專利名稱：一種具有抗氧化性活性的乳清蛋白活性肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及通過酶解從乳清蛋白中獲得具有抗氧化 功能活性肽的方法，以及由該方法獲得的具有抗氧化功能的活性肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
牛乳是一種成分復(fù)雜的生物流體，其中蛋白質(zhì)含量為30 35g/L，主要由酪蛋白 和乳清蛋白組成，其中酪蛋白約占80%，乳清蛋白約占20%。牛乳中含有大量不同活性的 生物活性肽，這些肽或自然存在于乳中或源于蛋白水解后的產(chǎn)物。乳清蛋白經(jīng)蛋白酶酶 解得到的生物活性肽因具有多種生理功能，如免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、抗高血壓、降膽固醇、抗菌 等，是一種多功能營養(yǎng)因子，被廣泛的應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。近年來，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)某些氨基酸、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)酶解物還具有清除自由基的抗氧 化的活性。如Jung等人(1995)，Chen等人(1996,1998)研究發(fā)現(xiàn)某些氨基酸，如Glu、Met、 Tyr、HiS、LyS、Pro、CyS等具有清除羥基自由基的作用。Satu&Gracia等人(2000)發(fā)現(xiàn)乳 清蛋白中的乳鐵傳遞蛋白對鐵具有親合力，特別是在富含鐵的嬰兒食品中能夠抑制由鐵催 化的氧化作用，其認(rèn)為乳清蛋白的抗氧化活性可能是由于其提供了氫原子還原自由基以及 來源于半胱氨酸的游離的巰基基團(tuán)而抑制了脂類的自動氧化。Rival等人(2001)發(fā)現(xiàn)酪蛋 白和酪蛋白酶解物具有抑制亞油酸氧化的作用和自由基清除活性。2003年P(guān)efia-Ramos 和Xiong發(fā)現(xiàn)乳清蛋白的promatex酶解物在烤豬肉餅中具有抗氧化效果，其推測可能是通 過抑制初期的脂類氧化反應(yīng)(防止氫過氧化物和共扼二烯烴的形成)，進(jìn)而延遲了氧化的 進(jìn)程。自由基是人體生命活動過程中生物化學(xué)反應(yīng)的中間產(chǎn)物。正常情況下，機(jī)體內(nèi)自 由基的產(chǎn)生和清除處于一種動態(tài)平衡中，不會對機(jī)體造成損害。但當(dāng)自由基和活性氧基團(tuán) (R0S)的產(chǎn)生過量時(shí)，或者隨著年齡的增長，機(jī)體正常的氧化還原平衡被破壞；脂類，蛋白 質(zhì)和DNA就會發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞并引起機(jī)體的損傷衰老，也 是誘發(fā)腫瘤等惡性疾病的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，通過補(bǔ)充抗氧化劑可以清除自由基，提高機(jī) 體的抗氧化能力，降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平。因此，抗氧化的藥物或食品得到了廣泛的研究和 應(yīng)用。但是現(xiàn)有的乳源生物活性肽是作為多功能營養(yǎng)因子被生產(chǎn)制備的。通常以蛋白質(zhì) 水解度為衡量標(biāo)準(zhǔn)，而不是以特定的功能特性(如抗氧化活性)為目標(biāo)來進(jìn)行制備的，生產(chǎn) 工藝中并沒有特別的避免抗氧化活性的損失。