專利名稱：具合成頭孢菌素酸類酶活性的生物催化劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用含頭孢菌素酸合成活性的大腸埃希菌細胞制備非均相生物催化劑(Biocatalyst, BC)的方法。
背景技術(shù)：
據(jù)文獻報道，具有青霉素?；D(zhuǎn)移酶活性的細胞的固定化方法主要采用戊二醛交聯(lián)處理細胞，經(jīng)戊二醛交聯(lián)后的細胞增強了細胞壁的通透性，有助于滲透到多聚酰胺球形顆粒中。膠粒制備的聚合工藝始于氧化還原對，其中，N，N，N' ,N'-四甲基乙二胺是促進劑，過硫酸銨是引發(fā)劑?，F(xiàn)有的生物催化劑是特指把青霉素G經(jīng)酶法水解生成6-氨基青霉烷酸產(chǎn)物(6-APA)的酶，但生物催化的酶活性很低，不到8U/g。已知的微生物細胞(包括大腸埃希氏菌細胞)的固定化方法是將細胞共價結(jié)合到交叉連接多聚物(膠)上，而多聚物則是通過不同的單體，主要是丙烯酸單體，共聚作用生成的。在聚合過程中，細胞要么與制備好的聚合物結(jié)合，要么與單體結(jié)合起來后再用多功能基的聯(lián)結(jié)劑如戊二醛進行處理。在細胞與聚合物或者單體結(jié)合之前，需先經(jīng)包括戊二醛在內(nèi)的含多功能基的交聯(lián)劑處理。β-二甲基氨基丙腈與過硫酸銨形成的氧化還原對引發(fā)單體聚合。已報道的專利都沒有生物催化劑固定化大腸埃希氏菌細胞的制備實例，但包含了具有青霉素?；D(zhuǎn)移酶活性的雷極氏變形桿菌(roteusrettgeri)細胞的固定化方法的介紹，此方法可用于具有酶水解青霉素G生成6-APA活性的生物催化劑的制備。即使以最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)式存在，此生物催化劑的操作穩(wěn)定性仍然很差，催化青霉素G水解進行20個循環(huán)， 反應(yīng)約60個小時后，生物催化劑的活性降低2倍。把與本發(fā)明方法最接近的文獻方法叫做原型方法。本發(fā)明為具有催化β -內(nèi)酰胺類抗生素轉(zhuǎn)化活性的生物催化劑固定化細胞的制備方法。原型方法中，水解青霉素G的生物催化劑的制備是通過截留大腸埃希氏菌細胞中的青霉素酰胺酶(青霉素水解酶)進入多聚酰胺的膠來實現(xiàn)的。原型方法由以下幾點構(gòu)成大腸埃希氏菌菌株ATCC 9637在含有有機碳源和有機氮源及無機鹽的培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)。生物合成進行M小時。生物培養(yǎng)終止點無任何特別的判據(jù)。將培養(yǎng)的菌絲體懸浮于聚丙烯酰胺膠單體(丙烯酰胺和N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺)，向混合物中加入聚合促進劑 (β-二甲基氨基丙腈)和引發(fā)劑(過硫酸鉀)，膠即形成。細胞的加入量為每克聚合混合物加入33mg干重細胞，即C。.b. = 33mg干重/g聚合混合物；將聚合生成的凝膠切成小顆粒， 再用水洗滌。原型方法的主要缺點如下細胞在固定化時缺少的共價交聯(lián)的固著點會導(dǎo)致酶轉(zhuǎn)化形成的目標產(chǎn)品有被天然有機混合物污染的可能，例如反應(yīng)一開始就會被從生物催化劑上脫落的蛋白所污染；且原型方法固定化的細胞活性比較低。原型方法生物催化劑的酶活僅為22U/g(按水解青霉素G來計算)。對于催化β-內(nèi)酰胺類抗生素的合成特別是頭孢菌素酸的合成，該方法制備的生物催化劑的活性很難確定。