專利名稱：載脂蛋白b－100表位的模擬肽、其多聯(lián)體和修飾肽,以及含有這些肽的疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療肥胖的疫苗組合物。更具體地說，本發(fā)明涉及一種包含載脂蛋白B-100的模擬肽表位、其多聯(lián)體和修飾肽的疫苗組合物。
背景技術(shù)：
血清脂質(zhì)由膽固醇、甘油三酯(TG)、游離脂肪酸、磷脂等組成，其在血流中以脂質(zhì)與載脂蛋白的復(fù)合物—脂蛋白形式存在。
在這些脂蛋白中，低密度脂蛋白(LDL)是TG和膽固醇的主要載體。由于飲食生活或其它因素的變化，由血液中LDL-膽固醇水平升高引起的動脈硬化、冠狀動脈疾病或心肌梗塞的患者數(shù)量已有顯著增加。
因此，現(xiàn)已進行各種研究來降低LDL-膽固醇的水平和顯示上述疾病的病因，以治療患有上述疾病的患者。
LDL-膽固醇是與脂質(zhì)有關(guān)的成年疾病的主要病因，它可由巨噬細胞轉(zhuǎn)變成高密度脂蛋白(HDL)的形式。另外，在肝臟中，LDL-膽固醇也可轉(zhuǎn)變成其它物質(zhì)或轉(zhuǎn)變成膽汁酸形式(Brown，M.S.和Goldstein，J.L.，1983，Annu.Rev.Biochem.，52223-261)。
載脂蛋白B-100是LDL中的主要蛋白部分，它也存在于非常低密度的脂蛋白(VLDL)和乳麇微粒中。當血液中通過識別載脂蛋白B-100誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體時，血中的LDL-膽固醇可通過巨噬細胞的吞噬作用來除去，因為載脂蛋白B-100介導(dǎo)LDL顆粒與顯露在細胞表面上的LDL-受體結(jié)合(Dalum I.，等人.，1997，Mol.Immunol.，34(16-17)1113-20)。
當諸如抗體等大分子已經(jīng)和LDL表面上的載脂蛋白B-100結(jié)合時，由于與載脂蛋白B-100結(jié)合的大分子引起的空間位阻，諸如脂蛋白脂肪酶等脂肪酶不能水解TG等。因此，可利用結(jié)合載脂蛋白B-100的抗體來抑制肥胖的主要因素—游離脂肪酸的形成。
最近，已經(jīng)在諸如小鼠和家兔等各種動物模型中進行了幾個用疫苗來降低LDL-膽固醇水平和抑制動脈硬化發(fā)生的研究。例如，C.R.Alving報道說，膽固醇可通過代謝或氧化來修飾，經(jīng)修飾的膽固醇在某些情況下是強的抗原決定簇(Alving，C.R.，等人，1989，Biochem.Soc.Trans.，17(4)637-9；Alving，C.R.，等人，1996，J.Lab.Clin.Med.，12740-49；Alving，C.R.，等人，1996，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，210181-6)。
另外，已經(jīng)報道血清中存在膽固醇的內(nèi)源性抗體(Wu，J.T.，L.L.，1997，Clin.Lab.Med.，17(3)595-604，綜述)。還有報道說，通過喂食含膽固醇的食物在家兔體內(nèi)誘導(dǎo)動脈硬化和高膽固醇血癥的實驗中，通過注射含膽固醇的脂質(zhì)體而免疫的家兔體內(nèi)的高膽固醇血癥和動脈硬化與對照組相比受到遏制或顯著降低。
膽固醇疫苗誘導(dǎo)的這些抗體是結(jié)合VLDL、中密度脂蛋白(IDL)和LDL的免疫球蛋白M(IgM)。根據(jù)上述內(nèi)容，據(jù)信可以用疫苗來治療或預(yù)防高水平膽固醇引起的高脂血癥或動脈硬化(Bailey，J.M.，1994，Science，2641067-1068；Palinski，W.等人，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，92(3)821-5；Wu，R.et al，1999，Hypertension，33(1)53-9)。
本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)載脂蛋白B-100的模擬肽表位可有效預(yù)防肥胖，基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明者開發(fā)出了用來治療肥胖的疫苗組合物。
發(fā)明揭示因此，本發(fā)明的目的是提供載脂蛋白B-100表位的模擬肽，其多聯(lián)體和修飾肽。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述載脂蛋白B-100表位的模擬肽及其多聯(lián)體和修飾肽的方法。
本發(fā)明還有一個目的是提供一種治療或預(yù)防肥胖的藥物組合物，該組合物含有上述載脂蛋白B-100表位的模擬肽及其多聯(lián)體和修飾肽。
本發(fā)明的目的可通過提供載脂蛋白B-100表位的模擬肽及其多聯(lián)體和修飾肽來實現(xiàn)。
為了篩選單克隆抗體(MabB23)結(jié)合的人載脂蛋白B-100的表位，在本發(fā)明中采用噬菌體的肽文庫系統(tǒng)。上述篩選出的肽是在結(jié)構(gòu)上與可被抗體識別的抗原決定簇相似的模擬肽，這些模擬肽可根據(jù)所篩選的肽的氨基酸序列來合成。
肽文庫系統(tǒng)是一種搜尋抗原決定簇的三維形式的方法。即，將編碼隨機序列的肽的DNA片段插入編碼噬菌體次要外殼蛋白的DNA中，然后將上述DNA插入讀框(RF)DNA中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，以使它們表達。為了篩選在結(jié)構(gòu)上與抗原決定簇相似的肽，使大腸桿菌表面上表達的肽與抗原反應(yīng)。
為了制備抗血清，導(dǎo)入上述模擬肽來免疫小鼠。經(jīng)確認，如此獲得的抗血清同時識別最初的載脂蛋白B-100、模擬肽和LDL(“用噬菌體展示的隨機肽文庫鑒定針對載脂蛋白A-1和載脂蛋白B-100的鼠單克隆抗體的抗原決定簇”，Chi-Hoon Kim，Hanyang Univ.，1997)。
