一種具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的β-半乳糖苷酶組合突變體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程和遺傳工程領(lǐng)域，公開(kāi)了一種具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的β-半乳糖苷酶組合突變體，其是在去除了自身信號(hào)肽的亮白曲霉和米曲霉的β-半乳糖苷酶的氨基酸序列的基礎(chǔ)上，通過(guò)雙位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變所獲得的，在低聚糖生成量保持不變的情況下，該突變體的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)速率比野生型提高100％以上。同時(shí)，本發(fā)明還公開(kāi)了編碼上述組合突變體的DNA分子、含有上述DNA分子的重組表達(dá)載體以及表達(dá)上述DNA分子的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明還提供了采用上述重組表達(dá)載體制備具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的β-半乳糖苷酶的方法以及上述組合突變體、DNA分子、重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞在制備β-半乳糖苷酶中的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的β-半乳糖苷酶組合突變體及其 制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程和遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及一種具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的β_半 乳糖苷酶組合突變體及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 低聚半乳糖（GOS)是一類在人體胃腸道內(nèi)不能被消化吸收而直接進(jìn)入大腸被各 種雙歧桿菌良好利用的具有特殊生物學(xué)功能的低聚糖。它能夠改善人體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，有 利于雙歧桿菌和其它有益菌的增殖，提高人體免疫功能。同時(shí)，GOS經(jīng)代謝產(chǎn)生有機(jī)酸使 腸內(nèi)PH值降低，抑制腸內(nèi)沙門(mén)氏菌和腐敗菌的生長(zhǎng)，減少有毒發(fā)酵產(chǎn)物及有害細(xì)菌酶的產(chǎn) 生，調(diào)節(jié)胃腸功能，減輕了肝臟分解毒素的負(fù)擔(dān)。由于低聚半乳糖有著比其他功能性低聚糖 更優(yōu)良的性質(zhì)，從而使低聚半乳糖作為添加劑大規(guī)模應(yīng)用更方便易行，能夠適應(yīng)更多的食 品種類和更廣的消費(fèi)群體，有巨大的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)潛力。
[0003] GOS制備方法通常有五種：從天然原料中提取、天然多糖的酸水解、化學(xué)法合成、 發(fā)酵法及酶法合成。由于GOS在自然界中含量低，無(wú)色不帶電荷故難以提取分離；天然多糖 轉(zhuǎn)化產(chǎn)品得率低，產(chǎn)物成分復(fù)雜，難以純化；化學(xué)法毒性大易殘留，對(duì)環(huán)境污染重；發(fā)酵法 生產(chǎn)GOS的研究很少，仍處于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，無(wú)法進(jìn)行大量生產(chǎn)。目前低聚半乳糖的工業(yè)化生 產(chǎn)是通過(guò)β -半乳糖苷酶完成的。β-半乳糖苷酶（β-D-galactoside galatohydrolase， EC 3. 2. 1. 23)又稱乳糖酶（Lactase)，具有水解和轉(zhuǎn)糖苷的雙重作用。早先對(duì)于β -半乳糖 苷酶的研究主要集中在利用其水解功能生產(chǎn)低乳糖乳制品，來(lái)解除乳糖不耐受患者因食用 乳制品而引起的腹瀉、腹脹等多種不良反應(yīng)。隨著低聚半乳糖特殊的保健功能的確定，利用 β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷作用生產(chǎn)低聚半乳糖成為研究熱點(diǎn)。主要集中在以下三個(gè)方面：
[0004] 1、篩選高轉(zhuǎn)糖苷活性的β -半乳糖苷酶產(chǎn)生菌