參照原型方法實施細胞固定化，用大腸埃希氏菌VKPM Β-10182菌株細胞(見實施例3)生成頭孢菌素酸合成酶，能夠得到有頭孢唑啉合成酶活性的生物催化劑即固定化細胞，其活性(以合成頭孢唑啉計)約40U/g濕細胞(相當于300U/g干細胞)，固定化收率約 50%。但這些生物催化劑活性低，不宜用于裝有攪拌的批量反應(yīng)器中進行反應(yīng)。在此種反應(yīng)器中合成則需要生物催化劑的活性不低于60U/g濕細胞(相當于330U/g干細胞)。按照原型方法生產(chǎn)的生物催化劑的活性也差。在加速失活條件下(40°C，pH6.5)生物催化劑失活一半的時間(半衰期)僅為20小時這不僅是酶的熱失活，而且是酶從其膠質(zhì)流失的機械性損失。溫和條件下(Ig生物催化劑置于3ml緩沖液，20°C，1小時)單一生物催化劑用 PH7. 5的0. IM磷酸鹽緩沖液沖洗，合成酶活性的損失約為30%。上清液中脫落的蛋白總量結(jié)果顯示每Ig蛋白損失5mg目標蛋白。由于酶轉(zhuǎn)化合成的目標產(chǎn)物會不可避免地遭到脫落蛋白質(zhì)類的污染，因此使用這樣的生物催化劑來催化合成內(nèi)酰胺類抗生素幾乎是不可能的。

發(fā)明內(nèi)容
該項技術(shù)發(fā)明旨在解決以下問題如何提高具有合成頭孢菌素酸活性的生物催化劑的活性；如何提高具有合成頭孢菌素酸活性的生物催化劑的穩(wěn)定性；制備的生物催化劑在使用其催化合成的目標產(chǎn)物過程中蛋白質(zhì)不會脫落，所以不會造成目標產(chǎn)物的污染。本發(fā)明通過連續(xù)使用多項條件優(yōu)化的技術(shù)手段來解決前述原型方法制備生物催化劑過程中存在的問題。本發(fā)明所制備的具有合成頭孢菌素酸活性的合成酶的生物催化劑固定化大腸埃希氏菌細胞CGMCC No. 3508菌株(或者VKPM Β-10182菌株)是制備生物催化劑的起始物材料。生產(chǎn)菌的培養(yǎng)在含有碳氮源的液體培養(yǎng)基中進行。菌絲體細胞內(nèi)和細胞外溶液中目標酶的分配系數(shù)(Kdist)是酶在細胞壁上結(jié)合強度的特征量，因而作為生物合成過程終止的判據(jù)。將成熟的菌絲體細胞懸浮在多聚酰胺單體溶液中，經(jīng)戊二醛交聯(lián)修飾，然后加入聚合引發(fā)劑(一般為過硫酸鹽)。反應(yīng)混合物中無需加入催化劑。制備好凝膠切碎，用水洗滌去除在聚合過程中沒有聚合完全的底物(蛋白質(zhì)及丙烯酰胺單體)。頭孢菌素酸合成酶(C^phalosporin-Acids SynthetAse，CASA)的生物合成在該目標酶的分配系數(shù)Kdist彡350、培養(yǎng)液ρΗ7. 9-8. 2時人為地終止于大腸埃希氏菌細胞CGMCC No. 3508 (VKPM Β-10182)生長的平穩(wěn)期(見實施例4之表1)。最適宜的細胞固定化的時間和條件的選擇是變化的，這可能影響到生物合成的持續(xù)時間。在選定條件下產(chǎn)生的細胞， 對于目標酶結(jié)合度高(不低于1600U/g干細胞)，頭孢菌素酸合成酶與細胞結(jié)構(gòu)的結(jié)合強， 保持著生物合成穩(wěn)定期細胞的完整性。維持細胞中目標酶天然微環(huán)境可防止酶受到固定化和隨后開發(fā)過程的不利影響，分配系數(shù)Kdist彡350的大腸埃希氏菌CGMCC No. 3508 (VKPM B-10182)細胞可保證生成的生物催化劑高的頭孢菌素酸合成活性和良好的穩(wěn)定性。頭孢菌素酸合成酶在培養(yǎng)基PH < 7. 