專利名稱：tGLP-1衍生物及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域的GLP-I衍生物及其制備和應(yīng)用，尤其是涉及一種 可口服的tGLP-Ι衍生物及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病(Diabetes Mellitus) 一種常見慢性全身性的代謝性疾病，是由遺傳和環(huán) 境因素相互作用而引起的臨床綜合征。是由于人體內(nèi)胰島素絕對(duì)或相對(duì)缺乏所至。它的臨 床表現(xiàn)大概包括兩個(gè)方面，一是血糖高、尿糖多造成的“三多一少”，即多飲、多尿、多食及消 瘦；二是并發(fā)癥造成的癥狀，如糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變等。糖尿病分I型糖尿病和II型 糖尿病。其中I型糖尿病多發(fā)生于青少年，其胰島素分泌缺乏，必須依賴胰島素治療維持生 命。II型糖尿病多見于30歲以后中、老年人，其胰島素分泌不足。目前糖尿病發(fā)病迅速，其已經(jīng)成分為繼腫瘤、心腦血管病之后第三位嚴(yán)重危害人 類健康的慢性疾病。2009年10月21日國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)(IDF)公布最新數(shù)據(jù)目前患糖 尿病的人數(shù)為2. 85億，如果這種發(fā)展趨勢(shì)得不到遏制，到2030年這個(gè)數(shù)字預(yù)計(jì)將上升到約 4. 4億。IDF的糖尿病地圖(Diabetes Atlas)最新數(shù)據(jù)表明中低收入國(guó)家(LMC)人民正受 到糖尿病蔓延的沖擊，而且工作年齡段的糖尿病患者要比原來預(yù)料的多得多。我們成為繼 印度(5080萬(wàn))之后發(fā)病人數(shù)最多的國(guó)家(4320萬(wàn))。糖尿病者需終生給藥，因此開發(fā)高效 低廉的糖尿病新藥具有誘人的前景。GLP-I是一種主要由遠(yuǎn)端回腸、直腸和結(jié)腸的L細(xì)胞分泌的多肽激素。具有刺激胰 島素分泌和生物合成、增加胰島β細(xì)胞數(shù)量、抑制胰高血糖素分泌和抑制胰島β細(xì)胞凋亡 等作用。GLP-I降血糖活性最大的特點(diǎn)是葡萄糖濃度依賴性降糖，不會(huì)引起低血糖。因此其 具有很大的應(yīng)用前景。由于其在體內(nèi)受DPPIV酶的降解，在體內(nèi)的半衰期只有2-aiiin。因 此尋求一種延長(zhǎng)GLP-I體內(nèi)半衰期，延長(zhǎng)其生物活性的方法，成為目前GLP-I研究的熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)GLP-I治療糖尿病的研究方向之一是對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改變，得到 GLP-I衍生物，用該衍生物治療糖尿病，達(dá)到延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)藥效時(shí)間的目的。例如諾華諾 德公司研制的NN2211 (商品名Liraglutide)，其在GLP-1的Lyd6上進(jìn)行?；?，可以顯著提 高GLP-I的體內(nèi)半衰期。也有人在C端接上脂肪酸以與血漿白蛋白結(jié)合，從而增加其在體 內(nèi)的穩(wěn)定性。這些改變與天然GLP-I相比半衰期顯著延長(zhǎng)，但是這些衍生物仍然存在著制備和 純化困難，半衰期不夠長(zhǎng)的問題，并且這些衍生物都是局限于注射給藥，不能應(yīng)用于口服給 藥。本發(fā)明對(duì)GLP-I結(jié)構(gòu)進(jìn)行改變，提供一種tGLP-Ι結(jié)構(gòu)，可以增強(qiáng)其抗蛋白酶降解的能 力，從而有效地提高半衰期。由于口服給藥需藥量較大，因此，本發(fā)明同時(shí)采用基因串聯(lián) 的方法來大量表達(dá)蛋白。