[0005] 酵母、芽孢桿菌、曲霉、青霉、雙歧桿菌等多種微生物中都有具轉(zhuǎn)糖苷酶活性的 β-半乳糖苷酶。研究表明，不同來(lái)源的β-半乳糖苷酶因其酶學(xué)性質(zhì)各異，合成低聚半乳 糖時(shí)的反應(yīng)條件大不相同。β-半乳糖苷酶根據(jù)最適PH可分為酸性和中性兩種。通常霉菌 來(lái)源的β-半乳糖苷酶為酸性酶，其作用最適pH在pH2. 5?5. 5,最適反應(yīng)溫度較高（50? 60°C);酵母和細(xì)菌所產(chǎn)的β-半乳糖苷酶為中性酶，其最適pH介于pH 6?7. 5,最適反應(yīng) 溫度較低（30?40°C)。不同來(lái)源的β-半乳糖苷酶作用的底物類型也不盡相同，由此生 成的低聚半乳糖中寡糖的種類和比例也千差萬(wàn)別，這就使低聚半乳糖家族的新成員層出不 窮。盡管如此，篩選到的天然β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷活性普遍較低，低聚半乳糖的最高產(chǎn) 率通常只有5?30%，無(wú)法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
[0006] 2、優(yōu)化反應(yīng)條件、改進(jìn)生產(chǎn)工藝
[0007] 有學(xué)者試圖通過(guò)優(yōu)化低聚半乳糖的生產(chǎn)條件和工藝來(lái)彌補(bǔ)其轉(zhuǎn)糖苷活性低的缺 陷，提高低聚半乳糖的得率，已取得了一定的效果。主要的方法有：增加起始乳糖的濃度、 用有機(jī)溶劑控制水活度以及采用固定化技術(shù)。由于β_半乳糖苷酶的水解和轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)是 可逆的。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，水解產(chǎn)物半乳糖濃度較低，其對(duì)水解反應(yīng)的抑制作用較小，此 時(shí)酶表現(xiàn)出水解活力較高，而轉(zhuǎn)糖苷活力較低，因此產(chǎn)物中單糖含量較高。當(dāng)乳糖濃度較高 時(shí)，水解產(chǎn)物半乳糖濃度較高，當(dāng)其達(dá)到一定值就對(duì)水解酶活產(chǎn)生抑制作用。半乳糖是轉(zhuǎn)糖 苷的底物，濃度高有利于半乳糖寡糖的合成，因此底物濃度較高時(shí)，產(chǎn)物中寡糖含量較高。 使用有機(jī)溶劑有利于低聚糖的合成是因?yàn)橛袡C(jī)溶劑能降低反應(yīng)體系中水的活度以影響酶 的活性位點(diǎn)和反應(yīng)機(jī)制，引導(dǎo)水解酶催化逆向的轉(zhuǎn)半乳糖苷反應(yīng)，使反應(yīng)平衡由水解偏移 向低聚糖合成。利用固定化技術(shù)則可大大增加游離酶的PH和熱穩(wěn)定性并可反復(fù)利用，降低 生產(chǎn)成本。Mozaffar將β-半乳糖苷酶吸附于酚醛樹(shù)脂并用戊二醛交聯(lián)后，低聚糖的產(chǎn)率 提高了 20% ;但也有研究發(fā)現(xiàn)，固定化酶作用于較高濃度的乳糖溶液時(shí)，產(chǎn)生的低聚糖比用 游離酶還少。由此可見(jiàn)單純依靠?jī)?yōu)化條件始終無(wú)法從根本上解決問(wèn)題。
[0008] 3、利用基因工程手段提高β -半乳糖苷酶的表達(dá)和性質(zhì)改良
[0009] 自然界中野生的半乳糖苷酶GOS產(chǎn)量一般都維持在20?45%之間，產(chǎn)量較 低，難以滿足生產(chǎn)需求，因此通過(guò)分子改造篩選轉(zhuǎn)糖苷性質(zhì)優(yōu)良的突變酶成為研究熱點(diǎn)。 Hansen 0· (2001)等發(fā)現(xiàn)來(lái)源于雙歧桿菌中的β-半乳糖苷酶BIF3,缺失掉C末端580個(gè) 氨基酸后將酶蛋白變?yōu)橐粋€(gè)高效的轉(zhuǎn)糖苷酶，能夠利用幾乎90%乳糖生成G0S，而水解成 分占10 %，而且在10 %至40 %的乳糖濃度下始終能夠保持9:1比率的轉(zhuǎn)糖苷活力和水解活 力；Placier G.于2009年對(duì)來(lái)源于嗜熱脂肪土芽孢桿菌KVE39的β-半乳糖苷酶進(jìn)行定 向進(jìn)化，將轉(zhuǎn)糖苷活力提高則水解活力降低作為篩選依據(jù)，成功篩選到三株突變體R109W， R109V，R109K，在18% (w/v)乳糖中低聚糖產(chǎn)量分別為23%，11. 5%，21%，而野生酶只有 2% Y. (2013)等對(duì)硫化葉菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶進(jìn)行分子改造，研究其最適GOS生 成條件，在各自最適條件下突變體F441Y GOS產(chǎn)量為61. 7 %，F(xiàn)359Q為58. 3 %，而野生酶為 50. 9%。
[0010] 繼而，有學(xué)者提出一種迭代組合突變的方法（Ji J，F(xiàn)an Κ. et al，2012)，即將每一 輪篩選結(jié)果里最高活力的突變體作為模板進(jìn)行下一輪組合突變，直至生成的突變體活力均 無(wú)法超越出發(fā)模板時(shí)，迭代組合結(jié)束。通過(guò)該方法從四輪組合突變共24株突變體中篩選到 11株活力提高的突變體，最終活力最高突變體（C155Y Y184H V275I C281Y)比原始野生酶 提高1874%，但該組合突變的方法尚未有報(bào)道應(yīng)用于β-半乳糖苷酶的分子改造中。
