專利名稱：植物耐逆性相關(guān)蛋白MtCBF4及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物耐逆性相關(guān)蛋白MtCBF4及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
作為世界上影響糧食產(chǎn)量和質(zhì)量的主要負(fù)面因素之一，鹽脅迫對(duì)很多作物都會(huì)產(chǎn) 生危害。在鹽脅迫條件下，作物的生長(zhǎng)、發(fā)育和生物量都會(huì)受到很大的影響，尤其是某些依 賴于灌溉的作物減產(chǎn)更為明顯。世界上大約有超過(guò)五分之一的耕地受到鹽脅迫的威脅，而 且在全球人口增長(zhǎng)和環(huán)境污染日趨嚴(yán)重的大背景下，土地的鹽堿化問(wèn)題愈發(fā)突出，并開始 成為社會(huì)經(jīng)濟(jì)正常發(fā)展的阻力。植物對(duì)自然環(huán)境中鹽脅迫的適應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，依賴于一系列分子網(wǎng)絡(luò)的級(jí) 聯(lián)激活，即鹽脅迫的感應(yīng)、感應(yīng)信號(hào)的傳導(dǎo)、特定的與脅迫有關(guān)的基因的表達(dá)及代謝產(chǎn)物 的合成，進(jìn)而達(dá)到細(xì)胞內(nèi)離子平衡的重新建立以及相關(guān)蛋白和膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及功能的保護(hù) 和恢復(fù)，最后使植物獲得對(duì)鹽脅迫的耐受或抵抗。因此，可以利用這些基因，通過(guò)基因工程 手段，提高植物對(duì)脅迫的耐受性。植物的耐鹽性是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀，涉及到許多基因的表達(dá)和協(xié)調(diào)。目前已知 的耐鹽基因可分為四大類。第一類是參與信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄控制的基因，第二類是直接參與 蛋白和膜保護(hù)的基因，第三類是參與水和離子吸收和運(yùn)輸?shù)牡鞍?，第四類與脅迫有關(guān)的基 因通過(guò)參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯后調(diào)控而發(fā)揮作用。盡管獲得了許多耐鹽相關(guān)基因，但 是，這些基因大多來(lái)自模式生物擬南芥，由于在不同物種之間，耐鹽基因的表達(dá)模式有顯著 差異，擬南芥的耐鹽基因轉(zhuǎn)化其他植物，不一定能使這些植物具有耐鹽表形，所以，需要深 入研究多種植物的耐鹽機(jī)制，挖掘耐鹽基因。就世界范圍而言，豆科現(xiàn)在已成為僅次于禾本科的重要植物類群。豆科是世界上 第三大開花植物，既是動(dòng)物和人類獲得蛋白質(zhì)的重要來(lái)源，又是食用油和工業(yè)用油的重要 來(lái)源。因此，研究豆類植物有重要的經(jīng)濟(jì)意義和實(shí)用價(jià)值。截形苜蓿是豆科的模式植物之 一，與其他豆類植物相比，具有相對(duì)小的二倍體基因組(大約4. 5X108bp)、自花授粉、后代 種子多、生長(zhǎng)周期較短和易于組織培養(yǎng)等特點(diǎn)，截形苜?；蚪M的框架已經(jīng)測(cè)完，正在填充 框架之間的序列。將擬南芥，截形苜蓿和大豆進(jìn)行基因組水平的比較。發(fā)現(xiàn)大豆與截形苜 蓿之間，有兩大區(qū)域表現(xiàn)為線性；并且與擬南芥也有一系列線性關(guān)系的區(qū)域存在。其中，高 達(dá)75%的大豆基因表現(xiàn)為與截形苜蓿的共線性。而只有某些區(qū)域，擬南芥才與大豆有比較 高的共線性。因此，研究豆科模式植物截型苜蓿的耐鹽機(jī)制，挖掘苜蓿耐鹽相關(guān)基因，對(duì)于 培育耐鹽的豆科植物有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供植物耐逆性相關(guān)蛋白MtCBF4及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的植物耐逆性相關(guān)蛋白(MtCBF4)，為一種轉(zhuǎn)錄因子，來(lái)源于截型苜蓿 (Medicago truncatula)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。序列表中的序列1由205個(gè)氨基酸殘 基組成。為了使(a)中的MtCBF4便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成 的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列 上述(b)中的MtCBF4可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。 上述(b)中的MtCBF4的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或 幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和 /或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼上述植物耐逆性相關(guān)蛋白的基因(MtCBF4)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因可為如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2自5，端第n至628位核苷酸所示的DNA分子(cDNA)；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分 子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的 DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。含有以上任一所述基因的重組表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植 物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與 mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的 3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆
4貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種 增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子 (Ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因 構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可 以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證 整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也 可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行 加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、 螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是 抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選 擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組表達(dá)載體是將所述基因插入pCAMBIA1302的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì) 粒。所述重組表達(dá)載體具體可為在PCAMBIA1302的Nco I和Spe I酶切位點(diǎn)之間插入所述 基因得到的重組質(zhì)粒。含有以上任一所述基因(MtCBF4)的表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及重組菌均屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增所述基因(MtCBF4)全長(zhǎng)或任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育耐旱轉(zhuǎn)基因植物的方法，可將編碼所述植物耐逆性相關(guān)蛋白 的基因?qū)肽康闹参?如植物細(xì)胞或組織)中，得到耐逆性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植 物。具體來(lái)說(shuō)，可以將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的 轉(zhuǎn)基因植物。所述耐逆性具體可為耐鹽脅迫和/或耐干旱脅迫。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將編碼所述蛋白的基因?qū)?入植物細(xì)胞，可獲得耐旱能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。攜帶有所述基因的表達(dá) 載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介 導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植 物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如大豆、煙草、百脈根、擬南芥、水稻、 小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。MtCBF4基因參與截型苜蓿的鹽脅迫和干旱脅迫應(yīng)答反應(yīng)。將MtCBF4基因?qū)氤?發(fā)植物，可以得到耐逆性顯著高于出發(fā)植物的轉(zhuǎn)基因植物，本發(fā)明對(duì)于培育耐鹽、耐干旱的 轉(zhuǎn)基因豆科作物具有重要價(jià)值。


圖1為重組表達(dá)載體pl302_MtCBF4的構(gòu)建流程圖。圖2為抗生素陽(yáng)性植株的PCR檢測(cè)產(chǎn)物電泳圖；1 :lkb DNA ladder,由下到上分別 為 250bp，500bp，750bp，1000bp，1500bp，2000bp ；2 陰性對(duì)照；3 陽(yáng)性對(duì)照；4-11 抗生素 陽(yáng)性植株。
圖3為抗生素陽(yáng)性植株的RT-PCR檢測(cè)產(chǎn)物電泳圖；MtActinll為參比。圖4為植物鹽脅迫實(shí)驗(yàn)后的萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)圖。圖5為植物干旱脅迫實(shí)驗(yàn)后的照片；A 對(duì)照；B 干旱脅迫。圖6為植物干旱脅迫實(shí)驗(yàn)后的存活率統(tǒng)計(jì)圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。截型苜蓿2007年 2 月申小葉購(gòu)自法國(guó) INRA BRC-MTR biological Resource Centre for the model species Medicago truncatula L.；原女臺(tái)來(lái)源不i青。擬南芥(Columbia生態(tài)型)購(gòu)自salk公司。農(nóng)桿菌EHA105 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)；抗生素抑制農(nóng)桿菌的效果及對(duì)條斑紫菜生長(zhǎng)發(fā)育 的影響，王萍等，水產(chǎn)科學(xué)，2009 28(7)。實(shí)施例1、MtCBF4基因的發(fā)現(xiàn)通過(guò)兩次芯片實(shí)驗(yàn)建立截型苜蓿完善的苜蓿種子萌發(fā)期和苗期鹽脅迫基因表 達(dá)譜，并對(duì)受鹽脅迫顯著誘導(dǎo)的基因進(jìn)行聚類分析和G0注釋分析，對(duì)感興趣的探針進(jìn)行 GeneBins水平的pathway分類分析，基本構(gòu)建了苜蓿耐鹽調(diào)控網(wǎng)絡(luò)框架。在此基礎(chǔ)上建立 截形苜蓿鹽脅迫表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)。發(fā)現(xiàn)了一個(gè)鹽誘導(dǎo)后表達(dá)量顯著上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因 子在200mM NaCL誘導(dǎo)5小時(shí)后表達(dá)量上調(diào)64倍。將序列1所示氨基酸殘基組成的蛋白命名為MtCBF4蛋白，將MtCBF4蛋白的編碼 基因命名為MtCBF4基因，其編碼區(qū)如序列表的序列2自5’端第11至628位核苷酸所示。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因植物的獲得和耐逆性鑒定一、MtCBF4基因的克隆由Invitrogen公司合成特異性引物對(duì)。