專利名稱：用dna檢測技術分析羊絨質量的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物DNA檢測技術的應用，特別是一種用DNA檢測技術分析羊絨質量 的方法。
背景技術：
世界上的羊絨制品主要有綿羊絨和山羊絨兩種。因為山羊絨比綿羊絨細膩、柔軟、 保暖性好，所以它的質量和價格都高于綿羊絨。少數(shù)不法之徒為牟取暴利人為地將綿羊絨 摻入山羊絨，嚴重地損害了消費者利益。中國現(xiàn)有的山羊絨和綿羊絨的鑒定辦法是用顯微 鏡觀察羊絨纖維的結構，利用其表面結構的不同來區(qū)分二者?，F(xiàn)有技術的最明顯的缺陷在于1.鑒定的主觀性鑒定全靠技術人員的經驗判 斷，沒有任何科學數(shù)據(jù)；2.鑒定方法的不確定性鑒定方法全靠定性描述，他人很難重復； 3.無法鑒定深度處理過的羊毛。深度處理過的羊毛，如深度染色等，因為羊毛結構或光學特 性發(fā)生了變化，現(xiàn)有方法無法鑒定。從進化來看，山羊(Capra hircus)和綿羊(Ovis aries)屬于不同的屬，他們大約 在5至8百萬年前就在生殖上相互分離了，他們的DNA有相當大的差異。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術之不足，提供一種用DNA檢測技術分析羊絨質量的 方法，本發(fā)明的目的按照下述方案實現(xiàn)用DNA檢測技術分析羊絨質量的方法，其檢測過程為先從待測樣品上提取DNA， 再用綿羊或山羊探針進行實時聚合酶鏈式反應，最后對反應結果進行數(shù)值分析得出樣品中 山羊絨或綿羊絨的含量；上述實時聚合酶鏈式反應的過程為，先制備綿羊TaqMan MGB探針和山羊I1aqMan MGB探針，在試管內，分別與待測樣品DNA進行實時聚合酶鏈式反應，反應所加試劑有 IxPCR 緩沖液、MgCl2、dNTP、PCR 正向引物、PCR 反向引物、TaqMan MGB 探針、GoldTaq DNA 聚 合酶、DNA樣品，反應溫度95 °C，11分鐘，40個循環(huán)，每個循環(huán)，94°C 30秒，65 °C 30秒，反應 過程中實時測定試管內液體的相對熒光量；上述綿羊 TaqMan MGB 探針為FAM-ataattataaaaacaaaa_MGB，山羊 TaqManMGB 探 :FAM-ataattacagaaacaaaa-MGB, ^ ψ FAM ^^7^^14 6-carboxyfluorescein ^if
寫，MBG 是粹光劑 dihydrocyclopyrroloindole tripeptideMinor Groove Binder 的縮寫；上述山羊絨含量的分析過程為先制備不同山羊DNA濃度的標準樣，與山羊 TaqMan MGB探針進行實時聚合酶鏈式反應，測定其相對熒光量，根據(jù)結果制出標準曲線或 歸納線性方程式，對待測樣品在同等條件下進行實時聚合酶鏈式反應，測定其相對熒光量， 對照結果可以得出樣品中山羊絨含量；上述綿羊絨含量的分析過程為先制備不同綿羊DNA濃度的標準樣，與綿羊 TaqMan MGB探針進行實時聚合酶鏈式反應，測定其相對熒光量，根據(jù)結果制出標準曲線或
3歸納線性方程式，對待測樣品在同等條件下進行實時聚合酶鏈式反應，測定其相對熒光量， 對照結果可以得出樣品中綿羊絨含量。本發(fā)明從根本上克服了現(xiàn)有技術的主觀性，不確定性，使得鑒定深度加工的含羊 絨制品成為現(xiàn)實，羊毛、羊絨鑒定從一門藝術變成了現(xiàn)代科技。


圖1是山羊和綿羊線粒體DNA基因片段序列比較圖；圖2是TaqMan MGB反應的圖解圖；圖3是綿羊毛DNA樣品與山羊或綿羊的TaqMan MGB探針反應結果圖；圖4是山羊毛DNA樣品與山羊或綿羊的TaqMan MGB探針反應結果圖；圖5是不同濃度的山羊DNA在山羊TaqMan探針中的反應結果圖；圖6是山羊DNA量的對數(shù)與其Ct作圖得到的標準曲線圖；圖7是綿羊DNA量的對數(shù)與其Ct作圖得到的標準曲線具體實施例方式通過系統(tǒng)比較山羊和綿羊線粒體DNA，發(fā)現(xiàn)其12S rRNA基因是一個能區(qū)分山羊和 綿羊的優(yōu)良檢測目標。