化特異性抗原結(jié)合； d、用抗補(bǔ)體因子H的抗體測(cè)定補(bǔ)體因子H與氧化特異性抗原的結(jié)合量。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述抗補(bǔ)體因子H的抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體可變區(qū)片段中的任ー種。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述抗補(bǔ)體因子H為單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體可變區(qū)片段中的任意ー種。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于所述抗體的編碼基因含有S107VH重鏈可變區(qū)和V-kappa 22VL輕鏈可變區(qū)。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述步驟d可采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、生物素-親和素系統(tǒng)測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法中的至少ー種方法來(lái)所述抗體氧化低密度脂蛋白的結(jié)合量。
18.根據(jù)權(quán)利要求6 11任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于還包括步驟e，即根據(jù)純化補(bǔ)體因子H為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定補(bǔ)體因子H的定量，以及補(bǔ)體因子H與氧化特異性抗原結(jié)合量與補(bǔ)體因子H含量的 比值。
全文摘要
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)疾病發(fā)生、發(fā)展的診斷試劑。本發(fā)明涉及的技術(shù)方案是對(duì)補(bǔ)體因子H的兩種基因型(rs10611170(Y402H)/rs2274700)的鑒定以及對(duì)氧化特異性抗原的及其試劑盒和定量檢測(cè)方法。本發(fā)明公開(kāi)的定量檢測(cè)方法包括下列方面(a)外周血基因組DNA的提取以及測(cè)定rs10611170(Y402H)/rs2274700的引物與序列；(b)將抗磷酸膽堿的抗體與含有OxLDL的受試血漿樣品接觸；測(cè)定氧化磷脂的含量。(c)將受試血漿與氧化特異性抗原接觸；測(cè)定補(bǔ)體因子H與氧化特異性抗原結(jié)合的量。本發(fā)明對(duì)年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)疾病發(fā)生、發(fā)展的診斷提供了可靠的參照指標(biāo)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102649975SQ20111004322
公開(kāi)日2012年8月29日 申請(qǐng)日期2011年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月23日
發(fā)明者張康 申請(qǐng)人:張康