另外pET載體系統(tǒng)常用乳糖類似物異丙基-β -D-巰基半乳糖苷 (IPTG)誘導(dǎo)，但I(xiàn)PTG具有潛在的毒性，對(duì)菌體生長(zhǎng)有一定的抑制作用，且價(jià)格昂貴，而本發(fā) 明采用乳糖代替IPTG的方法，利用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基表達(dá)外源蛋白，使得細(xì)菌在該培養(yǎng)基中的 表達(dá)量顯著得以提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所涉及的GLP-I是指GLP-I (7-37)，其氨基酸序列(Seq ID No. 1)如下Hi s-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys _Glu_Phe_Ile_Ala_Trp_Leu_Val_Lys_Gly__Arg_Gly0本發(fā)明的目的之一是提出一種GLP-I衍生物，即tGLP-Ι，其特征在于，所述tGLP_l 的分子結(jié)構(gòu)式為 tGLP-1 (7-38)，Seq ID NO. 2 ；其中，Xaa2 是 Ser ；Xaa20 是 Gln ；Xaa28 是 Asp ；Xaa30 是 Thr, Asp, Ser, Ala, Gly, Leu, Gin, His 中的任何一種；Xaa32 是 Cys0本發(fā)明的tGLP-Ι，是指以上位點(diǎn)的氨基酸經(jīng)過本發(fā)明改造后的GLP-I蛋白。本發(fā)明的tGLP-Ι衍生物將體內(nèi)蛋白酶DPP-IV酶切位點(diǎn)突變，將胰酶酶切位點(diǎn)突 變，使其既可以抵抗DPP-IV的降解又可以抵抗胰酶的降解，從而延長(zhǎng)其在人體內(nèi)的半衰 期。本申請(qǐng)人的在先發(fā)明專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)?00910045188. 0 ；發(fā)明名稱一種GLP-I 衍生物)中所提出GLP-I衍生物，是指aGLP-1 (7-38) (Seq. ID NO. 3)，其中)(aa2是kr，His 和 D-Ala 中的任何一種；Xaa20 是 kr，His, Gln 和 Ala 的任何一種；Xaa^ 是 kr，His, Asp 和Ala的任何一種；Xaa32是Gly和Cys中的任何一種。本發(fā)明的又一目的是提供了所述tGLP-Ι的制備方法，所述制備方法的操作步驟 如下(1)首先，制備基因工程菌，其步驟為步驟①按照目的物tGLP-Ι的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子，合成以下 長(zhǎng)度為146bps的片段，即如下Seq ID No. 4所示ggagatctgg gtaccgacga cgacgacaag catagcgaag gcacctttac cagcgatgtg 60agcagctatc tggaaggcca ggccgcccag gaatttattg cctggctggt ggacggcnnn 120ggctgcaaaa ctagttaaaa gcttcc 146其中n = a或g或c或t，該片段含有腸激酶EK位點(diǎn)、tGLP-Ι基因、終止密碼子 taa及限制性內(nèi)切酶Bgl II、Spe I和HindIII位點(diǎn)。將片段克隆至pET3h⑴中，得到含TrxA-純化標(biāo)簽His Tag-腸激酶酶切位 點(diǎn)-重組人胰高血糖素樣肽-1，即含有重組人胰高血糖素樣肽-1-終止密碼子TAA的重組 pET32a(+)質(zhì)粒，pET32a-tGLP-l-Cl。用Xba I/HindIII 酶切 pET32a-tGLP_l_Cl 和 pET28a(+)，分別回收兩者的 酶切小片段和大片段，進(jìn)行連接，即得到含重組GLP-I衍生物基因的pET28a(+)質(zhì)粒， pET28a-tGLP-l-Cl。步驟②構(gòu)建含單串tGLP-Ι基因的DNA序列的菌株。將含有合成的tGLP-Ι序列的pET28a (+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BLR (DE3)或BLR (DE3)，制得含 單串tGLP-Ι基因的基因工程表達(dá)菌株。步驟③構(gòu)建高效表達(dá)tGLP-Ι的基因工程菌株以P1，P2為引物，Pl:gggctagcaaacatagcgaaggcacctttac ；P2 :ggaagcttttaactagttttgcagccnnngccgtccac ；