如附圖1所示，“Query”是綿羊的12S rRNA基因片段，“Sbjct”是山 羊的12S rRNA基因片段，他們之間相同的堿基用豎線標出，而不同的堿基則用空格標出。在上述堿基序列第238和240位置處綿羊和山羊DNA產生了變異，分別從T變成 了 C和從A變成了 G。由此，我們訂制了綿羊和山羊專一的TaqMan MGB探針，如下綿羊 TaqMan MGB :FAM-ataattataaaaacaaaa-MGBLij^ TaqMan MGB ΜΨ[‘ :FAM-ataattacagaaacaaaa-MGB在上述探針中，F(xiàn)AM是熒光染料6-carboxyfluorescein的縮寫，MBG是猝光劑 dihydrocyclopyrroIoindole tripeptide Minor Groove Binder 的縮寫。當FAM禾Π MGB被同時連在TaqMan MGB探針上時，由于FRET效應 (FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer))，F(xiàn)AM 的熒光將被猝光劑 MGB 吸收而 無法發(fā)出。但在聚合酶鏈式反應(PCR)中，探針將被DNA聚合酶水解，使FAM游離出來，發(fā) 出熒光。iTaqMan MGB反應的圖解見附圖2 DNA由兩條反向螺旋鏈組成，且這兩條鏈上的堿基彼此互補，腺嘌呤對胸腺嘧啶 (A對T)，鳥嘌呤對胞嘧啶(G對C)。當DNA雙鏈的堿基不互補時，它們將無法形成穩(wěn)定的 DNA雙螺旋結構。如上所述，我們已經通過DNA測序，發(fā)現(xiàn)綿羊和山羊的線粒體上12S rRNA 基因有差別，我們根據(jù)這些差別設計出山羊和綿羊特異的TaqMan MGB探針。山羊的TaqMan MGB探針只能和山羊的12SrRNA基因完全互補，形成穩(wěn)定的DNA雙螺旋結構；反之綿羊的 TaqMan MGB探針只能和綿羊的12S rRNA基因完全互補，形成穩(wěn)定的DNA雙螺旋結構。因 為TaqMan MGB PCR反應產生熒光的先決條件是TaqMan MGB探針與其互補鏈形成穩(wěn)定的結 構，所以綿羊探針只有和綿羊DNA在一起時才能產生熒光，反之山羊探針只有和山羊DNA在 一起時才能產生熒光。當有一個未知樣品時，可以將該未知樣品加入兩個試管中，并在兩個試管中分別 加入綿羊探針和山羊探針，然后啟動TaqMan MGB PCR反應。如果加綿羊探針的試管產生熒光，則該未知樣品為綿羊毛；如果加山羊探針的試管產生熒光，則該未知樣品為山羊毛；如 果兩種探針的試管同時產生熒光，則該樣品為山綿羊毛混合樣品；如果兩種探針試管都不 產生熒光，則該未知物不是羊毛制品。具體測試方法如下1、TaqMan MGB PCR 反應條件如下在伯樂公司的96孔板上，加入下述反應試劑IxPCR緩沖液II (ABI，無Mg2+)， 3mM MgCl2, 300mM dNTP，200nM PCR 正向引物，200nM 反向引物，300nM TaqMan MGB 探針，IU GoldTaq DNA聚合酶(ABI)，DNA樣品，總反應體積為12. 5微升。TaqMan MGB PCR反應溫度控制如下95°C 11分鐘，40個循環(huán)(每個循環(huán)94°C 30 秒，65°C 30 秒)。2、實驗結果如下(1)綿羊毛DNA樣品與山羊或綿羊的TaqMan MGB探針反應結果如附圖3所示。在 這個實驗中，綿羊DNA分別與綿羊探針和山羊探針進行TaqMan MGB反應。綿羊DNA是2. Opg 純化的綿羊12S rRNA基因PCR片段。從這個實驗我們可以看出，綿羊毛DNA僅和綿羊探針 發(fā)生TaqMan反應并產生熒光，綿羊毛DNA幾乎不和山羊探針發(fā)生TaqMan反應。(2)山羊毛DNA樣品與山羊或綿羊的TaqMan MGB探針反應如附圖4所示。在這個實驗中，山羊DNA分別與綿羊探針和山羊探針進行TaqMan MGB反應。山羊 DNA是2. Opg純化的山羊12S rRNA基因PCR片段。從這個實驗我們可以看出，山羊毛DNA 僅和山羊探針發(fā)生TaqMan反應并產生熒光，山羊毛DNA幾乎不和綿羊探針發(fā)生TaqMan反 應。