專利名稱：：玉米基因Opaque1的分子標記及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種玉米基因的分子標記及其應用，特別是一種玉米基因0paquel的分子標記及其應用。技術(shù)背景谷類作物提供了人類攝取蛋白的50%左右，而在發(fā)展中國家則占到了70%(GibbonandLarkins，2005)。隨著世界人口的持續(xù)增長、以及發(fā)展中國家飲食結(jié)構(gòu)的不斷調(diào)整，在世界有限的耕地上需要生產(chǎn)出更多的糧食。因此，糧食問題日益凸現(xiàn)、急需解決。玉米(Z朋歷^^L.)是世界上分布最廣的作物之一，栽培面積僅次于小麥和水稻位居世界第三位。它是全世界同時也是我國主要的糧食和飼料作物。據(jù)FA0統(tǒng)計，從1998年起，玉米總產(chǎn)量已超過小麥和水稻成為世界第一大糧食作物(史桂榮，2002)。玉米目前最主要的用途是作物飼料。作為飼料，玉米的蛋白含量和品質(zhì)是育種的重要目標。通常，玉米胚乳含有90%的淀粉和10%的蛋白。而這些蛋白中70%的成分是醇溶蛋白，也稱作玉米蛋白(zein)。它是一類在種子發(fā)育過程中特異表達的蛋白，主要起貯存自由氨基酸的作用。醇溶蛋白又可以進一步分為四類，分別是a、e、y和5醇溶蛋白。其中最大的一類是a醇溶蛋白。a醇溶蛋白基因家族根據(jù)所編碼蛋白的分子大小，又分為22kDa醇溶蛋白和19kDa醇溶蛋白兩個部分。a醇溶蛋白約占醇溶蛋白總量的80X以上，是決定種子蛋白含量的重要因素。各種類型的醇溶蛋白形成不可溶的組織，稱為蛋白體(proteinbody),分布于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔中。在籽粒成熟過程中，蛋白體堆積于玻璃質(zhì)胚乳區(qū)域的淀粉粒間。玉米雖然含有較好的蛋白含量，但其蛋白品質(zhì)卻并不理想。這主要表現(xiàn)在玉米的必需氨基酸含量并不均衡，特別是缺乏必需氨基酸賴氨酸。氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，是蛋白質(zhì)水解的最終產(chǎn)物。有8種氨基酸在人體內(nèi)不能合成，必須從外界食物中攝取。它們是蘇氨酸、色氨酸、賴氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，統(tǒng)稱"必需氨基酸"。8種必需氨基酸中，以賴氨酸影響最大，但在普通玉米中缺乏也最多。因此高賴氨酸玉米的培育是提高玉米蛋白品質(zhì)的重點。高賴氨酸玉米與普通玉米最本質(zhì)的區(qū)別是胚乳中各種蛋白質(zhì)組成及蛋白質(zhì)氨基酸組成的差異。高賴氨酸玉米營養(yǎng)價值提高的原因是其醇溶蛋白含量下降；而谷蛋白、白蛋白、球蛋白等非醇溶蛋白含量相對提高。由此表明，玉米種子中儲藏蛋白的相對表達量顯著地影響著玉米作為動物飼料的營養(yǎng)價值，因此對蛋白質(zhì)含量以及成分的改變是培育高蛋白品質(zhì)玉米的關(guān)鍵途徑。玉米的一些籽粒突變對儲藏蛋白的氨基酸含量有很大的影響，其中最為顯著的是玉米的粉質(zhì)籽粒突變體(Opaque突變體)。這些籽粒突變體都定位在不同的玉米染色體位點，都不同程度地改變了儲藏蛋白的積累和必需氨基酸的含量，因此在玉米蛋白品質(zhì)的遺傳育種上都具有潛在的價值。其中&a^/e-J(02)是一種能夠顯著改變胚乳儲藏蛋白氨基酸含量的突變類型。玉米胚乳粉質(zhì)突變體opa^ye湖發(fā)現(xiàn)為玉米品質(zhì)改造創(chuàng)新提供了極為重要的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)oi通過減少醇溶蛋白的合成、增加其它富含賴氨酸的蛋白質(zhì)，從而最終提高胚乳中賴氨酸的含量。