本發(fā)明的載脂蛋白B-100表位的模擬肽可以是選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3的肽或是其混合物。
為了改進其抗原決定簇，本發(fā)明的模擬肽可以多聯(lián)體形式使用。作為本發(fā)明的一個實施方案，兩個或多個肽可相互連接。由3-15個肽組成的多聯(lián)體是所希望的。更佳的，本發(fā)明的多聯(lián)體包含四個SEQ ID NO1的肽。
本發(fā)明的上述模擬肽的“多聯(lián)體”指一種聚合物，其中上述模擬肽的末端相互連接。
本發(fā)明的上述模擬肽的“修飾肽”指可被載脂蛋白B-100的單克隆或多克隆抗體識別的模擬肽變體。這些變體包括對本發(fā)明的模擬肽中的一個或多個氨基酸進行置換、缺失、插入和化學取代。
本發(fā)明另一目的是提供一種制備模擬肽及其多聯(lián)體和修飾肽的方法，該方法包括下列步驟i)將編碼上述模擬肽及其多聯(lián)體和修飾肽的DNA插入載體內(nèi)，ii)用上述載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，然后培養(yǎng)這些宿主細胞，iii)從上述宿主細胞中分離出上述模擬肽及其多聯(lián)體或修飾肽。
疫苗組合物制劑可從本發(fā)明的模擬肽、其多聯(lián)體或修飾肽通過任何常規(guī)方法來制得。在制備上述制劑的方法，組合物(其中活性化合物與免疫佐劑、增強免疫力的藥物、載體、賦形劑和稀釋劑混合)宜選自片劑、丸劑、顆粒劑、粉末劑、扁囊劑、懸浮劑、乳劑、液體、糖漿、氣溶膠、軟或硬的明膠膠囊、注射用無菌液體、無菌粉末等形式。
可用于本發(fā)明組合物的免疫佐劑是一種含有T細胞表位的蛋白質(zhì)(例如乙型肝炎病毒的表面蛋白)，諸如鋁鹽、膨潤土、乳液、丙烯酸顆粒等的惰性載體；疏水性抗原(如脂質(zhì))、水包油和油包水乳劑、貯存脂肪形成物(如多糖)、T細胞激活劑如PPD、聚腺嘌呤、聚尿嘧啶等；B細胞激活劑(如B細胞促分裂素)、表面活性劑如皂素、溶血卵磷脂、視黃醛、quil A、脂質(zhì)體等；增強巨噬細胞活性的材料；和補體旁路途徑激活劑如胰島素、酵母多糖、內(nèi)毒素、左旋咪唑、C.parvum等。
本發(fā)明的“載體蛋白”指藥學上可接受的能將本發(fā)明的模擬肽及其多聯(lián)體和修飾肽輸送通過血液的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)或鋁鹽。
鋁鹽、苯氧乙基乙醇、水、生理鹽水、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、無定形纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油可用作本發(fā)明組合物中的合適的載體、賦形劑或稀釋劑。
另外，本發(fā)明組合物還可包含填充劑、抗粘合劑、潤滑劑、潤濕劑、香料、乳化劑和抗菌劑。
本發(fā)明的組合物可用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法來配制，通過一次或多次接種在哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的用來治療肥胖的疫苗組合物可通過諸如口服、皮膚、皮內(nèi)、靜脈或肌肉等各種途徑(較佳的是皮內(nèi)給藥)來給藥。
本發(fā)明的疫苗組合物的有效劑量為0.1-10微克(活性肽)千克體重，較佳的為0.5-1.0微克/千克體重。然而，疫苗組合物的活性組分的實際劑量可根據(jù)免疫力狀況、給藥途徑、患者狀況、年齡、性別、體重等幾個因素來決定。因此，所述劑量范圍不以任何方式局限于本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明的疫苗組合物的主要藥效是預(yù)防或治療肥胖，其機理是由模擬肽或其多聯(lián)體或修飾肽誘導(dǎo)產(chǎn)生的人抗體結(jié)合在LDL表面上載脂蛋白B-100的表位上，從而在空間上阻礙并抑制脂肪酶產(chǎn)生脂肪酸(肥胖的主要病因)。
另外，本發(fā)明的疫苗組合物還有抑制高脂血癥的效果，其機理是模擬肽、其多聯(lián)體或修飾肽誘導(dǎo)的偶聯(lián)于LDL表面上載脂蛋白B-100表位上的人抗體引起調(diào)理作用，通過該調(diào)理作用，LDL很容易被檢測到并被巨噬細胞除去。
本發(fā)明組合物的另一藥物效果是通過抑制膽固醇和游離脂肪酸等脂質(zhì)在細胞內(nèi)的累積來預(yù)防或治療肥胖，其機理是本發(fā)明的模擬肽、多聯(lián)體或修飾肽誘導(dǎo)的人抗體與LDL表面上的載脂蛋白B-100表位結(jié)合，從而抑制LDL與外露在細胞表面上的LDL受體特異性結(jié)合。
附圖簡述通過參照附圖詳細描述其較佳實施方案，本發(fā)明的上述目的和其它優(yōu)點將更為明了，在附圖中

圖1a至1d表示用來表達本發(fā)明模擬肽的載體的結(jié)構(gòu)和組成。圖1a表示前導(dǎo)盒的結(jié)構(gòu)，圖1b表示LB盒的結(jié)構(gòu)，圖1c表示BL盒的結(jié)構(gòu)，圖1 d表示pBX4表達載體的結(jié)構(gòu)。
圖2表示制備用于表達本發(fā)明模擬肽的pBX1和pBX4載體的步驟。
圖3表示鑒定LB盒的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)的結(jié)果。
圖4表示用于鑒定插入質(zhì)粒pBlue-BL的BL盒的PAGE結(jié)果。
圖5表示用來確認插入質(zhì)粒pBX1和pBX3的DNA的方向和拷貝數(shù)的PAGE結(jié)果。
圖6表示用來鑒定所表達的PB14肽的Western印跡結(jié)果。
圖7表示用來確認純化的PB14肽的十二烷基硫酸鈉(SDS)PAGE的結(jié)果。
圖8表示用來確認所純化的PB14肽對抗PB14血清的反應(yīng)性的Western印跡結(jié)果。
圖9表示用來測定PB14肽誘導(dǎo)的小鼠抗體的親和力的ELISA的結(jié)果。
圖10的圖表描述了PB14對小鼠體重增加的抑制效果。