9時能與細胞結(jié)構(gòu)結(jié)合牢固(Kdist ^ 350)，不宜用菌絲體細胞活性不夠高的細胞進行固定化。當分配系數(shù)Kdist < 350，pH ^ 8. 2時，目標酶受到細胞的束縛會很小，這時可有細胞部分溶解(細胞質(zhì)破壞)，或者隨后發(fā)生自溶(細胞膜破裂)，酶會釋放出來。使用這樣的細胞進行固定化，生物催化劑的穩(wěn)定性將會降低，同時在固定過程中其活性也會流失(見實施例5)。下列用戊二醛修飾的細胞可以防止在生物催化劑制備過程中從膠體上的沖洗流失問題。懸浮細胞濃度上限為150mg干重/g聚合混合物，因為濕細胞中干物質(zhì)占20-23%， 當濕細胞大于70% (總重量Wp.m計)的聚合混合物體系不可能再有聚合了。如果加入細胞的量低于IOOmg干重/g聚合混合物這個比例，則不能確保制備出的生物催化劑的高活性 (見實施例6之表2)。本發(fā)明采用戊二醛對細胞進行交聯(lián)修飾的方法有兩個優(yōu)點。首先，戊二醛可以使包括目標蛋白在內(nèi)的所有蛋白不可逆固定，增強了固定化細胞的活性和穩(wěn)定性，酶不會從交聯(lián)聚集體上脫落下來。其次，戊二醛與蛋白相互作用的中間產(chǎn)物有加速多聚酰胺單體聚合的作用。因此，本發(fā)明的聚合反應(yīng)過程不需要添加催化劑(如二甲基氨基丙基腈、N， N,N' ,N'-四甲基乙二胺)。資料顯示，在早期使用丙烯酸酯凝膠固定化游離蛋白就應(yīng)用了相似原理。本發(fā)明中交聯(lián)修飾劑戊二醛的添加濃度為lX10-3_9X10_3mmol/mg蛋白，且在 5-30分鐘內(nèi)完成交聯(lián)。戊二醛添加濃度若高于9X 10_3mmol/mg蛋白將降低生物催化劑的活性，戊二醛添加濃度低于1 X 10_3mmol/mg蛋白或者修飾時間小于5分鐘都將會降低生物催化劑的穩(wěn)定性，還可能出現(xiàn)蛋白質(zhì)脫落的現(xiàn)象。戊二醛修飾細胞的時間超過30分鐘，用于加速丙烯酰胺單體聚合的中間產(chǎn)物會與戊二醛反應(yīng)，使得中間體的濃度降低，將導(dǎo)致隨后聚合形成凝膠的速度變慢，所制備的生物催化劑的機械強度也會變差(見實施例7之表 3)。本發(fā)明制備生物催化劑的方法包含如下內(nèi)容液體深層培養(yǎng)具頭孢菌素酸合成酶活性的大腸埃希式菌CGMCC No. 3508 (VKPM B-10182)，培養(yǎng)基中含玉米漿O %的干粉)及噻吩-2-乙酸(0. 1 % )。分配系數(shù)Kdist彡350 且培養(yǎng)液PH值在7. 9-8. 2范圍時終止發(fā)酵。發(fā)酵液離心收集菌體細胞，菌體用pH7. 5的 0. IM磷酸鹽緩沖液洗滌，然后再離心收集沉淀細胞。制備好的細胞即可用來固定化，通過丙烯酰胺(Acryamide，從)和 N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺(N，N' -Methylene bisacrylamide, BIS)的共聚合，最終制備出多聚酰胺固定化細胞。按照每克聚合混合物加入100-150mg干重細胞的量(C。.b. = 100-150mg干重/g聚合混合物)把細胞懸浮在PH7. 5的磷酸鹽緩沖液中，緩沖液含有聚丙烯酰胺膠的單體，單體在聚合混合物中的濃度(_ = 9%，其中從與BIS質(zhì)量比為20 1。在冰浴條件下冷卻細胞懸浮液，不停攪拌加入戊二醛交聯(lián)修飾細胞，戊二醛的添加濃度為1 X 10_3_9 X 10_3mmol/ mg蛋白，反應(yīng)時間、。d為5-30分鐘。交聯(lián)結(jié)束后加入聚合引發(fā)劑(各種過硫酸鹽，例如過硫酸銨、過硫酸鉀)引發(fā)聚合反應(yīng)的進行。