除o2外，玉米中還存在大量其它的Opaque突變體，它們都在不同程度上影響了儲藏蛋白的含量和必需氨基酸的含量，在玉米高必需氨基酸的遺傳育種上具有潛在的應用價值。叩鄰^/(oD是玉米經(jīng)典的粉質(zhì)胚乳突變體，最早由Singleton和Jones發(fā)現(xiàn)，呈現(xiàn)出柔軟、粉質(zhì)的籽粒表型。ol突變體在特定遺傳背景下(如A69Y等)，能產(chǎn)生o2突變體類似的效應，賴氨酸含量增加，蛋白品質(zhì)提高(Balconietal.，1998)。經(jīng)典遺傳學將ol是定位于玉米第四號染色體長臂的一個基因。已有的實驗證據(jù)表明其引起賴氨酸含量增加的機制有別于o2等其他突變體。因此可以在多重突變的情況下，通過效應疊加，進一步增強賴氨酸等必需氨基酸的含量。所以ol無論是單獨使用，或是和o2等其他高賴氨酸突變體聯(lián)合使用，都將對高賴氨酸或高必需氨基酸含量的高品質(zhì)玉米的培養(yǎng)起到很好的作用。Opaquel基因至今未通過雜交育種被很好地利用。首先是因為ol由隱性基因突變引起，通過雜交選育需要較長的時間；其次，由于籽粒在脫水過程中受外界環(huán)境影響，最終收獲的籽粒在表型鑒定上存在一定誤差，所以在籽粒成熟時對ol類型籽粒的選擇上存在較大難度。DNA分子標記輔助育種是一項新的育種技術(shù)，該技術(shù)是通過利用與目標性狀緊密連鎖的DNA分子標記對控制目標性狀的基因進行間接選擇的現(xiàn)代育種技術(shù)。該技術(shù)對目標基因的轉(zhuǎn)移，不僅可在早代進行準確、穩(wěn)定的選擇，而且可克服再度利用隱性基因時識別難的問題，從而加速育種進程，提高育種效率。與常規(guī)育種相比，該技術(shù)可提高育種效率2-3倍。由于其明顯的優(yōu)越性，該技術(shù)己引起了發(fā)達國家的高度重視。DNA分子標記輔助育種技術(shù)的關(guān)鍵是(1)獲得的分子標記應該是能夠區(qū)分育種過程中雜交親本(純合Ol類型和純合野生型類型)以及它們雜交子代(Fl代)的共顯性標記；(2)獲得的共顯性分子標記位于該基因在染色體物理位置的兩側(cè)；(3)兩側(cè)的DNA分子標記都應該與控制目標性狀的基因緊密連鎖。但是，以往研究中并沒有獲得位于01基因染色體物理位置兩側(cè)的與其緊密連鎖的共顯性DNA分子標記，故無法對該基因所控制的目標性狀進行DNA分子標記輔助選擇。所以，對于該種標記的獲得和鑒定是對玉米高氨某酸品質(zhì)某閔01講行DNA分^MiB輔fltS種J5^1。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一在于提供一種玉米基因Op叫uel的分子標記。本發(fā)明的目的之二在于提供在該分子標記在檢測和區(qū)分玉米育種過程中雜交親本(01類型以及育種中廣泛使用的野生型自交系B73、Mo17、W64A和W22類型，)以及它們雜交子代(F1代)類型中的應用。為達到上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案一種玉米基因0paquel的分子標記，其特征在于擴增DNA片斷IDPg21的特異性引物及堿基序列為正向引物從5'端至3'端為GGGCTTATCTCGCTCTCCA;反向引物從5，端至3'端為GGTGCCGGGCATAGTCTAA;擴增DNA片斷IDPg25的特異性引物及堿基序列為正向引物從5，端至3，端為CGCTTATTGATGAGCAGTCTG;反向引物從5，端至3'端為GGATACTATACTCGATCGCAAT。一種上述的玉米基因0paquel的分子標記在檢測和區(qū)分玉米育種過程中雜交親本以及它們雜交子代類型中的應用。