圖11a和11b描述了小鼠體重變化取決于在注射破壞下丘腦的藥物后20周內(nèi)是否給予本發(fā)明的PB14疫苗。
圖12的圖表表示PB14疫苗的注射對血清中脂質(zhì)濃度的影響。
實施發(fā)明的最佳方式下面將更詳細地描述本發(fā)明。然而，下面描述的本發(fā)明僅僅是為了說明本發(fā)明的實施方案，而不是限制本發(fā)明的范圍。
實施例1寡核苷酸的合成和退火寡核苷酸由Genemed Synthesis Inc.(San Francisco，CA，USA)根據(jù)本發(fā)明者要求的序列來進行化學合成。為了使寡核苷酸5′端磷酸化，使50微升100皮摩爾/微升寡核苷酸與10微升10mM ATP、3微升10U/微升T4多核苷酸激酶Takara，Otsu，Japan)以及7微升10X激酶緩沖液37℃培育2小時。
混合每10微升等份的上述磷酸化寡核苷酸，80℃加熱5分鐘，然后非常緩慢地冷卻至室溫，在互補鏈之間退火成特異性的配對。
實施例2連接混合1微升載體DNA、5微升插入物DNA、1微升T4 DNA連接酶(NEB，Beverly，MA，USA)、1微升10X酶反應(yīng)緩沖液(NEB，Beverly，MA)和2微升蒸餾水，制得混合物，然后在16℃培育過夜，然后進行培育。
實施例3用來表達載脂蛋白B-100的模擬肽的pBX表達載體的構(gòu)建步驟1載體的設(shè)計用來表達模擬肽的質(zhì)粒載體通常包含前導(dǎo)盒和一個或多個PB1肽基因。如圖1所示，將前導(dǎo)盒(圖1a)克隆到pQE30質(zhì)粒(Qiagen，Hilden，Germany)的多克隆位點內(nèi)，制得含有一個PB1的質(zhì)粒pBX1。用HindIII和SalI消化所得質(zhì)粒，用LB盒(圖1b)代替小片段，得到便于插入多個BL盒(圖1c)的質(zhì)粒pBX1。
同時，用SalI和XhoI切割質(zhì)粒pBluescript II SK+，與隨機發(fā)生一個或多個BL盒插入的BL盒連接。選擇并切出質(zhì)粒pBlue-BL，亞克隆到pBX1(圖1d)中。
步驟2表達PB1單肽的載體的制備使通過實施例1和2相同方法合成的SEQ ID NO10和SEQ ID NO11寡核苷酸退火，制得前導(dǎo)盒。然后，將經(jīng)SalI和BamHI切割的pQE30載體(Qiagen，Hilden，Germany)與上述連接盒連接，制得pQE前導(dǎo)質(zhì)粒。由于上述pQE30載體的表達，為使蛋白容易純化，在表達的蛋白質(zhì)N端額外插入6個組氨酸殘基。設(shè)計上述前導(dǎo)盒，使其包含腸激酶的識別位點(DDDDKI；SEQ ID NO12)，以將額外的氨基酸減少至最小值。
根據(jù)實施例1的方法，合成4個寡核苷酸(其序列用SEQ ID NO4-7表示)，使它們磷酸化，然后分別與互補的寡核苷酸退火，以便合成圖1b的LB盒(SEQ ID NO13和14)。將40微升退火的寡核苷酸與3微升1U/微升T4 DNA連接酶、5微升10X酶緩沖液以及2微升蒸餾水一起混合，制得連接混合物。然后，培育連接混合物過夜，使寡核苷酸相互連接。
反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物加載到20％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。用溴化乙錠(EtBr)給凝膠染色，鑒定LB盒(52bp寡核苷酸)。
在圖3中，泳道M是20bp DNA梯序列標記，泳道1是反應(yīng)溶液。用QIAEX II凝膠抽提試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)從凝膠獲得LB盒。
用Hind III和SalI切割上述pQE-前導(dǎo)序列，然后按照實施例2與上述LB盒連接，制得PB1模擬肽的表達載體。制得的表達載體命名為pBX1，載體表達的肽命名為PB11肽(參見圖2)。
步驟3PB11肽多聯(lián)體的表達載體的制備根據(jù)實施例1的方法，合成具有SEQ ID NO4、5、8和9所示序列的四個寡核苷酸并磷酸化，然后分別與互補的寡核苷酸退火，以合成圖1c所示的BL盒(SEQ IDNO15和16)。隨后，象步驟2那樣，使這些寡核苷酸相互連接，然后加樣到20％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。通過溴化乙錠凝膠染色，鑒定出55bp的寡核苷酸(前導(dǎo)盒)。用QIAEX II凝膠抽提盒從凝膠獲得BL盒，然后用SalI和XhoI切割。
同時，用SalI和XhoI切割pBluescript II SK(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。載體在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳，然后用QIAEX II凝膠抽提盒(Qiagen，Hilden，Germany)來獲得。
用5微升BL盒DNA和1微升上述切割載體DNA進行與實施例2相同的連接反應(yīng)，獲得pBlue-BL質(zhì)粒。
用SalI和XhoI切割pBlue-BL，抽提該BL盒。將該BL盒插入步驟2中制得的pBX1載體的SalI位點內(nèi)，制得質(zhì)粒pBX2。另外，將插入pBX1載體的SalI位點的BL盒數(shù)目從2改為3(參見圖2)，制得pBX3和pBX4。
pBX2、pBX3和pBX4載體表達的肽是有2-4個PB1肽的多聯(lián)體。它們分別命名為PB12、PB13和PB14。
