專利名稱：一種檢測潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶hpt的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶聯(lián)免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycin phosphotransferase，HPT)的免疫檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)基因已成為繼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因后，另一種廣泛使用且更有效的標(biāo)記基因，它可將磷酸基團共價地加到潮霉素B的第四位上，從而使受體細胞產(chǎn)生潮霉素抗性。因此，在轉(zhuǎn)基因植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中，將hpt基因作為選擇標(biāo)記基因與目標(biāo)基因(如Bt和CpTI基因等)一同導(dǎo)入作物，使轉(zhuǎn)化成功的植株產(chǎn)生潮霉素抗性，以有利于轉(zhuǎn)基因作物的篩選。hpt基因是目前最有效的選擇標(biāo)記基因之一，已被廣泛應(yīng)用于抗蟲水稻、玉米、高粱、小麥和棉花等多種轉(zhuǎn)基因作物。據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用理事會最新公布，全世界轉(zhuǎn)基因作物種植面積已由1996年的170萬公頃增至2005年的9000萬公頃。
選擇標(biāo)記基因hpt的食品和環(huán)境安全性，與目標(biāo)基因和報告基因等基因一樣，也需要全面評價。隨著含有hpt基因的轉(zhuǎn)基因作物的增多，這類轉(zhuǎn)基因作物表達的HPT蛋白可能會通過根系分泌、殘枝敗葉等生物廢棄物以及秸稈還田等途徑釋放到環(huán)境中去，成為一種新的環(huán)境外源污染物。若HPT蛋白在環(huán)境中形成大量積累，則可能導(dǎo)致以下三個問題一是可能通過地表徑流等途徑進入水體，或通過食物鏈進入動物和人體，從而使動物體甚至人類對潮霉素及其相似抗生素產(chǎn)生抗藥性；二是可能影響土壤部分可培養(yǎng)微生物的數(shù)量及土壤酶活性，甚至可能改變環(huán)境微生物的群落結(jié)構(gòu)和組成；三是有可能使土壤微生物增加對抗生素的抗性產(chǎn)生超級細菌等。
目前HPT蛋白的檢測主要通過Western雜交、試紙條檢測、聚丙烯酰胺凝膠電泳方法等分析手段，HPT-ELISA檢測方法也曾有人報道過，但是由于檢測極限較高而未能有效地檢測到該蛋白的存在。由于含有hpt基因的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品大規(guī)模的上市，其是否會造成的環(huán)境影響和人類健康的慢性和長期效應(yīng)日益受到人們關(guān)注和擔(dān)憂，對該基因的表達產(chǎn)物的數(shù)量、范圍、指標(biāo)等諸方面都提出了新的要求和更高的標(biāo)準(zhǔn)，傳統(tǒng)方法復(fù)雜繁瑣，樣品前處理過程繁雜，工作量大且儀器昂貴以及分析周期較長。因此，快速簡便的檢測方法很有必要。如何才能快速簡便的檢測選擇標(biāo)記基因表達蛋白已經(jīng)成為人們關(guān)注和迫切需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、一次可測定大量樣品的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。
本發(fā)明的目的是采用這樣的技術(shù)解決方案實現(xiàn)的所述試劑盒由盒體構(gòu)成，在盒體內(nèi)設(shè)置有多孔酶標(biāo)板和試劑，其特征在于所述酶標(biāo)板的每個孔內(nèi)設(shè)有包被抗體，該包被抗體表面由1.0～3.0％牛血清白蛋白封閉，所述試劑包含洗滌液、底物稀釋液、HPT蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、底物和反應(yīng)終止液。
本發(fā)明的優(yōu)點是能用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中hpt基因表達蛋白的檢測，樣品的前處理過程簡單、耗時少，能同時檢測批量的樣品，樣品檢測成本較低、保存期長、靈敏度高，它是一種適用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中HPT蛋白的快速檢測用具。


圖1為HPT-ELISA法HPT標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖2為試劑盒的示意3為多孔酶標(biāo)板示意圖附圖標(biāo)號說明1-盒體，2-酶標(biāo)板，3-洗滌液，4-封閉溶液，5-HPT蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，6-辣根過氧化物酶標(biāo)二抗，7-底物稀釋液(醋酸鈉-檸檬酸緩沖液)，8-30％過氧化氫溶液，9-顯色物質(zhì)TMB，10-反應(yīng)終止液，11-海綿托架。
具體實施例方式
參照圖1、圖2本發(fā)明包括盒體1、在盒體1內(nèi)設(shè)有酶標(biāo)板2，盒體1內(nèi)放置有試劑，在多孔酶標(biāo)板2的每孔內(nèi)，有包被液包被且能與潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶抗原特異性結(jié)合反應(yīng)的包被抗體，用1.0～3.0％牛血清白蛋白進行封閉，所述試劑有PBST濃縮洗滌液3、底物稀釋液7、HPT蛋白標(biāo)準(zhǔn)液5、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗6、30％過氧化氫溶液8、顯色物質(zhì)TMB 9和反應(yīng)終止液10。所述抗體包被緩沖液，采用0.05 M碳酸鹽緩沖液，其pH8.0～10.0由碳酸鈉1.2～2.0g、碳酸氫鈉2.5～3.5g、重蒸水配制而成；所述洗滌液3為含0.01～0.05％Tween-20的磷酸鹽緩沖液(簡稱為PBST)由磷酸二氫鉀0.1～0.3g、磷酸氫二鈉2.0～4.0g、氯化鈉6.0～8.0g、氯化鉀0.2～0.4g、吐溫-20 0.5～1.0mL、3.0～6.0mL 0.5M EDTA和重蒸水配制而成；所述封閉溶液4為含1.0～3.0％牛血清白蛋白BSA的溶液，亦可用于樣品稀釋和檢測抗體稀釋；底物稀釋液7為pH5.5～6.0檸檬酸/醋酸鈉緩沖液，采用醋酸鈉4.0～5.0g、檸檬酸2.0～4.0g和重蒸水配制；所述終止液10采用硫酸溶液；所述酶標(biāo)板2采用96孔的酶標(biāo)板。