聚合引發(fā)劑的加入量要保證在20-120秒內(nèi)聚合形成凝膠。聚合完成的凝膠塊置于冰浴中20-30分鐘，取出切碎成0. 5mm的小塊，用水洗滌去除未聚合的底物等化合物，再過濾分離得到固定好的細胞。本發(fā)明得到的生物催化劑以合成頭孢唑啉來計算，活性為100U/g濕重(600U/g干重)，半衰期(τ 1/2)大于800小時 (40ρΗ6.5)。制備的生物催化劑蛋白不易脫落，可用于帶有機械攪拌反應(yīng)器的頭孢菌素酸類的合成工藝。本發(fā)明使用能產(chǎn)生頭孢菌素酸合成酶的、以聚丙烯酰胺固定化的大腸埃希氏菌 CGMCC No. 3508 (VKPM Β-10182)細胞來生成生物催化劑的方法(見實施例1、2、6和7)。使用大腸埃希氏菌VKPM Β-10182菌株與原型方法(見實施例3)相比，具有如下優(yōu)越性
本發(fā)明方法固定化細胞的活性(以頭孢唑啉合成計)是原型方法的2-3倍(本方法固定化細胞的活性為600-950U/g干重，原型方法僅為300U/g干重)。本發(fā)明方法固定化細胞的穩(wěn)定性至少提高了 40倍(本方法固定化細胞的半衰期 τ 1/2 = 800-2000小時，原型方法的半衰期τ 1/2 = 20小時)。本發(fā)明方法固定化細胞制備的生物催化劑相對于原型方法而言，沒有出現(xiàn)目標酶以及其他蛋白質(zhì)脫落的現(xiàn)象。
具體實施例方式本發(fā)明方法生物催化劑的制備過程用以下實施例來具體說明。本發(fā)明使用的能產(chǎn)生頭孢菌素酸合成酶的大腸埃希氏菌為來自俄羅斯工業(yè)微生物中心(VKPM)的VKPM Β-10182菌株和來自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)的 CGMCC No. 3508 菌株。在如下所有實施例中，酶活性均以3-脫乙?；鵢3-[甲硫基(5-甲基-1，3，4-噻二唑-2)]-7-氨基頭孢烷酸(MMTD-7-ACA))與1(H)-四唑基乙酸甲酯(METzAA)合成頭孢唑啉來計算。頭孢唑啉合成酶活性的檢測方法反應(yīng)體系ρΗ7. 5，溫度(30士 1) °C，底物 MMTD-7-ACA 濃度為 0. 059士0. 002mol/L，MEiTzAA 濃度為 0. 236士0. 004mol/L，測定產(chǎn)物的合成的初始速度來測定酶的活性。產(chǎn)物頭孢唑啉的濃度用HPLC方法測定。細胞干重分析測定方法105士 1°C烘干細胞和生物催化劑至恒重，再稱量。分配系數(shù)Kdist的測定方法頭孢菌素酸合成酶的分配系數(shù)的計算式Kdist = K.、J Asup，每Ig細胞加入5ml濃度為0. IM磷酸鹽緩沖液(pH6. 5)，測定胞內(nèi)胞外酶的活性， 其中胞內(nèi)活性(Activity in cell biomaSS)A。.b以U/g濕重細胞來計算，胞外酶活性 Asup (Supernatantact ivity)以 U/ml 來計算。蛋白含量測定方法胞內(nèi)胞外蛋白含量均按照Lowry方法進行測定。在加速失活的條件下(40°C，0. IM磷酸鹽緩沖液，pH6. 5)，通過測定不同處理時間后生物催化劑殘存的活性來確定其失活動力學(xué)規(guī)律。生物催化劑的穩(wěn)定性以確定條件下的半衰期(τ 1/2,小時)的長短來確定。Ig濕重生物催化劑加入3ml磷酸鹽緩沖液(pH7. 5)，在20°C處理一個小時后測定上清中蛋白含量和目標酶活性。根據(jù)上清中是否有酶活來判斷在洗滌生物催化劑時是否有蛋白及目標酶損失。