步驟4插入物的鑒定用pBlue-BL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞(大腸桿菌M15[pREP4]；Qiagen，Hilden，Germany)，然后涂在1％瓊脂板上，37℃培育16小時，使大腸桿菌菌落形成。將瓊脂板上形成的一個菌落接種在10毫升LB培養(yǎng)基中，37℃搖瓶培育16小時，然后用DNA純化系統(tǒng)(Wizard PLUS SV DNA miniprep DNA純化系統(tǒng)；Pormega，Madison，W1，USA)分離質(zhì)粒。將從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌收獲的質(zhì)粒與SalI和XhoI限制酶一起培育，使其在37℃受切割1小時，然后用20％PAGE分析(圖4)。在圖4中，泳道M表示20bpDNA梯序列，泳道1表示步驟3獲得的寡核苷酸產(chǎn)物，泳道2表示通過20％PAGE從步驟3分離的BL盒DNA，泳道3表示經(jīng)限制酶處理的重組pBlue-BL質(zhì)粒。如圖4所示，確認pBlue-BL質(zhì)粒含有BL盒。
用pBX1或pBX3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(M15[pREP4])，如上所述分離質(zhì)粒DNA，以確認DNA盒插入物的數(shù)目和方向。分離的質(zhì)粒用SalI和HindIII限制酶切割，用20％PAGE分析(圖5)。在圖5中，泳道M表示20bp DNA梯序列，泳道1和3表示含有LB但不是BL盒的pBX1質(zhì)粒，泳道2表示具有一個LB和兩個BL盒(具有正確方向)的質(zhì)粒。另一方面，泳道4表示了具有一個LB和兩個BL盒(但有相反的方向)的質(zhì)粒。如圖5所示，限制酶圖譜能鑒定有多少B盒(BL或LB盒)插入以及它們以何方向插入pBX載體。
另外，從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌收獲的質(zhì)粒中所插入的B盒的DNA序列經(jīng)確認與設(shè)計的序列相同。質(zhì)粒用Wizard PLUS DNA miniprep試劑盒來制備，用Sequennase(2.1版)DNA測序試劑盒(Amersham，Cleveland，UK)來測序。
實施例4PB14肽在大腸桿菌中的表達及其純化步驟1PB14肽表達的確認為了確認PB14肽的表達，在含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB瓊脂肉湯上培育三種轉(zhuǎn)化的大腸桿菌M15[pREP4]。一種大腸桿菌M15[pREP4]用質(zhì)粒pBX4轉(zhuǎn)化，另一種用pQE30作模擬轉(zhuǎn)化，還有一種是未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌M15[pREP4]。將從固體培養(yǎng)物形成的每個菌落分別接種到含有100微升/毫升氨芐青霉素和25微升/毫升卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，培育過夜。37℃振搖培育該培養(yǎng)物1小時，直至600nm下的O.D值達到0.5-0.7。隨后，將1mM異丙基-硫代-β-半乳糖吡喃糖苷(IPTG)加入培養(yǎng)基中，以實現(xiàn)重組蛋白的表達，然后再在37℃下培育5小時。取1毫升培養(yǎng)基，14000rpm下離心2分鐘，使細菌細胞沉淀。將細胞沉淀懸于50微升2X SDS溶液[100mM Tris-ClpH6.8，20％甘油(w/v)，4％SDS(w/v)，2％2-巰基乙醇，0.001％溴苯藍]中，用于SDS-PAGE中。將懸浮的溶液加熱至95℃，加熱5分鐘，然后將10微升溶液加樣到澆注凝膠孔上，在20mA下電泳5小時(Mighty Small II，Hoefer，USA)。濃縮膠和分離膠的丙烯酰胺濃度分別采用5％和15％，用預(yù)先染色的標準品SeeBlue(250Kda至4kDa；NOVEX，San Diego，CA，USA)或范圍寬的標準品Mark12(200kDa至2.5kDa)作為標準分子標記蛋白。電泳后，用考馬斯亮藍R-250染色1小時，染料用脫色液(5％甲醇和7％乙酸)脫色10小時。
為了確認所表達的蛋白質(zhì)是PB14肽，用抗PB1家兔抗體對電泳凝膠中的蛋白質(zhì)進行Western印跡(圖6)。用Bio-Synthesis，Inc.(Lewisville，TX，USA)化學合成的PB1肽偶聯(lián)的卵白蛋白進行免疫，產(chǎn)生抗血清。在圖6中，泳道M表示預(yù)先染色的標準品SeeBlue標記，泳道1表示用來培育未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌M15[pREP4]的培養(yǎng)基，泳道2表示用來培育經(jīng)pQE30載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌M15[pREP4]的培養(yǎng)基，泳道3表示用來培育經(jīng)pBX4載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌M15[pREP4]的培養(yǎng)基。
如圖6所示，只有經(jīng)pBX4轉(zhuǎn)化的大腸桿菌表達的重組PB14肽表現(xiàn)出與抗PB1小鼠血清有特異性免疫力。
步驟2表達的肽的溶解度的鑒別用與步驟1相同的方法培育經(jīng)pBX4載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌M15[pREP4]。取10毫升培養(yǎng)基，離心收獲細胞。將細胞沉淀懸浮于5毫升細胞裂解液(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，10mM咪唑，pH8.0)中，從細胞獲得天然蛋白。冷卻后，用超聲波對沉淀懸浮的溶液進行20輪超聲處理，以使細胞裂解。4℃、10000rpm下離心30分鐘，取上清液。將相同體積的2X SDS溶液與該溶液混合，如步驟1中同一方法那樣進行SDS-PAGE。每一溶液在95℃沸騰5分鐘后，SDS-PAGE確認從可溶的抽提物A中能分離純化得到PB14肽，因為它被包含不溶性粗抽提物B中。
步驟3PB14肽的純化步驟3-1親和層析用純化His-加尾的蛋白質(zhì)的Ni-NTA樹脂來純化步驟1中的重組肽。利用樹脂中的飽和的Ni+和所表達的蛋白質(zhì)末端的組氨酸殘基之間的吸引力的親和層析是方便地純化所述蛋白的熟知方法。