在盒體1內(nèi)放置96孔酶標(biāo)板2和試劑后，應(yīng)放在2～6℃貯存，忌0℃以下凍存，有效期可達為12個月；其中96孔酶標(biāo)板2可由塑料支架和可拆分的塑料條組成，酶標(biāo)板2放置在真空袋內(nèi)，所述試劑放置在海綿托架11的凹孔內(nèi)，海綿托架11和包裝好的酶標(biāo)板2均放在盒體1內(nèi)。
本發(fā)明是一種適用于HPT檢測的酶聯(lián)免疫測定試劑盒，它基于免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)，能夠檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的HPT蛋白表達量，其測定原理是采用雙抗體夾心法來檢測潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶HPT，首先將HPT抗體作為包被抗體吸附于固相載體上，經(jīng)洗滌后，加入待測提取樣品和標(biāo)樣蛋白，如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結(jié)合，經(jīng)保溫孵育洗滌后，即可加入酶標(biāo)記特異性抗體，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進行測定，底物降解的量即為欲測抗原的量。
實施例試劑盒檢測潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶HPT的酶聯(lián)免疫檢測方法如下一、特異性抗體(HPT多抗)的制備1、抗原制備，GST-HPT融合蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建和蛋白誘導(dǎo)表達(1)將HPT基因構(gòu)建到pGEX-KG質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到BL21表達菌株中，IPTG37℃誘導(dǎo)表達過夜，收集表達菌體；(2)用緩沖液1×PBS，2mM DTT，2mM EDTA，4℃，超聲破胞3分鐘，12,000g離心，取上清液，過柱純化；(3)脫鹽后，收集濾液，加入終濃度為5.0～8.0μg/ml的thrombin酶(sigma公司產(chǎn)品)酶切過夜；(4)接下來將樣品通過GSTrap FF除去GST片斷，收集流出組份；(5)將流出組份通過HiTrap Q HP柱，通過鹽梯度洗脫，收集目標(biāo)蛋白峰，得到純度為90％以上的純蛋白。
2、免疫動物將2mg HPT純蛋白分四次注射兩只新西蘭雄性成年大白兔。第二次加強免疫兩周后耳部靜脈采血用間接ELISA方法進行效價檢測，效價達到要求，進行最后一次加強免疫，兩周后取全皿，待血液凝固、血塊收縮后，于3000rpm離心15min，取上層血清，純化并分裝得到多克隆抗體，保存于-70℃。
3、抗體保存在-70℃凍存，使用時37℃水浴快速解凍，并4℃離心30分鐘后分裝，4℃保存使用兩個星期左右。
二、酶標(biāo)抗體的制備(用改良過碘酸鈉法將標(biāo)記蛋白HRP耦聯(lián)到純化的兔抗)1、稱取5～8mg HRP溶解于1mL蒸餾水中；2、于上液中加入0.2～0.5mL新配的0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌15～25分鐘；3、將上述溶液裝入透析袋中，用1mM pH4.0～5.0的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜；4、加20μL 0.2M pH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化的HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入5～15mg抗體在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌1～3小時；5、加0.1～0.3ml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4℃2小時；6、將上述液裝入透析袋中，對0.15M pH7.0～8.0 PBS透析，4℃過夜；7、經(jīng)ELISA法測定，標(biāo)記好的檢測抗體效價為1∶100,000。
三、包被酶標(biāo)板的制備1、包被抗體用pH8.0～10.0抗體包被緩沖液0.05 M碳酸鹽緩沖液稀釋至3～6μg/mL；2、在酶標(biāo)板2的每孔加50μL，將酶標(biāo)板2封好防止蒸發(fā)，在37℃孵育過夜；3、甩干每一板孔并加PBST洗滌液3洗滌，重復(fù)3次。每孔加400μL徹底洗滌。要求每步完全移出孔中的液體，將酶標(biāo)板2中液體移出并將酶標(biāo)板2在干凈的紙巾上拍干；4、然后在酶標(biāo)板2的每孔中加入300μL 1.0～3.0％BSA溶液封板，37℃至少孵育2小時，可4℃放置2～4天，隨時使用。
四、檢測樣品的前處理1、水樣過濾后即可取樣進行ELISA分析2、植物葉片和根系組織地上部和根系剪成小段，分別放入微型植物試樣粉碎機中，用液氮冷凍后磨粉，裝入封口袋中放入-70℃超低溫冰箱中備用；分別稱取100.0mg已磨好的地上部和根系粉于5mL離心管中，按0.1g∶1mL比例加入1.0mLHPT蛋白提取液(50～100mM Tris-HCl+10％甘油+5～10mMDTT+0.1～0.5％PMSF+0.05～0.2％ Triton X-100)，室溫振蕩1h，15,000g離心，5～10min后取上清，取上清液，重復(fù)提取3次，合并上清液，進行ELISA分析。