實施例1用大腸埃希式菌VKPM B-IO182菌株制備生物催化劑的方法實例在750ml三角瓶中裝入IOOml培養(yǎng)基培養(yǎng)具有生物合成頭孢菌素酸合成酶的大腸埃希氏菌VKPM B-10182菌株，培養(yǎng)基的組成如下玉米漿2%，2_噻吩乙酸0. 1%，自來水溶解后，補足所需要的體積，消毒后 ρΗ6· 9-7. 1。在循環(huán)振蕩搖床上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25-26°C，轉(zhuǎn)速220_M0rpm。培養(yǎng)18小時，發(fā)酵液PH為8. 1，Kdist = 380時細胞內(nèi)頭孢菌素酸合成酶的生物合成人為終止。離心轉(zhuǎn)速 6000rpm，低溫離心20分鐘收集菌體細胞。用pH7. 5濃度為0. IM磷酸鹽緩沖液洗滌，以如上同樣的條件離心收集細胞。3. 7L發(fā)酵液，收獲大腸埃希氏菌VKPM B-10182菌株的細胞46. 6g，這些細胞具有如下質(zhì)量參數(shù)合成酶活性(Ac. J為460U/g濕重(2009U/g干重)；干物質(zhì)量(β。.b.) 22. 9% ；蛋白含量lHmg/g濕重。制得的菌絲細胞通過將其封入聚丙酰胺凝膠而被固定化。聚酰胺固定化細胞的條件為聚合混合物Wp.m.為7. Og ；細胞加入量C。.b.為137mg干重/g混合物；交聯(lián)劑戊二醛加入量CeA為1. 7X 10_3mmol/mg蛋白；交聯(lián)反應(yīng)時間τ mod為15分鐘；凝膠聚合中單體濃度9% ；聚合引發(fā)劑過硫酸銨0.2%。在冰浴且伴有磁力攪拌的條件下，固定化細胞的制備在玻璃燒杯中進行。將4. 2g 細胞懸浮在1. 4ml濃度為0. 3M磷酸鹽緩沖液中(pH7. 5)。加入1. 05ml濃度為60%聚丙烯酰胺單體溶液(AA BIS = 20 1)，混合均勻，再加入交聯(lián)劑0.^1125%的戊二醛溶液，在攪拌的條件下戊二醛在15分鐘內(nèi)完成蛋白的交聯(lián)反應(yīng)。最后加入60 μ 125%的過硫酸銨，強力攪拌至反應(yīng)終止。凝膠聚合在30秒內(nèi)完成。聚合完成的凝膠置燒杯中于冰上冷卻20分鐘，再把凝膠經(jīng)過孔徑0. 5mm的金屬篩制成0. 5mm的小顆粒，用去離子水和 IM氯化鈉洗滌，減壓過濾，即得生物催化劑。[注釋從為Acrylamide的縮寫；BIS為N， N' -methylenebisacryIamide 的縮寫]。取7. Olg濕重生物催化劑，測得如下相關(guān)質(zhì)量參數(shù)合成酶活性(Ac.b)為165U/g濕重(900U/g干重)；干物質(zhì)含量(β。.b.) 18. 3 % ； 40°C,pH6. 5條件下，半衰期(τ 1/2)為1200小時，固定化細胞的活性收率為59. 9%。制備的固定化生物催化劑均未發(fā)現(xiàn)脫落的合成酶及蛋白。實施例2使用大腸埃希式菌CGMCC No. 3508菌株制備生物催化劑的方法實例以實施例1方法，使用大腸埃希式菌CGMCC No. 3508菌株進行頭孢菌素酸合成酶的生物合成，但不同之處是培養(yǎng)時間為16小時，終止點ρΗ8. 05，Kdist = 370。分離培養(yǎng)的菌絲細胞，按實施例1方法洗滌。1. 2L培養(yǎng)液，得濕菌絲細胞13. lg。菌絲細胞的參數(shù)值如下合成酶活性(Synthetaseactivity,Abc)為 380U/g濕重；1820U/g 干重；干物質(zhì)含量(Dry substance content, β BC) % 23. 