山羊絨和綿羊絨含量的測定山羊DNA經過系列稀釋，制成不同濃度的標準樣，然后加入TaqMan MGB反應試管 中，與山羊探針反應。不同量的山羊DNA需要不同的PCR循環(huán)方可產生可測熒光(該PCR 循環(huán)數(shù)稱為Ct或閾值循環(huán)數(shù))；起始山羊DNA量越少，Ct越大，亦即需要更多的PCR循環(huán)方 可產生可測熒光。不同濃度的山羊DNA在山羊TaqMan探針中的反應結果見附圖5。將上面 試驗中山羊DNA量的對數(shù)與其Ct作圖，我們可以得到如附圖6的對應關系標準曲線。用綿羊毛DNA通過上述方法可以得到類似的對應關系標準曲線，如附圖7所示。上兩個山羊和綿羊的濃度試驗表明，我們不僅可以用TaqMan MGB反應區(qū)分山羊毛 和綿羊毛，我們還可以通過TaqMan MGB反應的Ct值來準確地測定其各自的濃度，從而對樣 品中山羊絨和綿羊絨的含量進行定量分析。
權利要求
1.用DNA檢測技術分析羊絨質量的方法，其特征在于其檢測過程為先從待測樣品上 提取DNA，再用綿羊或山羊探針進行實時聚合酶鏈式反應，最后對反應結果進行數(shù)值分析得 出樣品中山羊絨或綿羊絨的含量。
2.如權利要求1所述的用DNA檢測技術分析羊絨質量的方法，其特征在于上述實時聚 合酶鏈式反應的過程為，先制備綿羊iTaqMan MGB探針和山羊TaqManMGB探針，在試管內，分 別與待測樣品DNA進行聚合酶鏈式反應，反應所加試劑有l(wèi)x PCR緩沖液、MgCl2、dNTP、PCR 正向引物、PCR反向引物、TaqMan MGB探針、GoIdTaq DNA聚合酶、DNA樣品，反應溫度95°C， 11分鐘，40個循環(huán)，每個循環(huán)94°C 30秒，65°C 30秒，反應過程中實時測定試管內液體的相 對熒光量。
3.如權利要求1所述的用DNA檢測技術分析羊絨質量的方法，其特征在于上 述綿羊 TaqMan MGB 探針為FAM-ataattataaaaacaaaa_MGB，山羊 TaqMan MGB 探針 FAM-ataattacagaaacaaaa-MGB，其中，F(xiàn)AM 是熒光染料 6-carboxyfluorescein 的縮寫，MGB 是粹光劑 dihydrocyclopyrroloindoletripeptide Minor Groove Binder 的縮寫。
4.如權利要求1所述的用DNA檢測技術分析羊絨質量的方法，其特征在于山羊絨含量 的分析過程為先制備不同山羊DNA濃度的標準樣，進行實時聚合酶鏈式反應，測定其相對 熒光量，根據(jù)結果制出標準曲線或歸納線性方程式，對待測樣品在同等條件下進行實時聚 合酶鏈式反應，測定其相對熒光量，對照結果可以得出樣品中山羊絨含量。
5.如權利要求1所述的用DNA檢測技術分析羊絨質量的方法，其特征在于綿羊絨含量 的分析過程為先制備不同綿羊DNA濃度的標準樣，進行實時聚合酶鏈式反應，測定其相對 熒光量，根據(jù)結果制出標準曲線或歸納線性方程式，對待測樣品在同等條件下進行實時聚 合酶鏈式反應，測定其相對熒光量，對照結果可以得出樣品中綿羊絨含量。
全文摘要
本發(fā)明是一種用DNA檢測技術分析羊絨質量的方法，其檢測過程為先從待測樣品上提取DNA，再用綿羊或山羊探針進行實時聚合酶鏈式反應，最后對反應結果進行數(shù)值分析得出樣品中山羊絨或綿羊絨的含量。聚合酶鏈式反應的過程為，先制備綿羊TaqMan MGB探針和山羊TaqMan MGB探針，在試管內，分別與待測樣品DNA進行聚合酶鏈式反應，反應所加試劑有1xPCR緩沖液、MgCl2、dNTP、PCR正向引物、PCR反向引物、TaqMan MGB探針、GoldTaq DNA聚合酶、DNA樣品，反應溫度95℃，11分鐘，40個循環(huán)，每個循環(huán)94℃ 30秒，65℃ 30秒，反應過程中實時測定試管內液體的相對熒光量。
文檔編號C12Q1/68GK102146431SQ20101010143
公開日2011年8月10日 申請日期2010年1月27日 優(yōu)先權日2010年1月27日
發(fā)明者計皖 申請人:寧夏鼎實生物鑒定中心(有限公司)