首先將經(jīng)pBX4轉(zhuǎn)化的大腸桿菌M15[pREP4]接種到1升LB培養(yǎng)基中，37℃培育至600nm OD值超過0.6。LB培養(yǎng)基與pBX4載體之比為50∶1。加入IPTG至最終濃度為1mM，再次培育5小時。培育后，6000xg下離心培養(yǎng)基30分鐘，獲得細胞沉淀，將沉淀保藏于-70℃下過夜。使沉淀在冰中溶解，懸浮于溶解溶液(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，10mM咪唑，pH8.0)中，其中每1克沉淀采用5毫升溶解溶液。用步驟2的方法通過超聲處理使細胞裂解，然后在室溫下、10000Xg下離心30分鐘。加入與沉淀體積相同的緩沖液(8M尿，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-HCl pH8.0)，使細胞碎片重新懸浮，并使其中的蛋白質(zhì)變性，用簡單的超聲波處理沉淀懸浮的溶液，使更多的蛋白質(zhì)溶解在緩沖液中。懸浮液于8000rpm下離心30分鐘，以除去未溶解在8M脲中的細胞碎片。在4毫升上述上清液中，加入4℃的1毫升Ni-NTA樹脂，200rpm下振搖2小時，以捕獲含有His-尾的蛋白質(zhì)。
將含有蛋白質(zhì)/Ni-NTA復(fù)合物的該上清液仔細導(dǎo)入層析柱(大小為2厘米(內(nèi)徑)×2.7厘米(高))中。在樹脂沉降后，打開塞帽，使過量緩沖液濾干。用20毫升中性pH緩沖液(8M脲，0.1M NaH2PO40.1M Tris-HCl pH6.3)洗柱，隨后用20毫升另一緩沖液(8M脲，0.1M NaH2PO40.01M Tris-HCl pH6.3)洗柱，以洗去與Ni-NTA樹脂非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。倒入5毫升低pH緩沖液(8M脲，0.1M NaH2PO40.1M Tris-HClpH5.9)兩次，隨后倒入5毫升強酸緩沖液(8M脲，0.1M NaH2PO40.1M Tris-HCl pH4.5)4次，洗脫出含有His-尾的目標蛋白，然后用SDS-PAGE，用15％丙烯酰胺凝膠(圖7)來確認洗脫的目標蛋白。在圖7中，泳道M表示預(yù)先染色的SeeBlue分子大小標記物，泳道1表示純化的PB14肽。
使上述純化的蛋白質(zhì)對PBS(8克/升氯化鈉，0.2克/升氯化鉀，1.44克/升NaH2PO4和0.24克/升KH2PO4)透析，以重新獲得它們最初的構(gòu)型。所用的透析管的分子量截留大小為3500Da。在透析期間，前5小時先用3升含2M脲的PBS，然后用5升沒有脲的PBS兩次，過夜。
步驟3-2疏水層析為了提高步驟3-1所得PB14肽的純度，進行疏水層析。在步驟3-1中從Ni-NTA洗脫的含PB14肽的溶液中逐量加入硫酸銨至最終濃度為20％，然后調(diào)節(jié)至pH7.0。在10％的硫酸銨完全溶化后使溶液靜置3小時以上，然后將溶液加樣到苯基sepharose柱[填料苯基sepharose Fast Flow樹脂(Phamacia，Sweden)；柱體積為1厘米(內(nèi)徑)×3厘米(高度)]中。
在從10％到0％的硫酸銨的反向梯度下，以0.5毫升/分鐘將洗脫液(8M脲，0.1MNaH2PO40.01M Tris-HCl pH6.3)倒入柱內(nèi)，洗脫出各組分，將各組分加樣在凝膠上進行SDS-PAGE。收集含有PB14肽的組分，在待脫鹽的緩沖液中透析，同時除去用作變性劑的脲。
步驟3-3His-尾的除去在適合用來除去純化的His-尾蛋白中的變性劑和咪唑等物質(zhì)以及用來激活腸激酶的緩沖液(50mM NaCl，20mM Tris-HCl，2mM CaCl2pH7.4)中加入2M脲。用上述含脲緩沖液使PB14肽脫鹽，對步驟3-2獲得的透析的PB14肽再次進行透析，在此期間，通過對不含脲的緩沖液進行反復(fù)透析來逐漸降低脲濃度。將3U/毫升腸激酶加入含PB14肽的溶液中，用所述第二緩沖液與該緩沖液交換，并在23℃下培育。每小鼠取溶液進行SDS-PAGE分析，以檢查有His-尾的PB1(PB14+his)肽中His-尾的除去量。
步驟3-4離子交換層析用離子交換層析除去腸激酶處理后產(chǎn)生的不需要的蛋白質(zhì)和肽。
在透析緩沖液(2M脲，0.1M NaH2PO4，0.01M Tris-HCl，pH7.0)中對步驟3-3獲得的含PB14-his肽的溶液進行透析，充分交換緩沖液。將經(jīng)過透析的溶液加樣到DEAEsepharose樹脂(Phamacia，uppsala，Sweden)上。隨后，用平衡緩沖液(50mM磷酸鈉緩沖液，2M脲，pH7.0)使該柱平衡，用另一緩沖液(50mM磷酸鈉緩沖液，2M脲，1M氯化鈉)在氯化鈉濃度梯度0-1M下進行洗脫(流速為0.5毫升/分鐘)?；厥彰恳唤M分，然后合并含有目標蛋白的組分。在濃縮各區(qū)室后，用SDS-PAGE確認PB14-his肽的存在。
步驟4PB14的定量分析用micro BCA試劑(Pierce，Rockford，USA)通過比色分析來定量分析用步驟3相同方法獲得的純化的PB14肽。
步驟5重組PB14肽的特性確認用ECL(Amersham，Cleveland，UK)進行Western印跡試驗，確認步驟3中純化的PB14肽的純度，以及它們對用合成的PB14肽作為抗原獲得的抗血清的免疫原性。在SDS-PAGE(實施例2，步驟1)后，使凝膠與PVDF膜一起在緩沖液(0.3％Tris，1.5％甘氨酸，20％甲醇)中在60V恒定電壓下培育3小時，以使凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后，使帶印跡的膜與5毫升封閉液(TBS pH7.5，5％脫脂奶粉(w/v)，0.02％吐溫20)培育1.5小時，然后用TTBS(含有0.1％吐溫20的Tris緩沖的鹽溶液)分別洗滌三次各15分鐘、5分鐘和5分鐘。用TTBS溶液以1∶5000的比例稀釋抗肽PB1(指實施例2的步驟1)的抗血清，然后和膜一起培育1.5小時，以確認PB14肽，抗PB14肽的抗血清的純度(實施例3)。在用TTBS依次洗滌凝膠三次(15分鐘，5分鐘和5分鐘)，使膜在室溫下與一溶液一起培育1.5小時，該溶液中堿性磷酸酶-F(ab)′2-山羊抗小鼠IgG(H+L)(Zymed，San Fransisco，CA)用TTBS溶液以1∶1000的比例稀釋。再次用TTBS洗滌該膜三次，然后加入BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/氮藍四唑(Sigma))。染色后，用TTBS溶液除去BCIP/NBT溶液。Western印跡分析的結(jié)果是，所表達的PB14肽能被抗PB14血清識別。