因此這樣所獲得的乳源生物活性肽不僅成分 復(fù)雜，具有特定功能特性的活性肽含量較低，抗氧化活性不強(qiáng)，功能特性不專一，而且還會 造成原料的大量浪費(fèi)，生產(chǎn)成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有的乳清蛋白活性肽存在的抗氧化活 性肽含量低，抗氧化活性不強(qiáng)的不足，提供一種具有抗氧化活性的乳清蛋白活性肽及其制備方法，該制備方法特別富集了乳清蛋白活性肽中的抗氧化的成分，避免了抗氧化活性的 下降，所得的乳清蛋白活性肽具有良好的抗氧化活性，可以作為抗氧化的功能性產(chǎn)品。本發(fā)明人選用各種蛋白酶來水解乳清蛋白，在制備過程中采用可以保留抗氧化活 性的方法，避免導(dǎo)致抗氧化活性降低的操作，終于得到了具有良好抗氧化活性的乳清蛋白 活性肽。因此，本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是，一種具有抗氧化活性的乳清蛋白 活性肽的制備方法，包括以下步驟(1)將蛋白酶加入乳清蛋白溶液中進(jìn)行酶解，其中酶解溫度為40 60°C，pH6.0 8. 0 ；⑵酶解完成后，滅活蛋白酶；(3)將酶解液中未水解的乳清蛋白沉淀去除，取上清液； (4)上清液用截留分子量< 10，000道爾頓的超濾膜進(jìn)行超濾，收集分子量< 10，000道爾頓 的肽的濾液；(5)濾液濃縮；(6)濃縮液脫鹽；(7)濃縮脫鹽后的溶液，然后冷凍干燥。根據(jù)本發(fā)明，步驟(1)是將蛋白酶加入乳清蛋白溶液中進(jìn)行酶解，其中酶解溫度 為40 60°C，pH6. 0 8. 0。其中，所述的進(jìn)行酶解的反應(yīng)可以和本領(lǐng)域常規(guī)的一樣在酶 解反應(yīng)器中進(jìn)行。在酶解反應(yīng)器中，按照常規(guī)方法將乳清分離蛋白溶于水中而制得乳清蛋 白溶液。乳清蛋白溶液可以是常規(guī)的濃度，本發(fā)明優(yōu)選的乳清蛋白溶液濃度為3 10%， 所述的百分比為質(zhì)量體積百分比(w/v)。乳清蛋白作為酶解反應(yīng)的底物，當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀?3%時(shí)，容易造成酶的浪費(fèi)；反之，當(dāng)濃度超過10%時(shí)，不利于在酶解過程中的攪拌，從而造 成水解不徹底。本發(fā)明最優(yōu)選的乳清蛋白濃度在4% (w/v) 0此時(shí)，濃度適合，最有利于攪 拌，水解反應(yīng)均衡。配制好的乳清蛋白溶液在酶解之前，較佳的還進(jìn)行如下預(yù)處理配制好 的的乳清蛋白溶液在70 100°C條件下，加熱5 20min，然后冷卻至40 60°C，調(diào)節(jié)pH。所述的蛋白酶可以是現(xiàn)有的酶解乳清蛋白的各種蛋白酶，可以選自胃蛋白酶，胰 蛋白酶，胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶，最佳的是木瓜蛋白酶。所述的蛋白酶和底物即乳清蛋白的質(zhì)量比同常規(guī)，較佳的蛋白酶與乳清蛋白的質(zhì) 量百分比是1 6%。進(jìn)行酶解的溫度可以是現(xiàn)有的乳清蛋白酶解溫度，較佳的是40 60°C，更佳的是 45°C。所用的溫度范圍，主要取決于所用蛋白酶的適用溫度范圍。溫度太高，蛋白酶變性失 活；溫度太低，則不是蛋白酶的作用范圍。進(jìn)行酶解的pH值可以是現(xiàn)有的乳清蛋白酶解pH值，較佳的是pH6. 0 8. 0，更佳 的是pH6. 5。