本發(fā)明通過經(jīng)典的遺傳定位獲知基因定位在玉米第4號染色體的長臂上(Bin4.07)。通過在01位點附近為純合突變體和純合野生型的植株構(gòu)建的回交群體(BC)，提取純合突變體、野生型以及BC群體各單株的基因組DNA。在前人粗定位的基礎(chǔ)上，通過篩選已有的SSR分子標記，獲取有多態(tài)性的SSR類型分子標記(umc2027與umcl999)，將01基因定位于分子標記umc2027與umcl999之間。根據(jù)umc2027與咖cl999之間已知的B73基因組序列(http:〃麗.genome,arizona.edu/fpc/maize)'設(shè)計引物。通過測序以及序列比對，獲得純合突變體與純合野生型親本間的序列差異，并通過所測序列開發(fā)標記，獲得能夠區(qū)分育種過程中雜交親本(純合01類型和純合野生型類型)以及它們雜交子代(Fl代)的共顯性分子標記IDPg21與IDPg25。以遺傳學中兩點與三點測驗對這2個共顯性分子標記與01基因的遺傳連鎖關(guān)系進行分析表明，這兩個標記位于01基因染色體物理位置的兩側(cè)，并且均與該基因緊密連鎖。以IDPg21與IDPg25對01與B73、Mol7、W22、W64A和BSSS53進行PCR擴增和凝膠電泳分析表明，IDPg21在01與B73、Mo17、W64A、W22和BSSS53均具有多態(tài)性。IDPg25在01與B73、Mo17、W64A和W22具有多態(tài)性。本發(fā)明提供的2個位于01基因染色體物理位置兩側(cè)的與其緊密連鎖的共顯性DNA分子標記，以及利用這兩個共顯件DNA分子標記對01某閔講行分子標記輔助詵擇的方法。利用這兩個分子標記能對玉米任何時期和任何組織的DNA進行基因型鑒定，檢測雜交育種子代各單株中01基因的存在與否以及雜合或純合狀態(tài)。這種檢測方法的準確性高，操作簡單，為利用01基因的DNA分子標記輔助育種提供重要的技術(shù)手段。圖l是玉米籽粒純合突變體外形圖，(01/01)籽粒，圖2為玉米籽粒野生型(+/+)籽粒。圖3是用于進行01基因定位的BC群體構(gòu)建路線。圖4是標記IDPg21在BC群體中的分離情況，其中01/01:01為純合體；OlA為雜合體；-為負對照；圖5是標記IDPg25在BC群體中的分離情況，其中01/01:01為純合體；01/+為雜合體；-為負對照；圖6是本發(fā)明中分子標記在玉米四號染色體長臂上的示意位置，其中CEN4代表四號染色體著絲粒，TEL代表端粒；圖7是標記IDPg21在不同自交系間的多態(tài)情況；圖8是標記IDPg25在不同自交系間的多態(tài)情況具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.)或植物分子生物學一實驗手冊(PlantMolecularBiology—ALaboratoryManual,MelodyS.Clark編，Springer-verlagBerlinHeidelberg,1997)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例一兩個共顯性分子標記的獲得及與01連鎖關(guān)系的確定通過純合突變體(01/01)與純合野生型(+/+)雜交獲得Fl(01/+)，然后以F1為母本，純合突變體為父本進行回交構(gòu)建回交(BC)群體，參見圖3。BC群體中出現(xiàn)了基因型分離，包含01/+與01/01兩種基因型，具有01/+基因型的與+/+基因型的籽粒均為非Opaque的野生型類型，具有01/01基因型的籽粒為Opaque的突變體類型，參見圖1和圖2。取BC群體中Opaque以及非Opaque類型的籽粒各1000粒以及純合突變體與純合野生型親本籽粒，將兩個親本以及Opaque以及非Opaque類型的籽粒分別放在盛有自來水的培養(yǎng)皿中室溫(22—25'C)浸泡7小時后，種于蛭石介質(zhì)中萌發(fā)，約一周后，在苗抽出第三片葉時，取約lcii^葉片放于1.5mlEDDendorf管中，放入液氮中諫凍。