在ECL情況下，采用PVDF膜(Gelman Science，BioTraceR)代替硝酸纖維素膜。另外，第一抗體所用比例為1∶10000，用HRP偶聯(lián)的家兔抗小鼠IgG(Pierce，Rockford，IL，USA)作為第二抗體，其比例為1∶10000。在顏色反應(yīng)中采用每25毫升溶液B有1毫升的ECL+Plus Western印跡試劑溶液A(Amersham)。當產(chǎn)生足夠的顏色后，將膜插入膠片盒中在膠片上分別曝光5、10、20和30秒，使凝膠上的條帶被檢測到(圖8)。在圖8中，泳道M表示ECL檢測標記(Gibco BRL)，泳道1表示PB14肽。從圖8的結(jié)果來看，表達的PB14肽能被抗PB14血清識別。
另外，用Protein G柱(Bio-Rad，USA)從家兔血清中分離出的多克隆抗體對PB14肽進行Western印跡分析，獲得了相同的結(jié)果。
實施例5抗PB14肽小鼠抗體的制備本文所用的PB14肽是實施例2步驟3-3中除去了His-尾的PB14-his肽。
步驟1PB14肽和OVA之間的連接卵白蛋白(OVA)作為載體蛋白以1∶10的摩爾比加入實施例2步驟2中的純化的PB14肽中，4℃下培育1小時。在PB14肽的卵白蛋白溶液中加入相同體積的2％(v/v)戊二醛，連續(xù)振搖并培育1小時。然后，在反應(yīng)混合物中加入甘氨酸直至最終濃度為0.2M才終止其中進行的反應(yīng)。
反應(yīng)后，用MWCO 12000-14000透析膜(SpectrumR，Dominguez，CA，USA)透析除去反應(yīng)混合物中的其余的戊二醛-甘氨酸。
步驟2對小鼠進行免疫濃縮步驟1中與OVA相連的肽，用來免疫小鼠。待注入小鼠的抗原量為5微克，這是PB14肽在與OVA相連之前的量。用相同量的佐劑乳化抗原，以0.2毫升的用量注入小鼠的腹腔內(nèi)。
用完全弗氏佐劑(CFA)作為第一次注射的佐劑，不完全的弗氏佐劑(IFA)作為加強免疫的佐劑，每隔兩周免疫兩次。在對照小鼠中，注入BSA(牛血清白蛋白)。
在最后一次注射的5天后，用心臟穿刺從小鼠取1毫升血，37℃下凝血30分鐘。然后，在4℃、2500xg下離心血液30分鐘，除去血中的凝塊。對于待完全濃縮的其余的凝血劑，4℃下培育上清液(血清)過夜，10000xg離心20分鐘。將所得上清液等份分到幾個管內(nèi)。待用于實驗的血清4℃保存，而其余的血清-20℃保存。
步驟3用間接ELISA測定抗PB14肽抗體的親和力用步驟2獲得的血清來測定抗體的親和力。將100微升PB14肽分配到96孔微量滴定板(Flacon預(yù)結(jié)合)的每個孔內(nèi)，4℃下靜置6小時或更長時間，然后用TTBS(Tris緩沖鹽溶液，含有0.05％吐溫20)洗滌3次。在每個孔內(nèi)加入200微升封閉液(含1％BSA的TTBS)，37℃下培育1小時，然后用TTBS洗滌3次。經(jīng)封閉液以1∶102-1∶105比例稀釋的100微升分離血清加入反應(yīng)溶液中，37℃培育1小時，然后用200微升TTBS洗滌3次。將經(jīng)封閉液1∶103稀釋的100微升HRP相連的山羊抗家兔IgG抗體(Pierce，Rockford，IL)加入反應(yīng)溶液中，37℃培育1小時，用200微升TTBS洗滌3次。將HRP底物試劑盒(Bio-Rad)的溶液A與其溶液B以9∶1的比例混合。將100微升的所得混合物加入反應(yīng)溶液中，顯色30分鐘，然后用ELISA leader(EL312e，Bio-Tek Ins.)(圖9)測定反應(yīng)混合物在405nm下的吸光度。在圖9中，確認對PB14肽特異性的小鼠抗體可以1000倍的稀釋度(圖中的X軸的3.0)用于Western印跡和ELISA分析。
實施例6利用小鼠模型的PB14疫苗的抗肥胖效果步驟1在小鼠中誘導(dǎo)肥胖這里采用5周齡ICR小鼠(Korea Center for Animal Experiment Ltd.，Seoul，Korea)。小鼠喂養(yǎng)于飼養(yǎng)場，溫度保持在17℃至25℃，喂以混合飼料(Sam Yang Feed Ltd.，Seoul，Korea，[組分水11.8％以上，蛋白質(zhì)20.0％以上，粗制脂質(zhì)10.0％以上，粗纖維10.0％以上，粗制灰10.0％以上，鈣0.6％以下和磷0.4％以上])。給予小鼠Goldthioglucose(GTG)以誘導(dǎo)肥胖。GTG在誘導(dǎo)腹側(cè)正中下丘腦核(VMH)脫敏方面有一定作用。因此，給予GTG的小鼠不感到飽，并始終有進食的欲望。這里所用的GTG是非常不穩(wěn)定的化合物，它很容易在水中或濕氣中降解。因此，用1毫升芝麻油(SigmaInc.)稀釋100毫克GTG(Sigma，Inc.)，并采用Brecher等人(Brechere G.和Waxler，S.H.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，70498-501(1949))的相同方法來給予適量的GTG。
將小鼠分成測試組(20只小鼠)和對照組(4只小鼠)，將25毫升GTG注射入測試組，而對照組不注射。
在實驗前測定測試組小鼠的體重，選出體重偏差不明顯的小鼠用來進行實驗。注射GTG后1周測得的小鼠體重在26.5至29.5克范圍內(nèi)。
注射GTG組的7只小鼠被誘發(fā)肥胖，而其余的小鼠則沒有變胖。給沒有誘發(fā)變胖的小鼠再次注射GTG，然后所有的小鼠被誘發(fā)變胖。