[0011] 到目前為止，無(wú)論是天然酶的篩選分離、工藝優(yōu)化還是通過(guò)基因工程手段提高 β -半乳糖苷酶的表達(dá)和性質(zhì)改良，都沒(méi)有改變?chǔ)?-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)糖苷活性低和產(chǎn)量低的 現(xiàn)狀，從而也就造成低聚半乳糖合成產(chǎn)率低，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，生產(chǎn)成本太高，這嚴(yán)重制約了低 聚半乳糖的廉價(jià)生產(chǎn)和推廣應(yīng)用。
[0012] 因此，創(chuàng)制高轉(zhuǎn)糖苷活性的新型β -半乳糖苷酶，并使其廉價(jià)生產(chǎn)是目前研究和 生產(chǎn)中亟需解決的主要問(wèn)題之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，本發(fā)明一方面提供了一種具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的 β -半乳糖苷酶組合突變體，其是在亮白曲霉或米曲霉β -半乳糖苷酶的基礎(chǔ)上，通過(guò)雙位 點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變而獲得的，優(yōu)選是在序列2或序列4所示的氨基酸序列的基礎(chǔ)上，通過(guò)雙 位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變所獲得的，所述突變體在低聚糖生成量保持不變的情況下，轉(zhuǎn)糖苷反 應(yīng)速率比野生型提高100%以上，優(yōu)選提高150%以上，更加優(yōu)選提高200%以上。
[0014] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，突變位點(diǎn)分別為第219位和第785位的氨基酸。
[0015] 在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變分別為用甘氨酸殘基 取代第219位的絲氨酸殘基（S219G)和用纈氨酸殘基取代第785位的谷氨酸殘基（E785V)、 用丙氨酸殘基取代第219位的絲氨酸殘基（S219A)和用纈氨酸殘基取代第785位的谷氨酸 殘基（E785V)、用天冬酰胺殘基取代第219位的絲氨酸殘基（S219N)和用纈氨酸殘基取代第 785位的谷氨酸殘基（E785V)、或用纈氨酸殘基取代第219位的絲氨酸殘基（S219V)和用纈 氨酸殘基取代第785位的谷氨酸殘基（E785V)。
[0016] 本發(fā)明的另一方面提供了編碼上述組合突變體的DNA分子。
[0017] 本發(fā)明的再一方面提供了含有上述DNA分子的重組表達(dá)載體，優(yōu)選為重組酵母表 達(dá)載體。
[0018] 本發(fā)明的再一方面提供了表達(dá)上述DNA分子的宿主細(xì)胞，優(yōu)選糖酵母屬、克魯維 氏酵母屬、裂殖糖酵母屬和甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌株，甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌株更加優(yōu)選為畢赤氏 酵母屬菌株。
[0019] 本發(fā)明的再一方面提供了一種制備具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的β -半乳糖苷酶的方法， 包括以下步驟：
[0020] 1、用上述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，獲得重組菌株；
[0021] 2、培養(yǎng)上述重組菌株，誘導(dǎo)重組β -半乳糖苷酶的表達(dá)；
[0022] 3、回收并純化所表達(dá)的高轉(zhuǎn)糖苷活性的β-半乳糖苷酶。
[0023] 本發(fā)明的最后一方面提供了本發(fā)明所述的組合突變體、DNA分子、重組表達(dá)載體以 及宿主細(xì)胞在制備半乳糖苷酶中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明采用雙位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變技術(shù)對(duì)去除自身信號(hào)肽的亮白曲霉的β -半 乳糖苷酶基因 Iacb'和去除自身信號(hào)肽的米曲霉的β-半乳糖苷酶基因 Iaco'進(jìn)行了定 點(diǎn)飽和突變，獲得了具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的β -半乳糖苷酶組合突變體，從而使其轉(zhuǎn)糖苷反 應(yīng)速率比野生型提高了 100%以上，甚至提高了 200%以上，使制備高效率且高轉(zhuǎn)糖苷活性 的β-半乳糖苷酶成為現(xiàn)實(shí)，為β-半乳糖苷酶的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1 :亮白曲霉和米曲霉的β -半乳糖苷酶與底物的分子對(duì)接過(guò)程。
