專利名稱：一種用于革蘭氏陽(yáng)性菌的高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物領(lǐng)域，具體涉及一種用于革蘭氏陽(yáng)性菌的高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng) (pBTn)。
背景技術(shù)：
革蘭氏陽(yáng)性菌特別是金黃色葡萄球菌是目前醫(yī)院感染最常見的病原體之一。 許多國(guó)家都設(shè)有專門機(jī)構(gòu)，應(yīng)對(duì)金葡菌的院內(nèi)感染問題。研究報(bào)道，隨著fi-內(nèi)酰 胺類抗生素的廣泛應(yīng)用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)隨之增加，且引起 的感染和病死率有逐年增加的趨勢(shì)。金葡菌感染引起的疾病包括化膿性炎癥，如 傷口化膿、骨、關(guān)節(jié)的感染，也可以引起內(nèi)臟器官感染，如肺炎、膿胸、中耳炎、 心包炎、心內(nèi)膜炎等；另外嚴(yán)重者可引起全身感染如敗血癥、膿毒血癥等。特別 是1999年-2000年，高致病力社區(qū)來源性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的出現(xiàn)，所 致疾病已引起國(guó)際恐慌，其主要引起嚴(yán)重的敗血癥以及致死性肺炎等，感染者死 亡率明顯增高。由于其高致病力和高致死率，國(guó)際上將其作為繼HIV之后第二 大危及人類生命的病原微生物，其毒力因子及致病機(jī)理更是目前國(guó)際各研究部門 研究熱點(diǎn)。
現(xiàn)有技術(shù)公開了若干有關(guān)從細(xì)菌基因組中篩選出需要的基因的方法。目前比 較可行的方法是，首先利用有效的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)隨機(jī)插入到目的菌的基因組中，建立 轉(zhuǎn)座子突變文庫(kù)，然后采用一定的篩選方法篩選出生物形狀改變的克隆，進(jìn)而明 確轉(zhuǎn)座子插入基因組的具體基因位置，進(jìn)一步對(duì)基因功能進(jìn)行研究。目前已公開 的用于構(gòu)建轉(zhuǎn)座子突變文庫(kù)的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)主要為Tn551或Tn917。但實(shí)踐表明， 該種轉(zhuǎn)座系統(tǒng)用于革蘭氏陽(yáng)性菌，經(jīng)誘導(dǎo)插入基因組并不是隨機(jī)插入，而往往是 插入到幾個(gè)特定的基因位點(diǎn)，因此，不具有隨機(jī)性插入到基因組的特點(diǎn)，致使用 該種轉(zhuǎn)座系統(tǒng)建立的轉(zhuǎn)座子突變文庫(kù)不具隨機(jī)性和實(shí)用性。其導(dǎo)致之后的以此突 變文庫(kù)為基礎(chǔ)進(jìn)行的研究帶來相當(dāng)?shù)睦щy。此問題已成為構(gòu)建有效的突變文庫(kù)的 瓶頸，因此，重新構(gòu)建新的有效的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，對(duì)臨床實(shí)踐而言顯得尤為必要。研究人員分析上述Tn551或Tn917不能隨機(jī)插入到革蘭氏陽(yáng)性菌基因組的主要原 因可能是其轉(zhuǎn)座酶的原因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種可以高度隨機(jī)性，單 一性，穩(wěn)定性地插入革蘭氏陽(yáng)性菌基因組中的mariner based的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)。具體
涉及一種用于革蘭氏陽(yáng)性菌的高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)(pBTn)。
本發(fā)明構(gòu)建了新的mariner based轉(zhuǎn)座系統(tǒng)pBTn,是用于革蘭氏陽(yáng)性菌的高
效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，其特征是包括溫度敏感性質(zhì)粒，藥物耐藥基因和轉(zhuǎn)座酶，其中，溫
度敏感性質(zhì)粒作為載體，溫度敏感性質(zhì)粒中插入藥物耐藥基因，耐藥基因和轉(zhuǎn)座
酶之間插入特定的啟動(dòng)子，使有效地控制轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的時(shí)間，無明顯基因的插入熱點(diǎn)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座酶來源于mariner真核轉(zhuǎn)座子。本發(fā)明的mariner based轉(zhuǎn)座系統(tǒng)具有良好的隨機(jī)性，單一性和穩(wěn)定性地插入到革蘭氏陽(yáng)性菌基因組 的特點(diǎn)，無明顯基因的插入熱點(diǎn)。所述的轉(zhuǎn)座子突變文庫(kù)具有顯著高的隨機(jī)性和 實(shí)用性，其使用效果明顯高于目前被廣泛使用的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)Tn551或Tn917。本發(fā)明 為進(jìn)一步研究革蘭氏陽(yáng)性菌基因組中基因的功能奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明中，采用溫度敏感性質(zhì)粒PBT2作為載體，所述的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入目的 菌中后，可以通過升高培養(yǎng)溫度而將該質(zhì)粒去除；