將所有誘導(dǎo)變胖的小鼠分成3組。第二次注射GTG后一周，用實施例3步驟2中的方法將PB14肽注射入由7只小鼠組成的測試組1的小鼠中。另外，在3組的另一組小鼠(測試組2，有7只小鼠)中注射卵白蛋白代替PB14肽作為模擬實驗，還有一組(測試組3，有6只小鼠)不注射疫苗以誘導(dǎo)肥胖。另一方面，將0.2毫升PBS注射入對照組中，與測試組比較，以確認本發(fā)明疫苗的效果。
另外，將這里所用的飼料與蛋黃混合并在50℃下干燥，以誘導(dǎo)膽固醇的攝取，從而使小鼠血清中的膽固醇水平升高。提供足量的飼料，以引起與膽固醇水平相關(guān)的疾病。每日測定小鼠體重。
如圖10所示，在注射GTG 12周后，測試組1(-▲-▲-)的注射疫苗的小鼠的體重從27.7±0.4克增加至52.2±1.7克。從該數(shù)據(jù)得出結(jié)論，測試組1與對照組(-○-○-)之間體重增加沒有顯著差別。然而，肥胖后注射了卵白蛋白的測試組2(-●-●-)和誘導(dǎo)肥胖后不注射疫苗的測試組(-■-■-)的小鼠體重從28.3±0.5克持續(xù)增加至68.9±2.8克。因此，確認通過注射PB14肽疫苗能抑制肥胖。
在圖10中，G1和G2代表GTG注射的時間，V1，V2和V3代表PB14肽疫苗的注射時間。
圖11顯示了誘導(dǎo)產(chǎn)生肥胖的小鼠的外觀。將測試組1的20周齡小鼠(圖11a正常小鼠)和測試組3的20周齡小鼠(圖11b肥胖的小鼠)相比較。如圖11所示，確認本發(fā)明的疫苗可有效地抑制肥胖。
步驟2測定血中膽固醇的水平在第一次注射GTG后，將對照組的12周齡小鼠的血液膽固醇水平與測試組1和2的注射了GTG的12周齡小鼠的血液膽固醇水平比較。用Cholestezyme-V，Triglyzyme-V，HDL-C555(Shin Yang Chemicals，Seoul，Korea)和LDL-EX試劑盒(DenkaBio-Research，Ltd.，Tokyo，Japan)，通過酶促方法測定總膽固醇、甘油三酯、HDL-膽固醇和LDL-膽固醇的濃度。在每個實驗中，用標準的標定器-D(Denka Bio-Research，Ltd.，Tokyo，Japan)獲得O.D值的標準曲線，以減少實驗誤差。根據(jù)標定曲線計算出感興趣的O.D值，以確認脂質(zhì)的濃度和含量，其結(jié)果顯示在表1和圖12中。

如表1和圖12所示，肥胖誘導(dǎo)的結(jié)果確證測試組的膽固醇含量沒有顯著差別，而總膽固醇、HDL-C以及LDL-C的總血液濃度少量增加(圖12)。
工業(yè)實用性本發(fā)明的含有載脂蛋白B-100表位的模擬肽、其多聯(lián)體和修飾肽的疫苗組合物能抑制肥胖的發(fā)生而不引起生物體內(nèi)的自身免疫。
因此，用本發(fā)明的疫苗能比暫時性的且成本高的抑制膽固醇代謝有關(guān)酶的常規(guī)方法更有效地治療與LDL有關(guān)的循環(huán)疾病。
盡管本發(fā)明參照其具體實施例作了特別的說明和描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，在不脫離所附權(quán)利要求所確定的本發(fā)明宗旨和范圍內(nèi)可以有各種形式和細節(jié)上的變化。
序列表序列表<110>金曉駿<120>載脂蛋白B-100表位的模擬肽、其多聯(lián)體和修飾肽，以及含有這些肽的疫苗組合物<130>SJPA0103PCT<150>KR10-2000-0052055<151>2000-09-04<160>16<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>載脂蛋白B-100的模擬肽<400>1Arg Asn Val Pro Pro Ile Phe Asn Asp Val Tyr Trp Ile Ala Phe1 5 10 15<210>2<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>載脂蛋白B-100的模擬肽<400>2Arg Phe Arg Gly Leu Ile Ser Leu Ser Gln Val Tyr Leu Asp Pro1 5 10 15<210>3<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>載脂蛋白B-100的模擬肽<400>3Ser Val Cys Gly Cys Pro Val Gly His His Asp Val Val Gly Leu1 5 10 15<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>構(gòu)建BL或LB盒的寡核苷酸<400>4tcgaccgtaa tgttcctcct atc 23<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>構(gòu)建BL或LB盒的寡核苷酸<400>5atcattgaag ataggaggaa cattacgg 28<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>構(gòu)建LB盒的寡核苷酸<400>6ttcaatgatg tttattggat tgcattcta 29<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>構(gòu)建LB盒的寡核苷酸<400>7agcttagaat gcaatccaat aaac 24<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>構(gòu)建BL盒的寡核苷酸<400>8ttcaatgatg tttattggat tgcattcc 28<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>構(gòu)建BL盒的寡核苷酸<400>9tcgaggaatg caatccaata aac 23<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>前導(dǎo)盒的上鏈<400>10gatccgatga