MtCBF4_5' 5' -TAC CAT GGA CAT GTT TAC TAT GAA TCA ATT-3’ ；MtCBF4_3，5，-ATA CTA GTT TAA AAT GAG TAA CTC CAC A_3，。以截型苜蓿的cDNA為模板，用特異性引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物插入PMD18-T simple載體(購(gòu)自TaKaRa生物工程公司)，得到重組載體 pMD18-Tsimple-MtCBF4。經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物具有序列表中序列2所示的核苷酸 (MtCBF4 基因)。二、重組表達(dá)載體(pl302_MtCBF4)的構(gòu)建構(gòu)建過(guò)程參見圖1。1、用限制性內(nèi)切酶Nco I和Spe I雙酶切載體pMD18_T simple_MtCBF4，回收小片 段(MtCBF4基因)；2、用限制性內(nèi)切酶 Nco I 和 Spe I 雙酶載體 pCAMBIA1302 (Center for the Application of Molecular Biology to International Agriclture, www, cambia. org), 回收大片段(骨架載體)；3、將步驟1回收的小片段和步驟2回收的大片段連接，得到連接產(chǎn)物；將連接產(chǎn)物
6進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，得到了重組表達(dá)載體pl302-MtCBF4(骨架載體為pCAMBIA1302， 在Nco I和Spe I位點(diǎn)間插入了序列2所示的MtCBF4基因)。三、重組農(nóng)桿菌的制備1、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取農(nóng)桿菌EHA105單菌落接種于100ml YEB液體培養(yǎng)基中，220rpm、28°C振蕩培 養(yǎng)至OD600 = 0 . 5 ；轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管，5000rpm離心5min，去上清，加入10ml預(yù)冷的0. 15M的 CaCl2溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置20min ；4°C>5000rpm離心5min，去上清，加入4ml預(yù)冷 的含10%甘油的0. 15M的CaCl2溶液，輕輕懸浮；農(nóng)桿菌懸浮液分裝于無(wú)菌印pendorf管 中，每管200iU于液氮中速凍lmin，凍存于-70°C。2、重組農(nóng)桿菌的制備取liig pl302-MtCBF4加入到200iU EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，靜止5min ； 液氮中速凍lmin，37°C水浴5min，加入1ml YEB液體培養(yǎng)基，28 °C、150rpm振蕩培養(yǎng)4h ； 5000rpm離心3min，棄上清，加入0. lml YEB液體培養(yǎng)基，重新懸浮細(xì)胞；涂布于YEB固體平 板(含50 ii g/ml卡那霉素和50 u g/ml利福平)上，28°C培養(yǎng)約48h。PCR 鑒定陽(yáng)性克隆(引物5，引物5，-ATG GAA GCA CAA AGC GCT CAC-3，；3，引 物5，-TTA GCG TTC TAT CTG AAT AGT TAC AT-3，)。結(jié)果顯示，pl302_MtCBF4 已經(jīng)成功 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，得到重組農(nóng)桿菌。四、轉(zhuǎn)基因植物的獲得1、將重組農(nóng)桿菌接種于10ml YEB液體培養(yǎng)基(含50 y g/ml卡那霉素和50 u g/ml 利福平)中，28°C、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；2、轉(zhuǎn)化前一天以1 50體積比(v v)接種于200ml含相同抗生素的YEB培養(yǎng) 基中擴(kuò)大培養(yǎng)至0D_為1. 2-1. 6，5000rpm、15min離心集菌，重懸，使0D_為0. 8 ；3、采用Foral dip法將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化花蕾期的擬南芥在擬南芥抽苔4_5cm時(shí)剪去頂端花序，使腋生花序生長(zhǎng)，剪時(shí)傷口應(yīng)位于最高的 莖生葉上方，約4-5天后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化前要使土壤充分濕透且將大的花蕾去掉，只保留未 開放的小花蕾；轉(zhuǎn)化時(shí)將擬南芥整株與花盆一起倒扣在盛有200ml重組農(nóng)桿菌菌液的容器 中浸泡2-3min，浸泡完畢后，取出花盆，側(cè)放于托盤中，蓋上黑色塑料布，24hr后揭開塑料 布，直立放置花盆，進(jìn)行正常的光照培養(yǎng)，收獲代種子。4、抗生素(潮霉素；Hyg+)篩選收獲1\種子后，播種于MS固體平板(含80mg/L潮霉素)上，4°C春化72hr，置22°C 光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10天，轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)為真葉呈深綠色，根深長(zhǎng)至培養(yǎng)基中，將轉(zhuǎn)化體移 至不含抗生素的MS培養(yǎng)基中，6-8天后將綠色的幼苗轉(zhuǎn)到土壤中繁種，收獲的種子。篩選2代，得到T3代種子。5、分子檢測(cè)(l)PCR 檢測(cè)以T3代擬南芥的基因組DNA為模板(pl302_MtCBF4為陽(yáng)性對(duì)照，野生型擬南芥的 基因組DNA為陰性對(duì)照)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(5，引物5，-ATG GAA GCA CAA AGC GCT CAC-3’; 3，引物5’ -TTA GCG TTC TAT CTG AAT AGT TAC AT-3’ 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系(50ii 1) :ddH20 37 u 1,10XPCR Buffer 5u 1,(1^ (251111)4111，5，引物1111，3，引物 liil，rTaq 酶(5U/yl) 1 yl，模板(lu g/u l)lu 10PCR 反應(yīng)程序94°C變性 5min ；94°C變性 50sec，56°C復(fù)性 50sec，72°C延伸 lmin, 30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。