本發(fā)明中，在溫度敏感性質(zhì)粒pBT2中插入紅霉素的耐藥基因，該耐藥基因 兩端帶有重復(fù)序列；
本發(fā)明中，mariner based的轉(zhuǎn)座酶來源于pBADA7;
本發(fā)明中，在所述的紅霉素的耐藥基因以及所述的轉(zhuǎn)座酶之間插入來源于 PTX15的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在葡萄糖存在下被遏制表達(dá)，只有在無葡萄糖或木糖 存在下才可活化，從而可以有效地控制轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的時(shí)間。
本發(fā)明的用于革蘭氏陽(yáng)性菌的高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)(PBTn)通過下述方法和步驟建
立
1) 用PCR方法從質(zhì)粒pEC2擴(kuò)增兩端帶有重復(fù)序列的紅霉素的耐藥基因并克隆 到溫度敏感性質(zhì)粒pBT2上，重組質(zhì)粒命名為pBT2IR;
2) 將木糖誘導(dǎo)性啟動(dòng)子基因從pTX15酶切下來連接入pBT2IR，重組質(zhì)粒命名為pBT2IRXY;
3)用PCR方法從質(zhì)粒pBADA7擴(kuò)增mariner based的轉(zhuǎn)座酶基因并克隆到質(zhì)粒 pBT2IRXY上，該重組質(zhì)粒命名為pBTn。
上述步驟l)中，用PCR方法從質(zhì)粒pEC2 (Dr. Michael Otto實(shí)驗(yàn)室)擴(kuò)增兩 端帶有重復(fù)序列的紅霉素的耐藥基因(IRerm)， 擴(kuò)增過程中使用的引物分別是序列1和序列2的
IRXba: 5、-TTTTTCTAGATAACAGGTTGGCTGATAAGTCCCCGGTCTGTCC GAGAGTGATTGGTCTTGCGTATGG-3、和IR Pst 5、-TTTTCTGCAGTAACAGG TTGGCTGATAAGTCCCCGGTCTCCCCGTAGGCGCTAGGGACCTCTTTAGC-3' (下劃線為酶切位點(diǎn))，
IRerm的擴(kuò)增模版為質(zhì)粒pEC2 (含紅霉素的耐藥基因)；
擴(kuò)增條件為95'C預(yù)變性5分鐘，95°C1分鐘，55'Cl分鐘，72°C1分鐘，共
35個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸10分鐘。
將IRerm克隆到溫度敏感性質(zhì)粒pBT2 (Dr. Michael O加實(shí)驗(yàn)室)上-取100pl紅霉素耐藥基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA純化試劑(Qiagen)，按說 明書進(jìn)行純化，最后用40 pl ddH20進(jìn)行洗脫。取該純化產(chǎn)物20 nl， 10xbuffer 4 Hi, Xbal (Roche) 2 pl， Pst I (Roche) 2 pi, ddH20 12ja1， 37。C 4h,對(duì)酶切產(chǎn)物 切膠回收純化。同樣對(duì)質(zhì)粒pBT2用Xba I和Pst I酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物切膠回收 純化。取pBT2酶切純化產(chǎn)物3 jil，紅霉素耐藥基因酶切純化產(chǎn)物8 pi, 10xbuffer 3pl， T4連接酶(Roche) 1^1， ddH20 15^1， 16°C連接過夜。取上述連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐青霉素+紅霉素平板，37'C過夜培養(yǎng)后挑取陽(yáng) 性克隆，提取質(zhì)粒作初步鑒定，最后經(jīng)測(cè)序確證，將重組質(zhì)粒命名為pBT2IR。
上述步驟2)中，將木糖誘導(dǎo)性啟動(dòng)子基因從pTX15(Dr. Michael O加實(shí)驗(yàn) 室)酶切下來連接入pBT2IR:質(zhì)粒pTX15用Xba I和BamH I酶切，電泳，將 長(zhǎng)度約為1900bp片段切膠回收純化(木糖誘導(dǎo)性啟動(dòng)子基因)。質(zhì)粒pBT2IR同 樣用Xba I和BamH I酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物切膠回收純化。取pBT2IR酶切純化產(chǎn) 物3pl，取從pTX15酶切下來的木糖誘導(dǎo)性啟動(dòng)子基因純化產(chǎn)物8[il， 10xbuffer 3[U, T4連接酶lpl， ddH20 15nl，， 16'C連接過夜。取上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐青霉素+紅霉素平板，37'C過夜培養(yǎng)后挑取陽(yáng)性克隆，提 取質(zhì)粒作初步鑒定，最后經(jīng)測(cè)序確證，將重組質(zhì)粒命名為pBT2IRXY。