[0026] 圖2:亮白曲霉和米曲霉的β_半乳糖苷酶中突變位點(diǎn)與乳糖分子空間位置關(guān) 系。
[0027] 圖3 :含突變體β -半乳糖苷酶基因的重組表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程。
[0028] 圖4 :S219位點(diǎn)典型突變體低聚半乳糖生成量。
[0029] 圖5 :F245位點(diǎn)突變體庫(kù)低聚半乳糖生成量趨勢(shì)。
[0030] 圖6 :F245位點(diǎn)典型突變體低聚半乳糖生成量。
[0031] 圖7 :E785位點(diǎn)突變體庫(kù)低聚半乳糖生成量趨勢(shì)。
[0032] 圖8 :S219/E785雙位點(diǎn)突變體低聚半乳糖生成量。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，旨在用于說(shuō)明本發(fā)明而非限定本 發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā) 明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也同樣落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0034] 實(shí)施例1 : β -半乳糖苷酶三級(jí)結(jié)構(gòu)及突變位點(diǎn)的預(yù)測(cè)
[0035] 去除自身信號(hào)肽的β -半乳糖苷酶基因 Iacb '，為本實(shí)驗(yàn)室從亮白曲霉 (Aspergillus candidus)中克隆得到的，去除自身信號(hào)肽序列的基因由2958個(gè)核苷酸組 成，具體序列如序列1所示，該基因編碼的蛋白質(zhì)由986個(gè)氨基酸組成，具體序列如序列2 所示。
[0036] 去除自身信號(hào)肽的β -半乳糖苷酶基因 Iaco、為本實(shí)驗(yàn)室從米曲霉 (Aspergillus oryze)中克隆得到的，其也由2958個(gè)核苷酸組成，具體序列如序列3所 不，該基因編碼的蛋白質(zhì)也由986個(gè)氣基酸組成，具體序列如序列4所不。其氣基酸序 列與Iacb y基因編碼的蛋白質(zhì)僅有三個(gè)氨基酸的差異：分別在第231位：lacb y (Gly)， Iaco ' (Ser);第 401 位：lacb ' (Met)，Iaco ' (lie);第 970 位：lacb ' (Asp)， Iaco (Asn)〇
[0037] 以殼白曲霉和米曲霉的β _半乳糖昔酶為研究材料。以獲得晶體結(jié)構(gòu)的青霉屬 β-半乳糖苷酶（PDB登錄號(hào)：1TG7)，米曲霉β-半乳糖苷酶（PDB登錄號(hào)：4IUG)及里氏 木霉β_半乳糖苷酶（PDB登錄號(hào)：30G2)的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)為同源模型，對(duì)β-半乳糖 苷酶的3D結(jié)構(gòu)及與底物結(jié)合的區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)報(bào)道的預(yù)測(cè)結(jié)果高度 相似（參見(jiàn) The crystal structure of acidic β-galactosidase from Aspergillus oryzae, Mirko M. Maksimainen, International Journal of Biological Macromolecules, 2013, 109-115)。酶蛋白由5個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：結(jié)構(gòu)域1(1?394氨基酸）靠近N端，是該酶的 活性中心所在，活性中心是TIM桶型結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)域2(395?573氨基酸）由16個(gè)反向平行的 β-折疊片和1個(gè)α-螺旋組成，包含了 一個(gè)類似免疫球蛋白的亞結(jié)構(gòu)域；結(jié)構(gòu)域3 (574? 661氨基酸）由8個(gè)反向平行的β -折疊片組成一個(gè)"希臘鑰匙"的β -夾層和1個(gè)α -螺 旋組成；結(jié)構(gòu)域4 (662?857氨基酸）和結(jié)構(gòu)域5 (858?1005氨基酸）主要由"春卷"型 的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)組成。對(duì)活性中心重點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，位于TM桶活性中心第4和第7條β -折疊 片上的Glul60、Glu258可能是參與催化反應(yīng)必不可少的氨基酸，而AsnHO和Tyr96可能用 來(lái)固定乳糖分子。