電泳圖見圖2。8株T3代擬南芥獲得了預(yù)期618bp的片段，選泳道7和11對(duì)應(yīng)的 兩個(gè)植株(L17和L24)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。(2) RT-PCR 檢測(cè)①Trizol法提取PCR陽(yáng)性植株(L17和L24)以及野生型擬南芥的總RNA。②以完整性好、無(wú)污染的RNA為模板，用M-MLV酶(購(gòu)自Promage公司)反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系RNA(1. Oil g/iil)8. 0iil，01igd T 2. 0 u l,RNfree H205. 0 yl ；混勻后， 短暫離心將之收集于管底，72°C溫育5min，再立即置于冰上5min ；再加入5XM-MLV Buffer 2. Oil 1、dNTP 2. Oil 1、RTase M-MLV (200U/ u 1)0. 75 u 1, HPR(40U/u 1)0. 25 u 1,混勻，短 暫離心將之收集于管底，在42°C溫育60min，70°C反應(yīng)15min，取出置于冰上，離心后儲(chǔ)存 于-20 °C。③以0. 5iU反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同步驟 ⑴。如圖3所示，L17和L24RT-PCR結(jié)果獲得了預(yù)期618bp的片段，表明MtCBF4在擬 南芥中表達(dá)。五、轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植物的獲得用pCAMBIA1302代替pl302_MtCBF4，步驟同步驟三和步驟四，得到轉(zhuǎn)空載體對(duì)照
擬南芥。六、轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性鑒定分別將野生型擬南芥(WT)、轉(zhuǎn)空載體對(duì)照擬南芥、L17擬南芥和L24擬南芥的種子 (每個(gè)植株20粒種子)進(jìn)行鹽脅迫實(shí)驗(yàn)和干旱脅迫實(shí)驗(yàn)。1、鹽脅迫實(shí)驗(yàn)將擬南芥種子種于含有220mM NaCl的MS培養(yǎng)基上，4°C春化72hr，光照培養(yǎng)7天， 進(jìn)行萌發(fā)率計(jì)算(以根長(zhǎng)1mm為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn))。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4所示(結(jié)果為三次實(shí)驗(yàn)的平均值)。野生型擬南芥的萌發(fā)率是 46. 83%,L17種子的萌發(fā)率為79. 66%,L24種子的萌發(fā)率分別為62. 86%。野生型擬南芥 和轉(zhuǎn)空載體對(duì)照的萌發(fā)率相近，L17擬南芥和L24擬南芥種子的萌發(fā)率顯著高于野生型擬 南芥，表明轉(zhuǎn)基因擬南芥較野生型擬南芥有更高的抗鹽能力。2、干旱脅迫實(shí)驗(yàn)將擬南芥種子種于種于MS培養(yǎng)基上，4°C春化72hr，光照培養(yǎng)7天，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)土 (營(yíng)養(yǎng)土 蛭石=1 1)，澆水3周后，干旱處理(不澆水)2周，復(fù)水4天后拍照，并計(jì)算 存活率。正常澆水的擬南芥種子采用完全相同的條件培養(yǎng)，作為對(duì)照。照片見圖5，存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖6 (結(jié)果為三次實(shí)驗(yàn)的平均值)。野生型擬南芥 的存活率是17. 71%,L17的存活率是55. 68%,L24的存活率是30. 73%。野生型擬南芥和 轉(zhuǎn)空載體對(duì)照的存活率相近，L17擬南芥和L24擬南芥種子的存活率顯著高于野生型擬南 芥，表明轉(zhuǎn)基因擬南芥較野生型擬南芥有更高的抗干旱能力。
權(quán)利要求
一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)或4)的 DNA分子1)序列表中序列2自5’端第11至628位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體是將權(quán)利要求2 或3所述基因插入pCAMBIA1302的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。
6.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因的全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)。
7.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到?逆性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述基因通過(guò)權(quán)利要求4或 5所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述耐逆性為耐鹽和/或耐干旱。
10.如權(quán)利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物耐逆性相關(guān)蛋白MtCBF4及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。MtCBF4基因參與截型苜蓿的鹽脅迫和干旱脅迫應(yīng)答反應(yīng)。將MtCBF4基因?qū)氤霭l(fā)植物，可以得到耐逆性顯著高于出發(fā)植物的轉(zhuǎn)基因植物，本發(fā)明對(duì)于培育耐鹽、耐干旱的轉(zhuǎn)基因豆科作物具有重要價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101851282SQ201010101689
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月26日
發(fā)明者張運(yùn)芹, 王濤, 申小葉, 董江麗 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)