0% ；蛋白含量 90mg/g 濕重。用以上制備的CGMCC No. 3508菌株細胞進行固定化，包埋于聚丙烯酰胺凝膠。固定化細胞的制備按下列條件進行聚合混合物Wp.m.為7. Og ；菌絲細胞加入量C。.b.為145mg干重/g聚合混合物；交聯(lián)劑戊二醛用量CeA為5X 10_3mmol/mg蛋白；交聯(lián)時間15分鐘；單體在反應(yīng)混合物中的濃度C_為9% ；加入0. 2%的過硫酸銨作為聚合反應(yīng)的引發(fā)劑。制備過程在玻璃燒杯中、冰浴和電磁攪拌下進行。將4. 4g濕細胞懸浮在0. 7ml 0. 3M磷酸緩沖液(pH7. 5)中，再加入1.05ml 60 %聚丙烯酰胺單體水溶液(AA BIS = 20 1)，將預(yù)制的25%戊二醛水溶液0.79ml加入燒杯，在連續(xù)攪拌下蛋白交聯(lián)修飾10分鐘。在劇烈攪拌下加入25%過硫酸氨水溶液0. 06ml，將形成的凝膠經(jīng)過0. 5mm孔徑金屬篩，蒸餾水洗，IM氯化鈉溶液洗滌。生物催化劑減壓過濾，洗滌分離。得6.95g濕重生物催化劑，相關(guān)質(zhì)量參數(shù)的測定如下合成酶活性(Synthetaseactivity, Abc)為 150U/g 濕重(300U/g 干重)；干物質(zhì)含量(Dry substance content, β BC)為 17. 8 % ；40 V，pH6. 5 條件下的半衰期 (half-inactivation time, τ 1/2)為1250小時，固定化細胞工藝的活性收率(Yield of activity)為 62. 4%。用緩沖液洗滌制備好的生物催化劑，檢測洗滌上清液，合成酶活性未損失，目標蛋白也未損失。實施例3以大腸埃希氏菌菌株VKPM B-10182按原型方法制備生物催化劑的實例 (對照)產(chǎn)生菌大腸埃希式菌VKPM B-10182菌株的培養(yǎng)、細胞分離、洗滌方法同實施例1。 產(chǎn)生的菌絲細胞按照原型方法固定化，包埋于聚丙烯酰胺凝膠。固定化細胞的制備按下列條件進行聚合混合物Wp.m. = 7. Og ；菌絲細胞加入量C。.b. = 33mg干重/g聚合混合物；單體在反應(yīng)混合物中的濃度(_為12.7% ；以0.36% β-二甲基氨基丙氰做聚合反應(yīng)加速劑， 以0. 07%過硫酸鉀作為聚合反應(yīng)的引發(fā)劑。將Ig濕細胞懸浮在4.0ml 0. 9 %的氯化鈉溶液中，加入0. 75g丙烯酰胺和 0. 40gN, N'-亞甲基-雙丙烯酰胺(從BIS =18 1)，溶解，再分別加入0. 5ml 5% β - 二甲基氨基丙基腈溶液和0. 5ml 1 %過硫酸鉀溶液，形成的凝膠放置20分鐘，再把凝膠經(jīng)過孔徑0. 5mm的金屬篩制成0. 5mm的小顆粒，用0. 9%氯化鈉溶液洗滌。取6. 2g濕重生物催化劑，相關(guān)質(zhì)量參數(shù)的測定如下合成酶活性(Synthetaseactivity, Abc)為 38U/g 濕重，300U/g 干重；干物質(zhì)含量(Dry substance content, β BC)為 12. 7 % ；40 °C，pH6. 5 條件下的半衰期 (half-inactivation time, τ 1/2)為 20 小時；固定化細胞的活性收率(Yield of activity) 為 51. 4%。用緩沖劑洗滌制備好的生物催化劑時，每Ig生物催化劑的合成酶活性損失llU/g 生物催化劑(初始活性為)，每克生物催化劑的脫落蛋白為5mg。