tgatgacaag atcg 24<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>前導(dǎo)盒的下鏈<400>11tcgacgatct tgtcatcatc atcg24<210>12<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>腸激酶切割位點<400>12Asp Asp Asp Asp Lys Ile1 5<210>13<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>LB盒的上鏈<400>13tcgaccgtaa tgttcctcct atcttcaatg atgtttattg gattgcattc ta52<210>14<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>LB盒的下鏈<400>14agcttagaat gcaatccaat aaacatcatt gaagatagga ggaacattac gg52<210>15<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>BL盒的上鏈<400>15tcgaccgtaa tgttcctcct atcttcaatg atgtttattg gattgcattc c51<210>16<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>BL盒的下鏈<400>16tcgaggaatg caatccaata aacatcattg aagataggag gaacattacg g5權(quán)利要求
1.一種如SEQ ID NO1所示的載脂蛋白B-100表位的模擬肽及其多聯(lián)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的模擬肽的多聯(lián)體，其中所述多聯(lián)體包含1-15個所述模擬肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的模擬肽的多聯(lián)體，其中所述多聯(lián)體包含4個串聯(lián)連接的所述模擬肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的模擬肽及其多聯(lián)體，其中所述模擬肽的氨基酸序列用選自增加、缺失和化學取代的方法來進行修飾。
5.一種如SEQ ID NO2所示的載脂蛋白B-100表位的模擬肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的模擬肽，其中所述多聯(lián)體包含1-15個所述模擬肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的模擬肽多聯(lián)體，其中所述多聯(lián)體包含4個串聯(lián)連接的所述模擬肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的模擬肽，其中所述模擬肽的氨基酸序列用選自增加、缺失和化學取代的方法來修飾。
9.一種如SEQ ID NO3所示的載脂蛋白B-100表位的模擬肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的模擬肽的多聯(lián)體，其中所述多聯(lián)體包含1-15個所述模擬肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的模擬肽的多聯(lián)體，其中所述多聯(lián)體包含4個串聯(lián)連接的所述模擬肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的模擬肽，其中所述模擬肽的氨基酸序列用選自增加、缺失和化學取代的方法來進行修飾。
13.一種治療肥胖的疫苗組合物，它包含選白SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示的載脂蛋白B-100表位的模擬肽、其多聯(lián)體和修飾肽的肽以及這些肽的混合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的疫苗組合物，所述疫苗組合物用皮內(nèi)注射來給藥。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的疫苗組合物，其中所述疫苗組合物的類型選自片劑、丸劑、顆粒劑、扁囊劑、酏劑、懸浮劑、乳劑、溶液、糖漿、氣溶膠、軟或硬的明膠膠囊、可注射的無菌液體和無菌粉末。
16.一種制備載脂蛋白B-100表位的模擬肽、其多聯(lián)體和修飾肽的方法，該方法包括i)將編碼SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示的載脂蛋白B-100表位的模擬肽、其多聯(lián)體和修飾肽的遺傳信息的DNA插入載體的步驟；ii)用步驟i)所得載體轉(zhuǎn)化宿主細胞并培育該宿主細胞的步驟；iii)從宿主細胞中分離出所述載脂蛋白B-100表位的模擬肽、其多聯(lián)體和修飾肽的步驟。
17.一種DNA，它編碼由4個SEQ ID NO1所示的載脂蛋白B-100表位的模擬肽串聯(lián)連接組成的多肽。
18.一種表達載體，它包含編碼由4個SEQ ID NO1所示的載脂蛋白B-100表位的模擬肽串聯(lián)連接組成的多肽的DNA片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及用來治療肥胖的疫苗組合物。更具體地說，本發(fā)明涉及載脂蛋白B－100表位的模擬肽、其多聯(lián)體和修飾肽，以及包含這些肽的疫苗組合物。
文檔編號C07K14/775GK1392798SQ01803057
公開日2003年1月22日 申請日期2001年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月4日
發(fā)明者金曉駿, 丁海重 申請人:金曉駿