進(jìn)行酶解的時(shí)間和現(xiàn)有技術(shù)中的一樣，稍長或稍短對于本發(fā)明的實(shí)施或效果不構(gòu) 成實(shí)質(zhì)性的影響，只要是所用的蛋白酶充分反應(yīng)即可。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可視具體情況而 定。酶解時(shí)間較佳的為2 8h，更佳的為4h。根據(jù)本發(fā)明，步驟(2)是酶解完成后，滅活蛋白酶。步驟(2)所述的滅活蛋白酶 的方法是常規(guī)技術(shù)，較佳的是將酶解液升溫到90 100°C，保持10 20min。根據(jù)本發(fā)明，步驟(3)是將酶解液中未水解的乳清蛋白沉淀去除，取上清液。步 驟(3)是常規(guī)技術(shù)，是為了去除未水解的乳清蛋白。所述的將酶解液中未水解的乳清蛋白 沉淀去除的方法較佳的是調(diào)節(jié)酶解液的pH值為pH6. 6 7. 2，然后離心，棄沉淀取上清液。 所述的離心條件較佳的是5000 lOOOOrpm，15 30min。根據(jù)本發(fā)明，步驟(4)是上清液用截留分子量< 10，000道爾頓(Da)的超濾膜進(jìn)行超濾，收集分子量≤10，000道爾頓的肽的濾液。其中，所述的截留分子量彡10，000Da的 超濾膜較佳的是截留分子量為5，OOODa的超濾膜，收集的是分子量< 5，OOODa的肽的濾液。 分子量大于10，OOODa的乳清蛋白活性肽的抗氧化活性很低，介于10，OOODa和5，OOODa之 間的乳清蛋白活性肽的抗氧化活性較高，分子量< 5，OOODa的乳清蛋白活性肽的抗氧化活 性得到明顯提高，是本發(fā)明的優(yōu)選范圍。根據(jù)本發(fā)明，步驟(5)是濾液濃縮。由于步驟(4)得到的經(jīng)過超濾的酶解液濾液 體積太大，濃度太小，在進(jìn)行脫鹽之前，通常將酶解液濃縮。步驟(5)所述的濾液濃縮的方法也是常規(guī)技術(shù)，較佳的是減壓濃縮，更佳的是在 小于40°C條件下的減壓濃縮。在大于40°C下濃縮，可能影響抗氧化活性。濃縮液較佳的也 可以在進(jìn)行冷凍干燥，然后冷凍貯存?zhèn)溆?。干燥的方法如本領(lǐng)域常規(guī)較佳的是真空冷凍干
>]f§K o根據(jù)本發(fā)明，步驟(6)是濃縮液脫鹽。步驟(6)所述的濃縮液脫鹽的方法也是常 規(guī)技術(shù)，較佳的是采用大孔吸附樹脂進(jìn)行脫鹽。所述的大孔吸附樹脂是非極性大孔樹脂，較 佳的是比表面積較大的非極性大孔樹脂，最佳的是大孔吸附樹脂DA201-C或SP-207。最佳 的，采用大孔吸附樹脂DA201-C，上樣液濃度為5 15mg/mL，洗脫液為50 80%的乙醇，洗 脫劑的流速在0. 5 2BV/h，洗脫時(shí)間大約在1 3h，就將大部分吸附的肽洗脫下來。解吸 附率可達(dá)71. 8%，脫鹽率達(dá)到98%，利用大孔吸附樹脂對蛋白水解液進(jìn)行動態(tài)脫鹽處理能 達(dá)到很好的效果。根據(jù)本發(fā)明，步驟(7)是濃縮脫鹽后的溶液，然后冷凍干燥。所述的濃縮的方法 較佳的是減壓蒸發(fā)濃縮。步驟(6)脫鹽洗脫下來的溶液，通過減壓蒸發(fā)等在低溫下操作方 法得到濃縮液。濃縮液冷凍干燥后得到的的白色或淡黃色粉末即為本發(fā)明的乳源抗氧化活 性肽。其中，所述的冷凍干燥優(yōu)選真空冷凍干燥，而不采用噴霧干燥，是為了更好地保持所 獲得活性肽的抗氧化活性。本發(fā)明還提供上述制備方法獲得的具有抗氧化活性的乳清蛋白活性肽。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明提供一種具有良好的抗氧化活 性的乳清蛋白活性肽，具有明顯的功能特性且功能特性專一，質(zhì)量穩(wěn)定，可廣泛應(yīng)用于食 品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。