以含單串tGLP-Ι基因的pET28a (+)質(zhì)粒為模版進(jìn)行PCR，最終得到串聯(lián)小片段，即 如下kq ID No. 5所示gggctagcaa acatagcgaa ggcaccttta ccagcgatgt gagcagctat ctggaaggcc 60aggccgccca ggaatttatt gcctggctggt ggacggcnnn ggctgcaaa actagttaaa 120agcttcc 127其中n = a或g或c或t，Pl引入酶切位點(diǎn)Nhe I。用Spe Ι/HindIII和Nhe I/ HindIII分別酶切第二步得到的重組質(zhì)粒pEDSa-tGLP-l-Cl和第三步得到的串聯(lián)小片段， 將Spe Ι/HindIII雙酶切得到的大片段與Nhe Ι/HindIII雙酶切得到的小片段連接，得到 重組GLP-I衍生物基因的二聚體重組質(zhì)粒pEI^8a-tGLP-l-C2，Spe I和Nhe I為一對(duì)同尾 酶。重復(fù)上述步驟6次，分別得到tGLP-Ι基因的三聚體，四聚體，五聚體，六聚體，七聚體，八 聚體質(zhì)粒pET28a-tGLP-l-C3，pET28a-tGLP-l-C4, pET28a_tGLP-l_C5，pET28a-tGLP-l_C6， pET28a-tGLP-l-C7，pET28a-tGLP-l-C8。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3) 或BLR(DE3)中，得到高效表達(dá)tGLP-1的基因工程菌。本發(fā)明所述的基因工程菌是攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a，BL21(DE3)或 BLR(DEIB)，所述的重組質(zhì)粒是含GLP-I衍生物基因的質(zhì)粒pET3h(+)或pET28a (+)，所述的 重組質(zhì)粒含有tGLP-Ι基因的串?dāng)?shù)為1-8串。本發(fā)明所述的基因工程菌的進(jìn)一步特征在于所述的重組質(zhì)粒是重組質(zhì)粒 pET32a (+) -tGLP-1，或 pET28a (+) -tGLP-1 之一，也可以是 pET28a (+) -TrxA-tGLP-l，其中的 TrxA為硫氧環(huán)蛋白。(2)液體培養(yǎng)將步驟(1)所得的高效表達(dá)tGLP-Ι的基因工程菌挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng) 12-16小時(shí)，以轉(zhuǎn)接入自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-24小時(shí)，即產(chǎn)生和積累以可溶形式或包 涵體形式表達(dá)的tGLP-Ι融合蛋白。自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分為蛋白胨19. 17g/L，酵母膏9. 59g/L，Na2HP045. 72g/L, ΚΗ2Ρ045· 48g/L，(NH4)2S042 . 66g/L，NaCl 3. 33g/L，甘油 2 % (v/v)，葡萄糖 0. 68g/L，乳糖 6. 33g/L，MgSO4O. 24g/L。誘導(dǎo)條件為溫度 33°C、接種量 1 %、pH7，210rpm/min。(3)純化得到高純度tGLP-1對(duì)于以可溶形式表達(dá)的融合蛋白，將濕菌體破壁，經(jīng)鎳柱親和層析獲得含tGLP-1 融合蛋白的粗品。對(duì)于以包涵體形式表達(dá)的融合蛋白，將濕菌體破壁，離心得到包涵體蛋白沉淀，用 洗滌緩沖液洗滌包涵體，即得到較高純度的tGLP-Ι包涵體。(4)胰酶酶切得到tGLP-1將包涵體用8mol/l尿素溶解，用BSA試劑盒測(cè)蛋白濃度后，將蛋白稀釋到4_5mg/ ml，以可溶形式表達(dá)的融合蛋白直接測(cè)蛋白濃度，然后加入胰酶酶切，即得到具備生物學(xué)活 性的GLP-I衍生物。本發(fā)明的又一目的是以所述GLP-I衍生物在制備治療糖尿病的藥物中作該藥物 的活性成分的應(yīng)用。本發(fā)明GLP-I衍生物的特點(diǎn)是可采用口服給藥方式，即可以通過口服液直接口 服，也可以通過藥片、膠囊、含片等劑型給藥。
6
本發(fā)明的又一目的是提供一種藥物組合物，所述組合物含有有效量的tGLP-Ι以 及藥學(xué)上可接受的成分。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)該衍生物與GLP-I相比口服降血糖活性顯著提高；(2)通過 基因工程的技術(shù)的方法構(gòu)建含多個(gè)tGLP-Ι基因的基因工程菌，采用自誘導(dǎo)的方法，大大提 高了 tGLP-Ι的表達(dá)量；采用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，比LB培養(yǎng)基好，菌體量多，蛋白產(chǎn)量 也高，且不會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)；(3)通過鎳柱純化得到高純度的tGLP-Ι融合蛋白，對(duì)于包涵體 只要通過破菌離心、洗滌包涵體即可得到高純度的tGLP-Ι的包涵體；(4)只要通過一次胰 酶酶切即可得到較高口服降血糖活性的GLP-I衍生物；(5)通過基因工程技術(shù)的方法生產(chǎn) GLP-I衍生物，比化學(xué)合成GLP-I衍生物成本更低；(6)該衍生物基因存在于pET28a(+)質(zhì) 粒上，其含有卡那霉素抗性基因，可用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。


