一種雞載脂蛋白aⅱ的分離純化及鑒定方法
【專利摘要】一種雞載脂蛋白AⅡ的分離純化及鑒定方法，它涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，它的分離純化方法為：雞血清的收集，HDL粗品的制備，HDL粗制品的脫脂，脫脂HDL的溶解，脫脂HDL溶液的透析和濃縮，載脂蛋白AⅡ的提取，DEAESepharoseCL-6B柱層析，SephadexG-150柱層析，上述方法準(zhǔn)備SephadexG-150層析柱，之后將過(guò)DEAESepharoseCL-6B后含有apoAⅡ的蛋白溶液加至凝膠柱的上方，待蛋白液與膠體齊平后用洗脫液進(jìn)行洗脫，用蔗糖進(jìn)行濃縮后存待分析。它方法簡(jiǎn)單，實(shí)用性強(qiáng)，幫助人們進(jìn)一步的了解apoAⅡ的生理功能，使它能應(yīng)用在流行病學(xué)和臨床研究中。
【專利說(shuō)明】一種雞載脂蛋白A II的分離純化及鑒定方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種雞載脂蛋白A II的分離純化及鑒定方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
載脂蛋白A II的研究程度不如載脂蛋白A I。它也是血清高密度脂蛋白中第二種主要的載脂蛋白，約占高密度脂蛋白中蛋白總量的20?25%。在HDL2中占15%，而在HDL3中占25%。在乳糜微粒中它的含量可達(dá)總載脂蛋白的7?10%。在極低密度脂蛋白中也有少量apoA II存在。血清中apoA II的濃度也較高,僅次于apoA I (1.00?1.50g/L)和apoBlOO (0.8?1.00g/L)為:0.35?0.50g/L。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，apoA II也主要由肝臟及小腸合成，是由77個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，常以二聚體形式存在，分子量大概為8，700da,等電點(diǎn)為5.05。
[0003]ApoA II的生理功能到目前為止還沒(méi)有完全闡明，除參與維持HDL的結(jié)構(gòu)外，可能還具有抑制卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)活性的功能，從而阻礙細(xì)胞內(nèi)膽固醇的運(yùn)出，酯化和轉(zhuǎn)移。亦有人認(rèn)為apoA II還參與肝臟甘油三脂脂肪酶的激活。同時(shí)還有助于HDL受體的識(shí)別和低密度脂蛋白(LDL)受體的調(diào)節(jié)，因此，apoA II在脂代謝調(diào)控中起著十分重要的作用。此外，還有報(bào)道:apoA II可部分拮抗低密度脂蛋白對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用，從而保持內(nèi)皮細(xì)胞膜的完整性。在人類醫(yī)學(xué)界，大量流行病學(xué)和臨床研究表明:血清中apoA II的含量與冠心病和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生率呈顯著負(fù)相關(guān)，因此雞載脂蛋白A II研究具有重要的意義。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的是提供一種雞載脂蛋白A II的分離純化及鑒定方法，它方法簡(jiǎn)單，操作方便，實(shí)用性強(qiáng)，幫助人們進(jìn)一步的了解apoA II的生理功能，使它能應(yīng)用在流行病學(xué)和臨床研究中。
[0005]為了解決【背景技術(shù)】所存在的問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:它的分離純化方法為:
I雞血清的收集:翅下靜脈采血,采血后,拿去針頭,輕輕注入試管中。為防止血細(xì)胞的破裂，清洗干凈和消毒好的注射器和試管預(yù)先用0.85%生理鹽水浸潤(rùn)，防止血凝塊與玻璃管壁粘連，造成血清析出不良。試管45°角靜置37°C溫箱I h，再置4°C冰箱內(nèi)靜置3?4h，待血液凝固血塊收縮后用毛細(xì)滴管吸取血清，再以100Xg離心10 min，取上清血清分裝后置-20°C冰箱中加NaN3保存?zhèn)溆谩?br> [0006]2 HDL粗品的制備一磷鎢酸沉淀法:取血清1.0 ml加入1.0 ml沉淀劑I，混勻，靜置10 min, 100Xg離心15 min,吸出上清約1.8 ml加入0.42 ml沉淀劑II,混勻，靜置 5 min, 1000 X g 離心 1min 棄上清，沉淀溶于 0.1 ml 12% NaCl 及 1.0 ml 0.02mol/LTris-HCl液中，加入0.26 ml沉淀劑II靜置5 min, 1000 Xg離心1min棄上清,對(duì)沉淀進(jìn)行重復(fù)溶解，沉淀和再溶解過(guò)程一次，最后得到含有HDL的粗制品溶液。
[0007]3 HDL粗制品的脫脂:將所制得HDL溶液在不斷攪拌有機(jī)溶劑的情況下，用移液槍緩慢滴入待脫脂的HDL溶液，HDL溶液逐滴加入于60 ml丙酮/乙醇混合有機(jī)溶液中后，-20°C脫脂2.5h，1000Xg離心15 min棄上清，再同樣條件下再脫脂一次，_20°C冰箱中
2.5h后1000 Xg離心15 min棄上清，最后加入50 ml乙醚脫脂2.5 h離心棄上清所得白色沉淀為脫脂后HDL制品。
[0008]4脫脂HDL的溶解:將脫脂后的HDL溶于100ml 6mol/L尿素-10mmol/LTris-HCl-10mmol/L 二硫蘇糖醇溶液中，4°C過(guò)夜。
[0009]5脫脂HDL溶液的透析和濃縮:將上述HDL溶液對(duì)6mol/L尿素-10mmol/LTris-HCl -lmmol/L EDTA pH:8.0溶液進(jìn)行透析，以除去其中的有機(jī)溶劑，之后用50%的聚乙二醇6000濃縮至2?3 ml以提高HDL溶液的濃度。
[0010]6載脂蛋白A II的提取:
6.1 DEAE Sepharose CL-6B 柱層析:柱床體積 1.5X40 cm , DEAE Sepharose CL-6B裝柱后用0.03 mo I/L Tri s-6 mol/L(pH:8.0)溶液平衡，樣品約10 ml上柱后，先用相當(dāng)于兩倍床體積的0.03mol/L Tris-6mol/L洗柱,然后用O?0.5 mol/L NaCl進(jìn)行梯度洗脫,洗速 lml/min,每管收集 6ml,梯度液成分:A 液 0.03mol/L Tris-HCL- 6mol/LUrea (pH:8.0)500mlo B 液:0.03mol/LTris-HCL-6mol/L Urea 0.5mol/L NaCl (pH:8.0) 500ml, 280 nm紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，流速3 ml/h，6ml每管部分收集，合并各峰頂附近幾管，用蔗糖進(jìn)行濃縮后-20°C冰箱貯存待分離。
[0011]6.2 Sephadex G-150柱層析:上述方法準(zhǔn)備Sephadex G-150層析柱,之后將過(guò)DEAE Sepharose CL-6B后含有apoA II的蛋白溶液2?3 ml加至凝膠柱的上方，待蛋白液與膠體齊平后用洗脫液進(jìn)行洗脫，流速9 ml/h，每管3 ml, 280 nm紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，合并各峰頂附近幾管，用蔗糖進(jìn)行濃縮后-20 V冰箱貯存待分析。
[0012]7它的鑒定方法方法為:采用Urea-SDS-PAGE電泳對(duì)apoA II純度進(jìn)行鑒定:分離膠:T=15%、C=2.6% pH:8.8，水用 8 mol/L 的尿素代替；濃縮膠:T=5% C=2.6% pH:6.8。電極緩沖液I L中含有3g Tris, 14.4g甘氨酸，Ig SDS, pH:8.3。開(kāi)始電泳時(shí)濃縮膠使用160V穩(wěn)壓，進(jìn)入分離膠后使用320V穩(wěn)壓，當(dāng)溴酚蘭遷移帶到達(dá)電泳槽底部時(shí)，關(guān)閉電源，小心取出電泳膠后在預(yù)熱60°C的0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中染色10 min,隨之用脫色液多次更換加熱脫色至背景干凈為止。