該乳清蛋白酶解活性肽的生產(chǎn)方法，所用設(shè)備、試劑價(jià)格便宜， 便于規(guī)?；a(chǎn)；生產(chǎn)工藝簡單，操作參數(shù)容易控制，重復(fù)性好；大孔吸附樹脂脫鹽易于控 制，效果好；乳清蛋白原料利用率高，生產(chǎn)成本低。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1是本發(fā)明的乳清蛋白活性肽清除DPPH自由基和羥基自由基的能力。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注 明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明中所述 的“室溫”是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，一般為25°C。實(shí)施例中所用的材料和方法如下一、材料和試劑
乳清蛋白WPI (美國哥倫比亞公司)；BHT，DPPH · (Sigma 公司)；蛋白酶(上海宏源生物科技有限公司)；2-脫氧-D-核糖，Tris Base (Fluka 公司進(jìn) 口分裝)；DA201-C, TP_1、HZ-816大孔吸附樹脂江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司；ΑΒ-8 上海奇康生物工程公司；SP-207 上海天呈科技有限公司；731大孔吸附樹脂，NKA-II 南開大學(xué)化工廠；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。二、檢測方法1、DPPH自由基(二苯代苦味酰基自由基)清除能力的檢測方法DPPH自由基是一 種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，溶液顏色為紫色，在517nm處有強(qiáng)吸收。當(dāng)有自由基清除 劑存在時(shí)，DPPH自由基的孤對電子被配對而使其顏色變淺，反應(yīng)結(jié)束后達(dá)到穩(wěn)定；而且這 種顏色變淺的程度與配對電子數(shù)呈量效關(guān)系。若樣品能將DPPH自由基清除，則表明樣品具 有降低羥基自由基、烷基自由基或超氧陰離子自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng) 的作用。因此，可以通過此波長處吸光度的變化來評價(jià)樣品對DPPH自由基的清除情況，從 而評價(jià)樣品的抗氧化能力。實(shí)施例中對DPPH自由基清除能力的檢測方法根據(jù)文獻(xiàn)(Chen HM, Muramoto, K,Yamauchi,et al. Antioxidative properties of histidine—containing peptides designed from peptidefragments found in the digest of a soybean protein. J Agri. Food Chem. , 1998,46 :49_53)中的方法進(jìn)行,具體如下。將2mL，0. 2mM的DPPH乙醇溶液加入到2mL含有不同濃度樣品溶液的潔凈試管中， 混勻。室溫下放置30min后，于517nm處測定吸光值，吸光值越小，表明自由基清除能力越 強(qiáng)。2mM BHT(2，6-二叔丁基對甲基苯酚)乙醇溶液作為清除DPPH自由基能力的陽性對照。清除率(％) = [I-(Ai-Aj)A0] X 100%A0為2mL，0. 