實施例4大腸埃希氏菌菌株產(chǎn)生的頭孢菌素酸合成酶的生物合成動力學(xué)取大腸埃希氏菌VKPM B-10182菌株或者CGMCC No. 3508菌株，在三角燒瓶中按照實施例1條件培養(yǎng)。在此過程中每次取出2瓶，合并2瓶培養(yǎng)液，記錄pH，離心收集細胞，每克細胞加入5ml 0. IM磷酸鹽緩沖液(pH7.幻，洗滌。分析細胞內(nèi)及胞外洗滌液中的酶含量， 計算頭孢菌素酸合成酶的分配系數(shù)Kdist。培養(yǎng)液的PH、Kdist及細胞活性(A。.b.，U/g干重) 之間的關(guān)系如表1所示。表1頭孢菌素酸合成酶的生物合成動力學(xué)參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種具有合成頭孢菌素酸類酶活性的生物催化劑的制備方法，包括具有頭孢菌素酸合成酶活性的產(chǎn)生菌的培養(yǎng)及固定具有胞內(nèi)酶活性的成熟細胞，把細胞懸浮在多聚酰胺單體溶液中，隨后在引發(fā)劑和加速劑作用下形成凝膠。
2.如權(quán)利要求1所述的生物催化劑的制備方法，其特征在于具有頭孢菌素酸合成酶活性的大腸埃希氏菌菌株是CGMCC No. 3508或VKPM B-IO182。
3.如權(quán)利要求1所述的生物催化劑的制備方法，其特征在于以目標酶在胞內(nèi)胞外的分配常數(shù)Kdist來確定具有頭孢菌素酸合成酶活性產(chǎn)生菌培養(yǎng)的終止時間，即發(fā)酵液 PH7. 9-8. 2，Kdist彡350時終止頭孢菌素酸合成酶的生物合成，發(fā)酵停止。
4.如權(quán)利要求1所述的生物催化劑的制備方法，其特征在于得到的細菌細胞經(jīng)戊二醛交聯(lián)修飾，再按照每克聚合混合物中含100-150mg干細胞量這樣的濃度在聚丙烯酰胺單體溶液中反應(yīng)形成凝膠，從而制得固定化細胞。
5.如權(quán)利要求1所述的生物催化劑的制備方法，其特征在于選擇優(yōu)化好的戊二醛濃度及交聯(lián)時間，菌絲細胞先經(jīng)戊二醛交聯(lián)修飾后再懸浮于聚丙烯酰胺凝膠單體溶液中。
6.如權(quán)利要求1所述的生物催化劑的制備方法，其特征在于細胞修飾時戊二醛的加入濃度為1 X 10_3-9X 10_3mmol/mg蛋白，細胞的交聯(lián)修飾在5_30分鐘內(nèi)完成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具合成頭孢菌素酸類酶活性的生物催化劑的制備方法，該方法利用能產(chǎn)生頭孢菌素酸合成酶活性的大腸埃希氏菌菌株CGMCC No.3508(或者菌株VKPM B-10182)作為初始材料，采用多項技術(shù)，選擇優(yōu)化條件，解決了制備生物催化劑工藝問題；該生物催化劑用于β-內(nèi)酰胺類抗生素的轉(zhuǎn)化及合成；可解決頭孢菌素酸類合成用生物催化劑原制備方法產(chǎn)生的問題，活性高，穩(wěn)定性好，在使用時生物催化劑中的蛋白不流失，因此酶法轉(zhuǎn)化的目標產(chǎn)物不致遭受脫落蛋白的污染。
文檔編號C12N11/08GK102296057SQ20101010282
公開日2011年12月28日 申請日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日
發(fā)明者亞諾斯基·舍戈, 克列斯季安洛瓦·伊琳娜, 周亮, 庫偌什金娜·瓦連金娜, 張翔, 斯克利亞仁科·安娜, 熊輝, 胡遠輝, 薩塔偌娃·熱尼, 蔣用, 賈愛瓊 申請人:中國醫(yī)藥集團總公司四川抗菌素工業(yè)研究所, 俄羅斯聯(lián)邦國家科學(xué)中心工業(yè)微生物遺傳育種研究所