[0013]所述沉淀劑I 是將磷鶴酸 0.44g, MgCl2.6H20 1.1 g, I mol/L NaOH 1.3 ml,雙蒸水加至100 ml，混勻，調(diào)節(jié)pH為6.2。
[0014]所述的沉淀劑II 是將磷鎢酸 4.4 g，MgCl2.6Η20 11.0 g，lmol/L NaOH 13.0 ml,雙蒸水加至100 ml,混勻，調(diào)節(jié)pH為6.2。
[0015]所述的脫色液是將250 ml 95%乙醇,80 ml冰醋酸用蒸懼水加至1000 ml配制而成。
[0016]本發(fā)明具有以下有益效果:它方法簡(jiǎn)單，操作方便，實(shí)用性強(qiáng)，幫助人們進(jìn)一步的了解apoA II的生理功能，使它能應(yīng)用在流行病學(xué)和臨床研究中。
[0017]【具體實(shí)施方式】:
本【具體實(shí)施方式】采取以下技術(shù)方案，它的分離純化方法為:
I雞血清的收集:翅下靜脈采血,采血后,拿去針頭,輕輕注入試管中。為防止血細(xì)胞的破裂，清洗干凈和消毒好的注射器和試管預(yù)先用0.85%生理鹽水浸潤(rùn)，防止血凝塊與玻璃管壁粘連，造成血清析出不良。試管45°角靜置37°C溫箱I h，再置4°C冰箱內(nèi)靜置3?4h，待血液凝固血塊收縮后用毛細(xì)滴管吸取血清，再以100Xg離心10 min，取上清血清分裝后置-20°C冰箱中加NaN3保存?zhèn)溆谩?br> [0018]2 HDL粗品的制備一磷鎢酸沉淀法:取血清1.0 ml加入1.0 ml沉淀劑I，混勻，靜置10 min, 100Xg離心15 min,吸出上清約1.8 ml加入0.42 ml沉淀劑II,混勻，靜置 5 min, 1000 X g 離心 1min 棄上清，沉淀溶于 0.1 ml 12% NaCl 及 1.0 ml 0.02mol/LTris-HCl液中，加入0.26 ml沉淀劑II靜置5 min, 1000 Xg離心1min棄上清,對(duì)沉淀進(jìn)行重復(fù)溶解，沉淀和再溶解過(guò)程一次，最后得到含有HDL的粗制品溶液。
[0019]3 HDL粗制品的脫脂:將所制得HDL溶液在不斷攪拌有機(jī)溶劑的情況下，用移液槍緩慢滴入待脫脂的HDL溶液，HDL溶液逐滴加入于60 ml丙酮/乙醇混合有機(jī)溶液中后，_20°C脫脂2.5h，100Xg離心15 min棄上清，再同樣條件下再脫脂一次，_20°C冰箱中
2.5h后1000 Xg離心15 min棄上清，最后加入50 ml乙醚脫脂2.5 h離心棄上清所得白色沉淀為脫脂后HDL制品。
[0020]4脫脂HDL的溶解:將脫脂后的HDL溶于100ml 6mol/L尿素-lOmmol/LTris-HCl-10mmol/L 二硫蘇糖醇溶液中，4°C過(guò)夜。
[0021]5脫脂HDL溶液的透析和濃縮:將上述HDL溶液對(duì)6mol/L尿素-10mmol/LTris-HCl -lmmol/L EDTA pH:8.0溶液進(jìn)行透析，以除去其中的有機(jī)溶劑，之后用50%的聚乙二醇6000濃縮至2?3 ml以提高HDL溶液的濃度。
[0022]6載脂蛋白A II的提取:
6.1 DEAE Sepharose CL-6B 柱層析:柱床體積 1.5 X 40 cm,DEAE Sepharose CL-6B裝柱后用0.03 mol/L Tris-6 mol/L溶液平衡,樣品約1ml上柱后,先用相當(dāng)于兩倍床體積的0.03 mol/L Tris-6 mol/L洗柱,然后用O?0.5 mol/L NaCl進(jìn)行梯度洗脫，洗速I ml/min,每管收集 6 ml，梯度液成分:A 液 0.03 mol/L Tris-HCL_6mol/L Urea 500 ml, B 液:280 nm紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，流速3 ml/h，6ml每管部分收集，合并各峰頂附近幾管，用蔗糖進(jìn)行濃縮后-20°C冰箱貯存待分離。