2mM的DPPH乙醇溶液和2mL的樣品溶劑的反應(yīng)液的吸光值，作為空白 對照-A為2mL，0. 2mM的DPPH乙醇溶液和2mL的樣品的反應(yīng)液的吸光值；Aj為2mL無水乙 醇和2mL的樣品的反應(yīng)液的吸光值。2、羥基自由基清除能力的檢測方法羥基自由基是最活潑的自由基之一，因其反應(yīng)速率極快，它也是對機(jī)體造成危害 最大的自由基。實(shí)施例中羥基自由基清除能力的檢測方法根據(jù)文獻(xiàn)(陳美珍，余杰，郭慧 敏.Study on the scavenging effects of the enzymichydroIysates of soy protein isolates on hydroxyls. Food Sci (食品科學(xué))，2002，23 :43 46)中的方法進(jìn)行，具體如 下。分別取IOmM FeS04溶液和IOmM EDTA溶液各0. ImL混合于潔凈試管中，加入 0. 2mL, IOmM的2-脫氧-D-核糖溶液，然后分別加入2，4，6，8，10mg/mL的乳清蛋白酶解物水 溶液各0. 2mL，用0. 1Μ，ρΗ7. 4磷酸緩沖溶液定容至1. 8mL，再加入0. 2mL, IOmM H2O2溶液?？?白樣加入蒸餾水0. 2mL代替該H2O2溶液?；旌虾笾糜?7°C恒溫水浴中反應(yīng)lh。加入2. 8% (Wt)TCA(三氯乙酸)溶液ImL終止反應(yīng)。然后加入lmL，l% (wt)硫代巴比妥酸(TBA)溶 液混勻后，置沸水浴中反應(yīng)15min，流水迅速冷卻。532nm處測定吸光度，計(jì)算清除率(P)。
P = [1-(As-A0) / (Ac-A0) ] X100%As樣品液的吸光值；A。相同量的蒸餾水代替樣品液，其他處理同上，測定吸光值； A0 相同量的蒸餾水代替樣品液，25°C室溫反應(yīng)lh，其它處理同上，測定吸光值。3、大孔樹脂的吸附率㈧和解吸附率(W)的計(jì)算方法在250mL具塞錐形瓶中加入Ig預(yù)先處理好的干樹脂，無水乙醇充分溶脹，去離子 水洗凈無水乙醇；再加入WPI酶解物溶液30mL，放入25°C恒溫振蕩器中振蕩(振蕩速度為 120次/min)，使樹脂與料液充分接觸；每小時(shí)取樣，測定溶液中的蛋白含量。振蕩結(jié)束后， 濾紙過濾，將樹脂與溶液分離；計(jì)算樹脂的吸附率(A)。將吸附乳清蛋白酶解液的樹脂，用 蒸餾水洗滌后，大孔吸附樹脂分別采用洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中的蛋白 含量，計(jì)算解吸附率(W)。A = [ (C0-C1) /C0] X 100 %
W = C2V1/[ (C0-C1) V0] X 100 %吸附率:A ；解吸附率:W ；C0 原液蛋白濃度(mg/mL) ；V0 吸附液體積(IOmL) 解吸液體積(30mL) 吸附液蛋白濃度(mg/mL) ;C2 解吸液蛋白濃度(mg/mL)。實(shí)施例11、酶解(1)乳清蛋白溶解將IOOOmL水加入酶解反應(yīng)器中，升溫至45°C，稱取40g乳清蛋白，在磁力攪拌下緩 慢加入水中，用2M NaOH調(diào)節(jié)pH6. 5，在45°C的條件下使乳清分離蛋白全部溶解，酶解反應(yīng) 器中乳清蛋白的濃度為4% (w/v) 0(2)酶解反應(yīng)按照酶與底物(乳清蛋白)的質(zhì)量百分比為2. 2%的量，加入0.88g木瓜蛋白酶， 保持反應(yīng)溫度為45°C，并通過ZDJ-4A自動電位滴定儀滴加2M的NaOH維持酶解液的pH6. 5 恒定，酶解時(shí)間為3. 5小時(shí)。2、離心將酶解液加熱至100°C，IOmin進(jìn)行滅酶，然后冰浴快速冷卻至室溫，用2M鹽酸調(diào) 酶解液至PH7. 