上述步驟3 )中，用PCR方法從質(zhì)粒pBADA7(來源于美國(guó)NIH)擴(kuò)增mariner based的轉(zhuǎn)座酶基因(transposase， Tn):在擴(kuò)增過程中使用的引物分別是序列3 禾口 4的TnBam 5、- CCATAAGATTAGCGGATCCTACCTAACGC -3、和TnKpn 5、國(guó) CCTGCAGGTACCGGTCTAACAAAGAAAAACAC -3、(下劃線為酶切位點(diǎn))。 mariner based的轉(zhuǎn)座酶基因的擴(kuò)增模版為質(zhì)粒pBADA7 (mariner based的轉(zhuǎn)座酶 基因)。擴(kuò)增條件為95'C預(yù)變性5分鐘，95'C1分鐘，55'C1分鐘，72'C1分鐘， 共35個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸10分鐘。
將mariner based的轉(zhuǎn)座酶基因克隆到質(zhì)粒pBT2IRXY上mariner based的 轉(zhuǎn)座酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA純化試劑進(jìn)行純化。取該純化產(chǎn)物20 pl， 10xbuffer 4 pl， BamH I 2 pl， Kpn 12 pl， ddH20 12^1， 37°C 4h,對(duì)酶切產(chǎn)物切膠回 收純化。同樣對(duì)質(zhì)粒pBT2IRXY用BamHI和Kpnl酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物切膠回收 純化。取pBT2IRXY酶切純化產(chǎn)物3 pi, mariner based的轉(zhuǎn)座酶基因酶切純化 產(chǎn)物8 nl， lOxbuffer 3 pl， T4連接酶1 pl， ddH20 15pl, 16°C連接過夜。取上述 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐青霉素+紅霉素平板，37'C過夜培養(yǎng) 后挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒作初步鑒定，最后經(jīng)測(cè)序確證，將重組質(zhì)粒命名為 pBTn (圖1)。


圖1是本發(fā)明構(gòu)建的mariner based轉(zhuǎn)座系統(tǒng)pBTn示意圖， 其中顯示,在溫度敏感性質(zhì)粒pBT2中插入兩端帶有重復(fù)序列的紅霉素的耐藥 基因，來源于mariner真核轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶來源于pBADA7，在紅霉素的耐藥基 因以及轉(zhuǎn)座酶之間插入來源于pTX15的啟動(dòng)子，這一啟動(dòng)子在葡萄糖存在下被遏 制表達(dá)，只有在無葡萄糖，木糖存在下才可活化。
圖2是用Southern blot的方法分析轉(zhuǎn)座子單一性插入金黃色葡萄球菌的基 因組中的結(jié)果圖，
其中顯示，隨機(jī)挑取10個(gè)可以在紅霉素平板上生長(zhǎng)而不能在氯霉素平板上 生長(zhǎng)的陽(yáng)性克隆，抽提基因組DNA，用EcoRI進(jìn)行酶解消化后電泳，轉(zhuǎn)膜。以紅霉素抗性基因?yàn)樘结樳M(jìn)行Southern blot,以確定紅霉素抗性基因在基因組是否 為單一條帶。Southern blot結(jié)果顯示所有克隆基因組DNA中紅霉素抗性基因均 為單一性插入(100%)。
圖3為50個(gè)克隆紅霉素抗性基因插入金黃色葡萄球菌的基因組位點(diǎn)的示意 圖，圖中第圈l和圈2表示金黃色葡萄球菌可能的編碼序列，按基因的功能類別 不同用不同的顏色表示；第三圈表示金黃色葡萄球菌的rRNA， sRNA， tRNA; 第四圈為50個(gè)克隆紅霉素抗性基因插入金黃色葡萄球菌的基因組位點(diǎn)，其中紅 色數(shù)字為經(jīng)測(cè)序確定為同一插入位點(diǎn)的克隆數(shù)，結(jié)果顯示隨機(jī)插入率為86% (43/50)，無明顯插入熱點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l
1. 革蘭氏陽(yáng)性菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備(以金黃色葡萄球菌為例)
(1) 取金黃色葡萄球菌儲(chǔ)存液1(^1接種50ml新鮮的TSB， 37'C，180rpm搖 菌過夜。
(2) 取1 ml培養(yǎng)過夜的菌液接種100ml新鮮的TSB， 37'C， 180rpm搖菌至 細(xì)菌OD值為0.4-0.5。
(3) 菌液室溫4000rpm離心20分鐘，棄上清，細(xì)菌用10%的甘油溶液洗5次
(4) 最后細(xì)胞懸浮于1 ml 10%的甘油溶液,按60[tl/管進(jìn)行分裝后-8(TC保存.