[0023]6.2 Sephadex G-150柱層析:上述方法準(zhǔn)備Sephadex G-150層析柱,之后將過(guò)DEAE Sepharose CL-6B后含有apoA II的蛋白溶液2?3 ml加至凝膠柱的上方，待蛋白液與膠體齊平后用洗脫液進(jìn)行洗脫，流速9 ml/h，每管3 ml, 280 nm紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，合并各峰頂附近幾管，用蔗糖進(jìn)行濃縮后-20 V冰箱貯存待分析。
[0024]7它的鑒定方法方法為:采用Urea-SDS-PAGE電泳對(duì)apoA II純度進(jìn)行鑒定:分離膠:T=15%、C=2.6% pH:8.8，水用 8mol/L 的尿素代替；濃縮膠:T=5% C=2.6% ρΗ:6.8，電極緩沖液IL中含有3g Tris，14.4g甘氨酸，Ig SDS，pH:8.3，開(kāi)始電泳時(shí)濃縮膠使用160V穩(wěn)壓，進(jìn)入分離膠后使用320V穩(wěn)壓，當(dāng)溴酚蘭遷移帶到達(dá)電泳槽底部時(shí)，關(guān)閉電源，小心取出電泳膠后在預(yù)熱60°C的0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中染色lOmin，隨之用脫色液多次更換加熱脫色至背景干凈為止。
[0025]所述沉淀劑I 是將磷鶴酸 0.44 g, MgCl2.6Η20 1.1g, I mol/L NaOH 1.3 ml,雙蒸水加至100 ml，混勻，調(diào)節(jié)pH為6.2。
[0026]所述的沉淀劑II 是將磷鎢酸 4.4 g，MgCl2.6Η20 11.0 g，lmol/L NaOH 13.0 ml,雙蒸水加至100 ml,混勻，調(diào)節(jié)pH為6.2。
[0027]所述的脫色液是將250 ml 95%乙醇，80 ml冰醋酸用蒸餾水加至1000 ml配制而成。
[0028]本【具體實(shí)施方式】具有以下有益效果:它方法簡(jiǎn)單，操作方便，實(shí)用性強(qiáng)，幫助人們進(jìn)一步的了解apoA II的生理功能，使它能應(yīng)用在流行病學(xué)和臨床研究中。
【權(quán)利要求】
1.一種雞載脂蛋白A II的分離純化及鑒定方法，其特征在于它的分離純化方法為:(1)雞血清的收集:翅下靜脈采血,采血后，拿去針頭,輕輕注入試管中。
2.為防止血細(xì)胞的破裂，清洗干凈和消毒好的注射器和試管預(yù)先用0.85%生理鹽水浸潤(rùn)，防止血凝塊與玻璃管壁粘連，造成血清析出不良。
3.試管45°角靜置37°C溫箱1h，再置4°C冰箱內(nèi)靜置3?4 h，待血液凝固血塊收縮后用毛細(xì)滴管吸取血清，再以lOOOXg離心10 min，取上清血清分裝后置-20°c冰箱中加NaN3保存?zhèn)溆茫? (2)HDL粗品的制備一磷鎢酸沉淀法:取血清1.0 ml加入1.0 ml沉淀劑I，混勻，靜置10 min, lOOOXg離心15 min,吸出上清約1.8 ml加入0.42 ml沉淀劑II,混勻，靜置5 min,lOOOXg離心 lOmin棄上清，沉淀溶于0.1 ml 12% NaCl 及 1.0 ml 0.02mol/L Tris-HCl 液中，加入0.26 ml沉淀劑II靜置5 min, 1000 X g離心lOmin棄上清,對(duì)沉淀進(jìn)行重復(fù)溶解，沉淀和再溶解過(guò)程一次，最后得到含有HDL的粗制品溶液； (3)HDL粗制品的脫脂:將所制得HDL溶液在不斷攪拌有機(jī)溶劑的情況下，用移液槍緩慢滴入待脫脂的HDL溶液，HDL溶液逐滴加入于60 ml丙酮/乙醇，體積比為1:1混合液中，_20°C脫脂2.5h，lOOOXg離心15 min棄上清，再同樣條件下再脫脂一次，_20°C冰箱中2.5 h后lOOOXg離心15 min棄上清，最后加入50 ml乙醚脫脂2.5 h離心棄上清所得白色沉淀為脫脂后HDL制品； (4)脫脂HDL的溶解:將脫脂后的HDL溶于100ml6mol/L尿素-lOmmol/LTris-HCl-10mmol/L 