對所有材料講行DNA抽提，抽6提步驟如下-1.速凍后的葉片用塑料棒于Eppendorf管中磨碎，加入500W抽提液(Tris-HC1lOOmMpH8.5;EDTA20mMpH8.0:NaCllOOmM:月桂基肌氨酸鈉1%),劇烈混勻后室溫放置10min。2.在管中再加入500W酚氯仿異戊醇(25:24:1)，劇烈混勻后室溫放置10min。3.4'C8000g離心10min，吸取上清液400W至另一新的Eppendorf管，加入500W氯仿，輕柔混勻，室溫放置10min。4.4'C8000g離心10min，吸取上清液300Hl至另一新的E卯endorf管，加入750nl無水乙醇，輕柔混勻后，一20。C放置30min。5.4'C12000g離心10min，棄上清液，加入500Pl70%乙醇，輕柔顛倒Eppendorf管，室溫放置5min。6.重復步驟5。7.4'C12000g離心10min，棄上清液，放置超凈臺上自然風干。8.用50WTE(Tris-HC110mMpH8.0;EDTAlmMpH8.0)溶解沉淀。保存于一20。C。9.取lWDNA樣品稀釋50倍，以紫外分光光度計測樣品的0D260和0D280，通過0D260計算DNA樣品濃度。10.依據(jù)濃度，將樣品統(tǒng)一稀釋至50ng/ul，取lW用于PCR反應。PCR體系按照北京鼎國生物公司提供的Taq酶說明書配制，溫度條件94°C1min;94'C20sec,58。C20sec,72°C40sec,32循環(huán)；72°C7min。PCR產(chǎn)物加入1/10體積的10Xloadingbuffer,上樣于10%聚丙烯酰胺凝膠上，電泳至溴酚藍跑出底線，經(jīng)溴化乙錠染色后應用凝膠圖像分析系統(tǒng)記錄結(jié)果，參見圖3和圖4。經(jīng)分析電泳結(jié)果，篩選到玉米數(shù)據(jù)庫(www.maizegdb.org)可以獲得的分子標記(咖c2027,umcl999),通過初步定位將01定位于umc2027與umcl999。再通過分析這兩個標記間的B73基因組序列，在基因非翻譯及內(nèi)含子區(qū)設(shè)計特異性引物，回收PCR產(chǎn)物，測序，比較野生型和突變體間的基因組差異。依據(jù)有差異的基因組區(qū)段設(shè)計引物，參見表l。通過PCR擴增以及凝膠(瓊脂糖或聚丙烯酰胺)電泳分析，獲得了兩個共顯性分子標記IDPg21和IDPg25。進一步將BC群體中的單株數(shù)擴大到7000株，按照以上方法提取基因組DNA，進行PCR、電泳以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。分析結(jié)果表明，有50株在分子標記IDPg01A和017間發(fā)生交換，有75株在分子標記IDPg25和01間發(fā)生交換，有125株在分子標記IDPg21和IDPg25之間發(fā)生交換。這些證據(jù)說明，IDPg21和IDPg25分別位于01基因染色體物理位置的兩側(cè)，分子標記IDPg21和01間遺傳距離為0.71cM，分子標記IDPg25和01間遺傳距離為1.07cM，參見圖6。表一分子標記引物表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例二分子標記在不同親本間的多態(tài)性鑒定使用實施例一中的方法提取Ol、野生型和四種育種中廣泛使用的自交系B73、Mo17、W64A和BSSS53的基因組DNA，通過PCR反應識別在不同品種間的多態(tài)性。