2. 將新構(gòu)建的mariner based轉(zhuǎn)座系統(tǒng)(pBTn)轉(zhuǎn)入革蘭氏陽(yáng)性菌(以金黃色葡萄 球菌為例)
(1) 60^1電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞室溫復(fù)蘇5分鐘
(2) 60nl電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中加入pBTn DNA 10嗎，輕輕混勻后室溫放置30分鐘
(3) 將混合液轉(zhuǎn)入0.2ml的電轉(zhuǎn)杯，2KV， 25pF，電轉(zhuǎn)。
(4) 電轉(zhuǎn)后立即加入900W新鮮的TSB， 30°C， 180rpm搖菌3h.
(5) 涂布氯霉素+紅霉素平板，30'C過夜培養(yǎng)20h后挑取陽(yáng)性克隆
3. 轉(zhuǎn)座子突變文庫(kù)的建立(1) 選取上述單個(gè)克隆接種100ml新鮮的TSB (無葡萄糖，含氯霉素與紅霉 素)，30°C， 180rpm搖菌過夜。
(2) 取上述過夜菌液20ml接種500 ml新鮮的TSB (無葡萄糖，含木糖,氯霉 素與紅霉素)，30°C， 180rpm搖菌過夜.
(3) 取上述過夜菌液20 ml接種500 ml新鮮的TSB (無葡萄糖，含紅霉素)， 43°C， 180rpm搖菌過夜.
(4) 重復(fù)步驟(3)至少2次.
(5) 取上述過夜菌液20ml接種500ml新鮮的TSB(無葡萄糖)，43°C， 180rpm 搖菌過夜.
(6) 取上述菌液lml，進(jìn)行一系列的稀釋后各取100^1涂布紅霉素平板，37'C培 養(yǎng)過夜.
(7) 選取在紅霉素平板生長(zhǎng)，氯霉素平板上不生長(zhǎng)的克隆為轉(zhuǎn)座子插入的陽(yáng)性 克隆進(jìn)行保存，以備分析.
4.轉(zhuǎn)座子插入基因組位點(diǎn)的確定
用于鑒定轉(zhuǎn)座子插入基因組位點(diǎn)所用的引物如表l所示。 第一輪PCR反應(yīng)所用的引物為引物arbl或arb2 (40 pmol/反應(yīng))和erm引 物(erm-5.3或erm-5.2， erm-3.3，或erm-3.2; 20pmol/反應(yīng))。總反應(yīng)體系為30nl， 模版DNAlnl。 PCR反應(yīng)條件:95"C預(yù)變性5分鐘，3(TC30s， 72'C1分鐘，共6個(gè) 循環(huán)，然后94'C30s， 45。C30s， 72'C1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸10分鐘。 第二輪PCR反應(yīng)所用的引物為引物arb3(40 pmol/反應(yīng))和erm引物(erm-5.2， erm-5.1， erm-3.2，或erm-3.1; 20pmol/反應(yīng))?？偡磻?yīng)體系為30nl，模版為第一輪 PCR產(chǎn)物3nl。 PCR反應(yīng)條件94°C30 s， 45°C30 s， 72'C1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最 后72'C延伸10分鐘。
第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)過DNA純化后可以直接進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序引物為erm-5.3 或erm-3.3。測(cè)序結(jié)果通過比對(duì)，明確紅霉素抗性基因插入基因位點(diǎn)(圖3)。表l
引物名稱及(序列序號(hào))5、3'序列
erm-5.1 erm-5.2 erm-5,3 erm-3.1 erm-3.2 erm-3.3
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
STAPHarbl (11) STAPHarb2 (12) arb3 (13)
GCTTCTAAGTCTTATTTCCATAAC
AGATAATGCACTATCAACACACTC
TCTACATTACGCATTTGGAATAC
TAGGTATACTACTGACAGCTTC
ATTCTATGAGTCGCTTTTGTA
TACTTATGAGCAAGTATTGTCTA GGCCACGCGTCGACTAGTCANNNNNNNNNNGATAT GGCCACGCGTCGACTAGTCANNNNNNNNNNGATCA GGCCACGCGTCGACTAGTCA<uo>復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院
<120> —種用于革蘭氏陽(yáng)性菌的高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)
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< 170> Patentln version 3.1
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<213>革蘭氏陽(yáng)性菌