二硫蘇糖醇溶液中，4°C過(guò)夜； (5)脫脂HDL溶液的透析和濃縮:將上述HDL溶液對(duì)6mol/L尿素-10mmol/LTris-HCl-lmmol/L EDTA pH:8.0溶液進(jìn)行透析，以除去其中的有機(jī)溶劑，之后用50%的聚乙二醇6000濃縮至2?3 ml以提高HDL溶液的濃度； (6)載脂蛋白AII的提取:DEAE Sepharose CL-6B柱層析:柱床體積1.5X40 cm，DEAESepharose CL-6B裝柱后用0.03 mol/L Tris-6 mol/L溶液平衡,樣品約10ml上柱后，先用相當(dāng)于兩倍床體積的0.03 mol/L Tris-6 mol/L洗柱,然后用0?0.5 mol/L NaCl進(jìn)行梯度洗脫，洗速1 ml/min，每管收集6 ml，梯度液成分:A液0.03 mol/L Tris-HCL-6 mol/L Urea 500 ml，B液:280 nm紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，流速3 ml/h，6ml每管部分收集，合并各峰頂附近幾管，用蔗糖進(jìn)行濃縮后_20°C冰箱貯存待分離；Sephadex G-150柱層析:上述方法準(zhǔn)備Sephadex G-150層析柱，之后將過(guò)DEAE Sepharose CL-6B后含有apoA II的蛋白溶液2?3 ml加至凝膠柱的上方，待蛋白液與膠體齊平后用洗脫液進(jìn)行洗脫，流速9 ml/h，每管3 ml, 280 nm紫外檢測(cè)儀檢測(cè)，合并各峰頂附近幾管，用蔗糖進(jìn)行濃縮后-20°C冰箱貯存待分析。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種雞載脂蛋白AII的分離純化及鑒定方法，其特征在于它的鑒定方法方法為:采用Urea-SDS-PAGE電泳對(duì)apoA II純度進(jìn)行鑒定:分離膠:T=15%、C=2.6% pH:8.8，水用8mol/L的尿素代替；濃縮膠:T=5% C=2.6% pH:6.8，電極緩沖液1L中含有3g Tris，14.4g甘氨酸，lg SDS，pH: 8.3，開(kāi)始電泳時(shí)濃縮膠使用160V穩(wěn)壓，進(jìn)入分離膠后使用320V穩(wěn)壓，當(dāng)溴酚蘭遷移帶到達(dá)電泳槽底部時(shí)，關(guān)閉電源，小心取出電泳膠后在預(yù)熱60°C的0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中染色lOmin，隨之用脫色液多次更換加熱脫色至背景干凈為止。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種雞載脂蛋白AII的分離純化及鑒定方法，其特征在于所述沉淀劑 I 是將磷鶴酸 0.44g, MgCl2.6H20 1.lg, lmol/L NaOH 1.3ml,雙蒸水加至 100ml,混勻，調(diào)節(jié)pH為6.2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種雞載脂蛋白AII的分離純化及鑒定方法，其特征在于所述的沉淀劑 II 是將磷鎢酸 4.4 g, MgCl2.6H20 11.0g, lmol/L NaOH 13.0 ml，雙蒸水加至 100ml，混勻，調(diào)節(jié)pH為6.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種雞載脂蛋白AII的分離純化及鑒定方法，其特征在于所述的脫色液是將250 ml 95%乙醇，80 ml冰醋酸用蒸餾水加至1000 ml配制而成。
【文檔編號(hào)】G01N27/447GK104250300SQ201310262395
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2013年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月27日
【發(fā)明者】胡國(guó)良, 曹華斌, 郭小權(quán), 張彩英, 俞海峰 申請(qǐng)人:胡國(guó)良