[0038] 根據(jù)得到的β -半乳糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)Discovery Studio軟件進(jìn)行酶與底 物的分子對(duì)接模擬（參見(jiàn)附圖1)，根據(jù)對(duì)接結(jié)果解析，可獲知與底物存在相互作用的氨基 酸（參見(jiàn)附圖2)。使用計(jì)算生物學(xué)軟件逐個(gè)評(píng)估這些氨基酸的進(jìn)化熵，最終篩選確定了六 個(gè)進(jìn)化熵變化較大的氨基酸位點(diǎn)S219, D239, S240, Y241，F(xiàn)245和E785 (參見(jiàn)表1)用于定 點(diǎn)飽和突變。
[0039] 表1 β -半乳糖苷酶典型氨基酸的進(jìn)化熵
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 一種具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的β-半乳糖苷酶組合突變體，其是在亮白曲霉或米曲霉 β -半乳糖苷酶的基礎(chǔ)上，通過(guò)雙位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變而獲得的，優(yōu)選是在序列2或序列 4所示的氨基酸序列的基礎(chǔ)上，通過(guò)雙位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變所獲得的，所述突變體在低聚 糖生成量保持不變的情況下，轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)速率比野生型提高100%以上，優(yōu)選提高150%以 上，更加優(yōu)選提高200%以上。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合突變體，其中突變位點(diǎn)分別為第219位和第785位的氨 基酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合突變體，其中雙位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變分別為用甘氨酸 殘基取代第219位的絲氨酸殘基（S219G)和用纈氨酸殘基取代第785位的谷氨酸殘基 (E785V)、用丙氨酸殘基取代第219位的絲氨酸殘基（S219A)和用纈氨酸殘基取代第785 位的谷氨酸殘基（E785V)、用天冬酰胺殘基取代第219位的絲氨酸殘基（S219N)和用纈氨 酸殘基取代第785位的谷氨酸殘基（E785V)、或用纈氨酸殘基取代第219位的絲氨酸殘基 (S219V)和用纈氨酸殘基取代第785位的谷氨酸殘基（E785V)。
4. 編碼權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述組合突變體的DNA分子。
5. 含有權(quán)利要求4所述DNA分子的重組表達(dá)載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其為重組酵母表達(dá)載體。
7. 表達(dá)權(quán)利要求4所述DNA分子的宿主細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，選自糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、裂殖糖酵母屬和 甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌株，其中甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌株優(yōu)選為畢赤氏酵母屬菌株。
9. 一種制備具有高轉(zhuǎn)糖苷活性的β_半乳糖苷酶的方法，包括以下步驟： 1) 用權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，獲得重組菌株； 2) 培養(yǎng)上述重組菌株，誘導(dǎo)重組β_半乳糖苷酶的表達(dá)； 3) 回收并純化所表達(dá)的高轉(zhuǎn)糖苷活性的β_半乳糖苷酶。
10. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的組合突變體、權(quán)利要求4所述的DNA分子、權(quán)利要求 5或6所述的重組表達(dá)載體、權(quán)利要求7或8所述的宿主細(xì)胞在制備β -半乳糖苷酶中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK104263710SQ201410514519
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】張偉, 張宇宏, 劉波, 孫寧, 張佳琳 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所