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飾ctaga taacaggttg gctgataagt ccccggtctg tccgagagtg attggtcttg 60 cgtatgg 67
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權(quán)利要求
1、一種用于革蘭氏陽(yáng)性菌的高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，其特征是包括溫度敏感性質(zhì)粒，藥物耐藥基因和轉(zhuǎn)座酶，其中，溫度敏感性質(zhì)粒作為載體，溫度敏感性質(zhì)粒中插入藥物耐藥基因，耐藥基因和轉(zhuǎn)座酶之間插入特定的啟動(dòng)子，使有效地控制轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的時(shí)間，無明顯基因的插入熱點(diǎn)，命名為pBTn。
2、 按權(quán)利要求1所述的用于革蘭氏陽(yáng)性菌的高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，其特征是所述的 作為載體的溫度敏感性質(zhì)粒為pBT2，其轉(zhuǎn)入目的菌中后，通過升高培養(yǎng)溫度被 去除。
3、 按權(quán)利要求1所述的用于革蘭氏陽(yáng)性菌的高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，其特征是所述的 藥物耐藥基因是兩端帶有重復(fù)序列的紅霉素的耐藥基因。
4、 按權(quán)利要求1所述的用于革蘭氏陽(yáng)性菌的高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，其特征是所述的 轉(zhuǎn)座酶來源于mariner真核轉(zhuǎn)座子。
5、 按權(quán)利要求1所述的用于革蘭氏陽(yáng)性菌的高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，其特征是所述的 轉(zhuǎn)座酶來源于pBADA7。
6、 按權(quán)利要求1所述的用于革蘭氏陽(yáng)性菌的高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，其特征是所述的 耐藥基因和轉(zhuǎn)座酶之間插入的啟動(dòng)子為來源于pTX15的啟動(dòng)子。
7、 按權(quán)利要求1或5所述的用于革蘭氏陽(yáng)性菌的高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，其特征是所 述的啟動(dòng)子在葡萄糖存在下被遏制表達(dá)，在無葡萄糖，木糖存在下活化。
8、 權(quán)利要求1的用于革蘭氏陽(yáng)性菌的高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的制備方法，其特征是通 過下述方法制備，1) 用PCR方法從質(zhì)粒pEC2擴(kuò)增兩端帶有重復(fù)序列的紅霉素的耐藥基因并 克隆到溫度敏感性質(zhì)粒pBT2上，重組質(zhì)粒命名為pBT2IR;2) 將木糖誘導(dǎo)性啟動(dòng)子基因從pTX15酶切下來連接入pBT2IR,重組質(zhì)粒 命名為pBT2IRXY;3) 用PCR方法從質(zhì)粒pBADA7擴(kuò)增mariner based的轉(zhuǎn)座酶基因并克隆到 質(zhì)粒pBT2IRXY上，重組質(zhì)粒命名為pBTn。
全文摘要
本發(fā)明屬微生物領(lǐng)域，涉及一種用于革蘭氏陽(yáng)性菌的高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)pBTn，采用溫度敏感性質(zhì)粒pBT2作為載體，其成功轉(zhuǎn)入目的菌中后，通過升高培養(yǎng)溫度而被去除；溫度敏感性質(zhì)粒中插入兩端帶有重復(fù)序列的紅霉素的耐藥基因，在紅霉素的耐藥基因和來源于mariner真核轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶間插入來源于pTX15的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在葡萄糖存在下被遏制表達(dá)，在無葡萄糖，木糖存在可活化，能有效地控制轉(zhuǎn)座酶表達(dá)的時(shí)間。本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)座子突變文庫(kù)無明顯插入熱點(diǎn)，具有高度隨機(jī)性和單一性插入到革蘭氏陽(yáng)性菌基因組的特點(diǎn)。實(shí)用性明顯高于目前被廣泛使用于原核生物的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)Tn551或Tn917。
文檔編號(hào)C12R1/445GK101597617SQ20091005403
公開日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者元 呂, 敏 李, 蔣曉飛 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院