專利名稱：人載脂蛋白B100(Apo-B100)ELISA試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測人載脂蛋白B100的試劑
品.o
背景技術(shù)：
酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)是以免疫學(xué) 反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏 感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體——聚苯乙烯微量滴定板的 孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而有效的保證試 驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。肝臟合成的載脂蛋白BlOO(Apo-BlOO)是人血漿中低密度脂蛋白(LDL)及極低密 度脂蛋白(VLDL)的主要載脂蛋白。大量臨床研究指出，高水平的ApO-B100是提示動(dòng)脈粥 樣硬化、冠心病及腦血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素。特別是在冠心病易患性的預(yù)測上，ApO-B100 的測定比總膽固醇和LDL-C的測定更好。傳統(tǒng)的檢測ApO-B100的方法有比濁測定法、火箭免疫電泳測定法、放射性免疫擴(kuò) 散法(RID)等。其中比濁測定法是目前應(yīng)用于載脂蛋白定量測定的比較普遍的方法，主要 有兩類散射比濁法和透射比濁法。這兩種方法都可以測ug/ml以上的含量，操作簡便、快 速，但需要特殊的激光濁度計(jì)或全自動(dòng)生化分析儀，一次性投資大，價(jià)格昂貴，不適合一般 實(shí)驗(yàn)室使用；火箭電泳法操作比較復(fù)雜，并且由于其是通過測量火箭峰的高度或面積來進(jìn) 行定量，所以誤差較大，并且穩(wěn)定性也較差，臨床使用較少；由于放射免疫分析是競爭性的 反應(yīng)，使用RID法時(shí)被測物和標(biāo)準(zhǔn)物不能全部參與反應(yīng)，測得的值是相對(duì)量而非絕對(duì)量，而 且RID法存在放射性同位素半衰期短，放射性污染不易保存，穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，使用中有諸 多不便。ELISA法是免疫學(xué)檢測中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于多種病原微生物所引起 的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷，也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原 的定量測定。ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)，不僅適用 于臨床標(biāo)本的檢驗(yàn)，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百份甚至上千份樣品，因此特別適用于 血清流行病學(xué)的研究。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型要解決的技術(shù)問題是本試劑盒采用ELISA方法檢測血清中的 Apo-B100含量，而且在傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)基礎(chǔ)上采用了生物素-親和素放大系統(tǒng)，顯著提高 了 ApO-B100檢測的靈敏度。為了解決上述技術(shù)問題，本實(shí)用新型所采用的技術(shù)方案是一種人載脂蛋白 B100 (Apo-B100) ELISA試劑盒，包括酶標(biāo)板，所述酶標(biāo)板包括固相載體和包被層，所述固相 載體為設(shè)置有多個(gè)微孔的微孔板，所述包被層附著在所述固相載體的微孔表面，所述包被層是由人載脂蛋白B100單克隆抗體涂布在微孔上形成的。優(yōu)選的，所述固相載體為96孔聚苯乙烯試劑板(PS)。優(yōu)選的，所述固相載體為48孔聚苯乙烯試劑板(PS)。優(yōu)選的，所述固相載體為60孔聚苯乙烯試劑板(PS)。本試劑盒是利用ELISA方法來檢測人血清中的Apo-BlOO，與傳統(tǒng)方法相比，ELISA 法敏感性高、穩(wěn)定性好、操作簡便，且成本較低。

圖1為本實(shí)用新型一具體實(shí)施例試劑盒的酶標(biāo)板沿著一列微孔的縱剖示意圖。1固相載體微孔，2包被層。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員 可以更好的理解本實(shí)用新型并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本實(shí)用新型的限定。試劑盒的酶標(biāo)板包括固相載體和包被層。如圖1所示，固相載體上有微孔1，包被 層2附著在微孔1上。包被層是由人Apo-BlOO單克隆抗體涂布在微孔上形成的。固相載 體采用60孔聚苯乙烯試劑板(PS)，即固相載體上每列有5個(gè)微孔，一共12列。當(dāng)然也可采 用90或48孔聚苯乙烯試劑板(PS)或其他材料的試劑板。該具體實(shí)施例的試劑盒制備方法是采用聚苯乙烯試劑板作為固相載體，在試劑 板微孔條上先包被一定濃度的人Apo-BlOO單克隆抗體，4°C過夜，經(jīng)洗板后制成包被好的 酶標(biāo)板，以備標(biāo)本檢測。分別以生物素化兔抗人Apo-BlOO多克隆抗體，辣根過氧化物酶 (HRP)標(biāo)記的親和素作為檢測試劑A及B，以3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)及硫酸分 別作為底物及終止液。經(jīng)過對(duì)試劑盒一系列的質(zhì)量指標(biāo)檢測，包括靈敏度、重復(fù)性、特異性、回收率及線 性測定，表明該檢測體系成熟，本實(shí)用新型試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果1.標(biāo)準(zhǔn)曲線