3、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品取樣品1.0g磨成粉末后，按上述比例加入1.0mL蛋白提取液，室溫振蕩1h，15,000g離心5min后取上清，重復(fù)提取3次，合并上清液，冷凍濃縮后，進行ELISA分析。
五、試劑盒檢測操作過程1、使用樣品稀釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品HPT(20ng/mL～0.3ng/mL)，樣品和標(biāo)準(zhǔn)液采用同樣的緩沖液制備和稀釋；2、每孔加50μL適當(dāng)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品/樣品/空白對照，輕輕敲打板子1分鐘，貼上封板膜，37℃孵育2～3小時；3、重復(fù)步驟2。每孔加50μL經(jīng)過適當(dāng)稀釋的檢測抗體，貼上新的封板膜，37℃孵育2～3小時；4、重復(fù)步驟2兩次。每孔加100μL底物反應(yīng)液，避光，37℃孵育15～30分鐘進行顯色反應(yīng)；5、每孔加50μL終止液，在15～30分鐘內(nèi)在酶標(biāo)儀上測OD450；6、數(shù)據(jù)分析和計算比較酶標(biāo)抗體組成的反應(yīng)系統(tǒng)的檢測效，每次操作時均以不同濃度的HPT蛋白為陽性對照，以BSA蛋白為陰性對照。
權(quán)利要求
1.一種檢測潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶HPT的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，所述試劑盒由盒體構(gòu)成，在盒體內(nèi)設(shè)置有多孔酶標(biāo)板和試劑，其特征在于所述酶標(biāo)板的每個孔內(nèi)設(shè)有包被抗體，該包被表面由1.0～3.0％牛血清白蛋白封閉，所述試劑有洗滌液、底物稀釋液、HPT蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、底物、顯色物質(zhì)和反應(yīng)終止液。
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶HPT的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所說的包被抗體為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶HPT抗體。
3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶HPT的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所說的抗體緩沖液為碳酸鹽緩沖溶液，由碳酸鈉1.2～2.0g、碳酸氫鈉2.5～3.5g、重蒸水配制而成。
4.如權(quán)利要求1所述的一種適用于潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶HPT分析的免疫檢測試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)抗體為辣根過氧化物酶兔抗抗體。
5.如權(quán)利要求1所述的一種檢測潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶HPT的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述洗滌液為磷酸鹽緩沖液(簡稱為PBST)由磷酸二氫鉀0.1～0.3g、磷酸氫二鈉2.0～4.0g、氯化鈉6.0～8.0g、氯化鉀0.2～0.4g、Tween-200.5～1.0mL、3.0～6.0mL 0.5M EDTA和重蒸水配制而成。
6.如權(quán)利要求1所述的一種檢測潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶HPT的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述封閉溶液為含1.0～3.0％BSA的溶液。
7.如權(quán)利要求1所述的一種檢測潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶HPT的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述底物稀釋液為pH5.5～6.0檸檬酸/醋酸鈉緩沖液，采用醋酸鈉4.0～5.0g、檸檬酸2.0～4.0g和重蒸水配制；所述終止液采用硫酸溶液。
全文摘要
本發(fā)明屬于酶聯(lián)免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycin phosphotransferase，HPT)的免疫檢測試劑盒及檢測方法。所述試劑盒由盒體構(gòu)成，在盒體內(nèi)設(shè)置有多孔酶標(biāo)板和試劑，其特征在于所述酶標(biāo)板的每個孔內(nèi)設(shè)有包被，該包被表面由1.0～3.0％牛血清白蛋白封閉，所述試劑有洗滌液、底物稀釋液、HPT蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、底物和反應(yīng)終止液；其結(jié)構(gòu)簡單、操作方便、能用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中HPT蛋白的檢測，樣品的前處理過程簡單、耗時少，能同時檢測批量的樣品，樣品檢測成本較低、保存期長、靈敏度高，一次可測定大量樣品的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，它是一種適用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中HPT蛋白的快速檢測用具。
文檔編號C12Q1/48GK1987467SQ20061015525
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日
發(fā)明者葉慶富, 汪海燕 申請人:浙江大學(xué)