下面的附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案。圖 1 重組質(zhì)粒 pEI^8a(+)-tGLP-l-Cl-pEI^8a(+)-tGLP-l_C8 構(gòu)建示意圖。圖2 :tGLP-l的腹腔給藥降血糖作用效果圖。其中GLP-I為天然人胰高血糖素樣肽-1，(Thr35) -GLP-I為Xaa30 = Thr的 tGLP-1。圖3 tGLP-Ι的四串包涵體口服降血糖作用效果圖。其中GLP-I為天然人胰高血糖素樣肽-1，(Thr35)-GLP-1-C4為)(aa30 = Thr的 tGLP-Ι四串包涵體。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步詳述本發(fā)明。說明書及以下實(shí)施例中所用質(zhì)粒、菌體等， 以及未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，可按常規(guī)條件進(jìn)行，或按商品供貨商所建議的條件進(jìn)行。實(shí)施例1本發(fā)明提供的GLP-I衍生物的氨基酸序列，如kq ID No. 2，其中Xaa30 是 Thr，Asp, Ser, Ala, Gly, Leu, Gin, His 中的任何一種；Xaa2 是 kr，Xaa20 是 Gln，Xaa28 是 Asp, Xaa32 是 Cys0實(shí)施例2構(gòu)建含有一個(gè)tGLP-1基因的菌株。按tGLP-1的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子，合成以下長(zhǎng)度為146bps的片 段，即 kq ID No. 4 ggagatctgg gtaccgacga cgacgacaag catagcgaag gcacctttac cagcgatgtg 60agcagctatc tggaaggcca ggccgcccag gaatttattg cctggctggt ggacggcnnn 120ggctgcaaaa ctagttaaaa gcttcc 146其中n = a或g或c或t，該片段含有腸激酶EK位點(diǎn)、tGLP-Ι基因、終止密碼子 taa及限制性內(nèi)切酶Bgl II、Spe I和HindIII位點(diǎn)。將片段克隆至pET3h⑴中，得到含TrxA-純化標(biāo)簽Hi s Tag-腸激酶酶切位 點(diǎn)-重組人胰高血糖素樣肽-1，即含有重組人胰高血糖素樣肽-1-終止密碼子TAA的重組 pET32a(+)質(zhì)粒，pET32a-tGLP-l-Cl。用Xba I/HindHI 酶切 pET32a-tGLP_l_Cl 和 pET28a(+)，分別回收兩者的酶切小片段和大片段，進(jìn)行連接，即得到含重組GLP-I衍生物基因的pET28a⑴質(zhì)粒， pET28a-tGLP-l-Cl。將含有合成的tGLP-Ι序列的pET28a(+)質(zhì)粒(pEI^8a-tGLP-l_Cl)轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)或BLR(DE3)，制得含單串tGLP_l基因的基因工程表達(dá)菌株。實(shí)施例3構(gòu)建含高效表達(dá)tGLP-Ι的基因工程菌。Pl:gggctagcaaacatagcgaaggcacctttacP2 :ggaagcttttaactagttttgcagccnnngccgtccacgggctagcaa acatagcgaa ggcaccttta ccagcgatgt gagcagctat ctggaaggcc 60aggccgccca ggaatttatt gcctggctggt ggacggcnnn ggctgcaaa actagttaaa 120agcttcc 127以Pl，P2為引物以含單串tGLP-Ι基因的pET28a(+)質(zhì)粒為模版進(jìn)行PCR，最終 得到串聯(lián)小片段，即kqlD No. 5，其中η = a或g或c或t，Pl引入酶切位點(diǎn)Nhe I。用 Spel/Hindlll和Nhe Ι/HindIII分別酶切第二步得到的重組質(zhì)粒pEI^8a-tGLP-l_Cl和 第三步得到的串聯(lián)小片段，將Spe Ι/HindIII雙酶切得到的大片段與Nhe Ι/HindIII雙酶 切得到的小片段連接，得到重組GLP-I衍生物基因的二聚體重組質(zhì)粒PEI^8a-tGLP-l-C2， Spe I和Nhe I為一對(duì)同尾酶。