濃度(ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)品OD值OD值平均值校正值00.0980.0740.086--1.560.4150.1230.2690.1833.120.6090.2450.4270.3416.250.7750.3650.570.48412.50.9490.5290.7390.653251.146—0.8080.9770.891501.4581.3261.3921.3061002.0542.1172.0312.靈敏度與比濁法lug/ml的最低檢測限相比，ELISA法檢測人血清標(biāo)本時(shí)最低 檢測限為0. 45ng/ml，極大地提高了靈敏度；3.回收率用同一血清樣本分別添加不同量的定值標(biāo)準(zhǔn)品，作回收試驗(yàn)(n = 5)。 平均回收率98. 56% (表1)。
4[0022] 表1ELISA法測定Apo-B100的回收試驗(yàn)
定值標(biāo)準(zhǔn)品(ng/ml)回收率(％)10093.3825102.666.2599.64平均回收率98.56因此該試劑盒適用于血清中Apo-BlOO檢測，對(duì)于反映肝病活動(dòng)與否、肝損程度、 肝貯備能力和肝病預(yù)后，有相當(dāng)?shù)呐R床意義和價(jià)值，也對(duì)預(yù)測動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病 極有價(jià)值。下面通過兩個(gè)實(shí)驗(yàn)來檢測本實(shí)用新型試劑盒的質(zhì)量指標(biāo)實(shí)驗(yàn)1 應(yīng)用人血清載脂蛋白B100 (Apo-BlOO)ELISA試劑盒以及大型自動(dòng)生化分 析儀分別定量檢測人定值(2. 53ng/ml)血清標(biāo)本(n = 20)。1、人血清載脂蛋白B100 (Apo-B100) ELISA試劑盒方法操作①將試劑盒平衡至室 溫。②加樣分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢簂OOul，余孔分別加 標(biāo)準(zhǔn)品(Apo-BlOO)或定值樣品lOOul，覆膜，37°C放置2小時(shí)。標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為100ng/ mL, 50ng/mL, 25ng/mL, 12. 5ng/mL, 6. 25ng/mL, 3. 12ng/mL, 1. 56ng/mL。③棄去液體,甩干,每 孔加檢測試劑A工作液lOOul，覆膜，37°C放置1小時(shí)。④棄去孔內(nèi)液體，洗板3次，甩干， 每孔加檢測液試劑B工作液lOOul，覆膜，37°C放置1小時(shí)。⑤棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，甩 干。⑥每孔加TMB溶液90ul，37°C避光顯色30分鐘。依序每孔加終止溶液50ul，用酶聯(lián)儀 在450nm波長測量各孔的光密度(0D值)。2、大型自動(dòng)生化分析儀檢測同一上述血清標(biāo)本按照儀器要求，上樣，運(yùn)行儀器，儀器自動(dòng)打出結(jié)果。3、結(jié)果見表2表2.不同實(shí)驗(yàn)方法檢測結(jié)果比較
定值樣品 測定均值 (mean)相對(duì)誤 差 (%)標(biāo)準(zhǔn)差(SD)變異系數(shù)(CV %)批內(nèi)批間批內(nèi)批間ELISA 法2.541 ng/ml0.4350.1670.1486.485.72生化儀 法低于檢測限實(shí)驗(yàn)2 應(yīng)用人載脂蛋白B100(Apo-B100)ELISA試劑盒以及大型自動(dòng)生化分析儀 分別定量檢測人定值(8. 72ug/ml)血清標(biāo)本(n = 20)。1、方法及操作同實(shí)施例1，但用ELISA方法進(jìn)行檢測時(shí)需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行10，000倍稀釋。2、結(jié)果見表3
5[0036]表3.不同實(shí)驗(yàn)方法檢測結(jié)果比較
權(quán)利要求一種人載脂蛋白B100(Apo B100)ELISA試劑盒，包括酶標(biāo)板，所述酶標(biāo)板包括固相載體和包被層，其特征在于所述固相載體為設(shè)置有多個(gè)微孔的微孔板，所述包被層附著在所述固相載體的微孔表面，所述包被層是由人載脂蛋白B100單克隆抗體涂布在微孔上形成的。
2.如權(quán)利要求1所述的人載脂蛋白B100(Apo-B100)ELISA試劑盒，其特征在于所述 固相載體為96孔聚苯乙烯試劑板。
3.如權(quán)利要求1所述的人載脂蛋白B100(Apo-B100)ELISA試劑盒，其特征在于所述 固相載體為48孔聚苯乙烯試劑板。
4.如權(quán)利要求1所述的人載脂蛋白B100(Apo-B100)ELISA試劑盒，其特征在于所述 固相載體為60孔聚苯乙烯試劑板。
專利摘要本實(shí)用新型涉及檢測人載脂蛋白B100的生物技術(shù)領(lǐng)域，具體提供了一種人載脂蛋白B100(Apo-B100)ELISA試劑盒，包括酶標(biāo)板，其中酶標(biāo)板又包括固相載體和包被層，固相載體為設(shè)置有多個(gè)微孔的微孔板，包被層附著在固相載體的微孔表面，包被層是由人載脂蛋白B100單克隆抗體涂布在微孔上形成的。利用本試劑盒檢測人血清中的Apo-B100，敏感性高、穩(wěn)定性好、操作簡便，且成本較低。
文檔編號(hào)G01N33/544GK201707338SQ20102023614
公開日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月24日
發(fā)明者從旭霞, 何峰容, 汪景, 章秀波, 童曉玲, 馬云芳 申請(qǐng)人:武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司