結(jié)果表明，使用本發(fā)明中的分子標記IDPg21可以區(qū)別01與B73、Mo17、W64A、W22和BSSS53這五種自交系，IDPgl5可以區(qū)別01與B73、Mo17、W64A和W22這四種自交系。在以B73、Mo17、W64A和W22這四種自交系為背景導入01基因進行優(yōu)質(zhì)蛋白玉米育種時，分子標記IDPg21和IDPg25可以起到對01基因進行輔助選擇的作用，參見圖7和圖8。實施例三IDPg21和IDPg25對01基因分子標記輔助選擇的方法利用這兩個共顯性分子標記IDPg21和IDPg25，可以鑒定01的基因型。分子標記IDPg21和IDPg25對某一雜交組合中的子代進行分析，兩側(cè)標記同為野生型(如B73、Mo17、W64A和W22)類型條帶植株的基因型即為野生型，兩側(cè)的分子標記同為雜合體(如Fl)類型條帶植株的基因型即為雜合體，兩側(cè)的分子標記同為01/01純和突變體類型條帶植株的基因型即為突變體。通過這兩個分子標記對雜交育種時子代各個單株進行基因型鑒定的準確性很高，錯選概率僅為1.89X10—5,所以這兩種分子標記對利用01基因進行分子育種時具有重要的輔助作用。序列表<110〉上海大學<120〉玉米基因0paquel的分子標記及其應用<160〉5<210〉1<211〉19<212>腿<213〉人工序列〈400〉1GGGCTTATCTCGCTCTCCA19<210〉2〈211〉19〈212>DNA〈213〉人工序列〈210〉3〈211〉21<212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉3CGCTTATTGATGAGCAGTCTG21<210>4〈211〉22<212>DNA〈213>人工序列<400>4GGATACTATACTCGATCGCAAT22<400>GGTGC2CGGGCATAGTCTAA權(quán)利要求1.一種玉米基因Opaquel的分子標記，其特征在于擴增DNA片斷IDPg21的特異性引物及堿基序列為正向引物從5’端至3’端為GGGCTTATCTCGCTCTCCA；反向引物從5’端至3’端為GGTGCCGGGCATAGTCTAA；擴增DNA片斷IDPg25的特異性引物及堿基序列為正向引物從5’端至3’端為CGCTTATTGATGAGCAGTCTG；反向引物從5’端至3’端為GGATACTATACTCGATCGCAAT。2.—種根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米基因Opaquel的分子標記在檢測和區(qū)分玉米育種過程中雜交親本以及它們雜交子代類型中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及一種玉米基因Opaque1的分子標記及其應用。該分子標記的擴增DNA片斷IDPg21的特異性引物及堿基序列為正向引物從5’端至3’端為GGGCTTATCTCGCTCTCCA，反向引物從5’端至3’端為GGTGCCGGGCATAGTCTAA；擴增DNA片斷IDPg25的特異性引物及堿基序列為正向引物從5’端至3’端為CGCTTATTGATGAGCAGTCTG，反向引物從5’端至3’端為GGATACTATACTCGATCGCAAT。利用本發(fā)明的兩個分子標記能對玉米任何時期和任何組織的DNA進行基因型鑒定，檢測雜交育種子代各單株中01基因的存在與否以及雜合或純合狀態(tài)。這種檢測方法的準確性高，操作簡單，為利用01基因的DNA分子標記輔助育種提供重要的技術(shù)手段。文檔編號C12Q1/68GK101629210SQ20091005386公開日2010年1月20日申請日期2009年6月26日優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日發(fā)明者宋任濤,晶張,林佃彬,慧王,王桂鳳,許政暟申請人:上海大學