重復(fù)上述酶切步驟6次，分別得到tGLP_l基因的三聚體， 四聚體，五聚體，六聚體，七聚體，八聚體質(zhì)粒pEI^8a-tGLP-l-C3，pET28a-tGLP-l-C4, pET28a-tGLP-l-C5, pET28a_tGLP-l_C6，pET28a_tGLP-l_C7，pET28a_tGLP-l_C8。將構(gòu)建好 的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE!3)或BLR(DE;3)中，得到高效表達(dá)tGLP_l的基因工 程菌。實(shí)施例4用構(gòu)建的基因工程菌生產(chǎn)tGLP-Ι，具體操作步驟第一步液體培養(yǎng)將高效表達(dá)tGLP-Ι的基因工程菌挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，以轉(zhuǎn)接 入自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，即產(chǎn)生和積累以可溶形式或包涵體形式表達(dá)的tGLP-Ι融合蛋白。第二步純化得到高純度tGLP-1對(duì)于以可溶形式表達(dá)的融合蛋白，將濕菌體破壁，經(jīng)鎳柱親和層析獲得含tGLP-1 融合蛋白的粗品。對(duì)于以包涵體形式表達(dá)的融合蛋白，將濕菌體破壁，離心得到包涵體蛋白沉淀，用 洗滌緩沖液洗滌包涵體，即得到較高純度的tGLP-Ι包涵體。第三步胰酶酶切得到tGLP-1將包涵體用8mol/L尿素溶解，用BSA試劑盒測(cè)蛋白濃度后將蛋白稀釋到4_5mg/ ml,以可溶形式表達(dá)的融合蛋白直接測(cè)蛋白濃度。然后加入胰酶酶切即得到具備生物學(xué)活 性的GLP-I衍生物。實(shí)施例5 pEI^8a-tGLP-l-Cl、pEI^8a-tGLP-l-C4、pEI^8a-tGLP-l-C8IPTG 誘導(dǎo)表 達(dá)量分析將pET28a-tGLP-l_Cl、pET28a_tGLP-l_C4，pET28a_tGLP-l_C8 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)，挑取單菌落接種于20mlLB培養(yǎng)基中，37°C，210rpm/min,過夜培養(yǎng).然后按5% 接種量轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中，37°C，210rpm/min，培養(yǎng)至OD 600 = 0. 6-0. 8，加入終濃度為
權(quán)利要求
1.一種人GLP-I衍生物，其特征在于，所述衍生物的分子結(jié)構(gòu)式為tGLP-1 (7-38)， SeqID NO. 2 ；其中，Xaa2 是 Ser ；Xaa20 是 Gln ；Xaa28 是 Asp ；Xaa30 是 Thr, Asp, Ser, Ala, Gly, Leu, Gin, His 中的任何一種；Xaa32 是 Cys0
2.如權(quán)利要求1所述GLP-I衍生物的制備方法，其特征在于，具體步驟如下(1)構(gòu)建高效表達(dá)如權(quán)利要求1所述tGLP-Ι的基因工程菌①根據(jù)如權(quán)利要求1所述tGLP-Ι的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子，合成Seq ID No. 4所示的片段，該片段含有腸激酶EK位點(diǎn)、tGLP-Ι基因、終止密碼子TAAJ^mR 切酶 Bgl II、Spe I 和 HindIII 位點(diǎn);將該片段克隆至pET3h(+)中，得到重組質(zhì)粒pET3h-tGLP-l-Cl ；用Xba Ι/HindIII酶切pET28a(+)和pET32a_tGLP-l_Cl，將兩者的酶切小片段和大片 段分別回收并連接，得到重組質(zhì)粒pET28a-tGLP-l-Cl ；②構(gòu)建含有單串tGLP-Ι基因的DNA序列的基因工程菌將重組質(zhì)粒pET28a-tGLP-l-Cl轉(zhuǎn)化BLR (DE3)，制得含單串tGLP_l基因的基因工程表 達(dá)菌株；③構(gòu)建高效表達(dá)tGLP-Ι的基因工程菌以P1，P2為引物，以含單串tGLP-Ι基因的pET28a(+)質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR，最終得到 Seq ID No. 5所示的串聯(lián)小片段；Pl:gggctagcaaacatagcgaaggcacctttacP2 :ggaagcttttaactagttttgcagccnnngccgtccac其中，Pl引入酶切位點(diǎn)Nhe I ；用Spe Ι/HindIII和Nhe Ι/HindIII分別酶切步驟②的重組質(zhì)粒pET28a-tGLP-l_Cl和 Seq ID No. 5所示的串聯(lián)小片段，將Spe Ι/HindIII雙酶切得到的大片段與Nhe Ι/HindIII 雙酶切得到的小片段連接，得到tGLP-Ι基因的二聚體重組質(zhì)粒pET28a-tGLP-l-C2 ；重復(fù) 上述酶切連接6次，分別得到tGLP-Ι基因的三聚體質(zhì)粒pET28a-tGLP-l-C3，四聚體質(zhì)粒 pET28a-tGLP-l-C4,五聚體質(zhì)粒 pET28a_tGLP-l_C5，六聚體質(zhì)粒 pET28a_tGLP-l_C6，七聚 體質(zhì)粒 pET28a-tGLP-l-C7，八聚體質(zhì)粒 pET28a_tGLP-l_C8 ；將上述重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE!3)或BLR(DE;3)中，得到高效表達(dá)tGLP_l 的基因工程菌。(2)液體培養(yǎng)將步驟(1)所得的基因工程菌挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-16小時(shí)，以轉(zhuǎn)接 入自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-M小時(shí)，產(chǎn)生和積累以可溶形式或包涵體形式表達(dá)的tGLP-Ι融 合蛋白；(3)純化得到高純度tGLP-1對(duì)于以可溶形式表達(dá)的融合蛋白，將濕菌體破壁，經(jīng)鎳柱親和層析獲得含tGLP-Ι融合 蛋白的粗品；對(duì)于以包涵體形式表達(dá)的融合蛋白，將濕菌體破壁，離心得到包涵體蛋白沉淀，用洗滌 緩沖液洗滌包涵體，得到較高純度tGLP-Ι包涵體；(4)胰酶酶切得到tGLP-1將蛋白稀釋到4-5mg/ml，加入胰酶酶切，得到具備生物學(xué)活性的tGLP-Ι衍生物。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述基因工程菌是攜帶重組質(zhì)粒 的大腸桿菌BL21 (DE3)或BLR(DEIB)，所述重組質(zhì)粒是含有人tGLP_l衍生物基因的質(zhì)粒 pET28a(+)，所述人tGLP-Ι衍生物基因的串?dāng)?shù)為1_8串。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述重組質(zhì)粒為pET3h(+)-tGLP-l， pET28a(+)-tGLP-1。
5.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟( 中的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含有蛋白 胨，酵母膏，Na2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, NaCl，甘油，葡萄糖，乳糖，MgS04。
6.如權(quán)利要求1所述tGLP-Ι在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要6所述的應(yīng)用，其中所述藥物為口服藥物。
8.一種組合物，其特征在于，所述組合物含有有效量的如權(quán)利要求1所述的tGLP-Ι，以 及藥學(xué)可接受的成分。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人GLP-1衍生物，即tGLP-1衍生物，所述衍生物的分子結(jié)構(gòu)式為tGLP-1(7-38)，Seq ID NO.2；其中，Xaa2是Ser；Xaa20是Gln；Xaa28是Asp；Xaa30是Thr，Asp，Ser，Ala，Gly，Leu，Gln，His中的任何一種；Xaa32是Cys。本發(fā)明還提供一種人GLP-1衍生物的制備方法及應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102134274SQ20101010185
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月25日
發(fā)明者吳自榮, 宋文程, 李冬青, 王小溪, 趙麗芬, 金明飛, 黃靜 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)