0，有沉淀析出，以IOOOOrpm離心30min除去沉淀，即未水解的乳清蛋白。3、超濾將離心后的酶解物上清液用截留分子量為5000Da的超濾膜超濾，收集分子量小 于5000Da的組分。將濾過液減壓濃縮后，采用LABC0NC0真空凍干機(jī)真空冷凍干燥。置 于-20°C貯存?zhèn)溆谩?、大孔吸附樹脂脫鹽用水將凍干的樣品溶解，樣品濃度為10mg/mL，采用大孔吸附樹脂DA201-C進(jìn)行脫 鹽。大孔吸附樹脂DA201-C用無水乙醇浸泡24h，充分溶脹后，用無水乙醇洗至洗脫液加適 量蒸餾水無白色混濁，隨后用蒸餾水洗凈無水乙醇；接著用5% (wt)鹽酸浸泡3h，再用蒸餾 水洗凈；接著用5% NaOH溶液浸泡3h后，再用蒸餾水洗至中性，過濾、干燥樹脂。將Ig干燥 樹脂加入250mL具塞錐形瓶中，無水乙醇充分溶脹，去離子水洗凈無水乙醇；再加入IOmg/ mL的WPI酶解物樣品溶液30mL，放入25°C恒溫振蕩器中振蕩(振蕩速度為120次/min)， 使樹脂與料液充分接觸。吸附率為32. 8%。振蕩3h后，以4BV去離子水以2 4BV/h的流速洗滌層析柱后，采用75%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，流速為lBV/h，收集在1 2h之間的洗脫 液。解吸附率為81 %。將脫鹽前后的樣品配成相同濃度分別測定其電導(dǎo)率，脫鹽率為94%。5、濃縮、干燥樣品將上述洗脫液減壓濃縮獲得濃縮液；將濃縮液采用LABC0NC0真空凍干機(jī)進(jìn)行真 空冷凍干燥，得到白色粉末樣品。然后將樣品溶于蒸餾水中配成5% (w/v)的溶液。樣品的 DPPH自由基清除率為62. 7%。同時(shí)測得乳清蛋白的DPPH自由基清除率為25. 8%。實(shí)施例21、酶解(1)乳清蛋白溶解將IOOOmL水加入酶解反應(yīng)器中，升溫至70°C，稱取30g乳清蛋白，在磁力攪拌下 緩慢加入水中，加熱5min，使乳清分離蛋白全部溶解，然后降溫至40°C。用2M NaOH調(diào)節(jié) PH6. 0，酶解反應(yīng)器中乳清蛋白的濃度為3% (w/v)。(2)酶解反應(yīng)按照酶與底物(乳清蛋白)的質(zhì)量百分比為的量，加入0.3g木瓜蛋白酶，保持 反應(yīng)溫度為40°C，并通過ZDJ-4A自動電位滴定儀滴加2M的NaOH維持酶解液的pH6. 0恒 定，酶解時(shí)間為4小時(shí)。2、離心將酶解液加熱至90°C，20min進(jìn)行滅酶，然后冰浴快速冷卻至室溫，用2M鹽酸調(diào)酶 解液至PH7. 0，有沉淀析出，以5000rpm離心30min除去沉淀，即未水解的乳清蛋白。3、超濾將離心后的酶解物上清液用截留分子量為5000Da的超濾膜超濾，收集分子量小 于5000Da的組分。將濾過液減壓濃縮后，采用LABC0NC0真空凍干機(jī)真空冷凍干燥。置 于-20°C貯存?zhèn)溆谩?、大孔吸附樹脂脫鹽如實(shí)施例1中進(jìn)行大孔吸附樹脂脫鹽，脫鹽率為95%。5、濃縮、干燥樣品將脫鹽后的洗脫液減壓濃縮得到濃縮液；將濃縮液采用LABC0NC0真空凍干機(jī)進(jìn) 行真空冷凍干燥，得到白色粉末樣品。然后將樣品溶于蒸餾水中配成5% (w/v)的溶液。樣 品的DPPH自由基清除率為58. 4%，乳清蛋白的DPPH自由基清除率為28. 5%。實(shí)施例31、酶解(1)乳清蛋白溶解將IOOOmL水加入酶解反應(yīng)器中，升溫至100°C，稱取IOOg乳清蛋白，在磁力攪拌下 緩慢加入水中，加熱20min，使乳清分離蛋白全部溶解，然后降溫至60°C。用2M NaOH調(diào)節(jié) PH8.0，酶解反應(yīng)器中乳清蛋白的濃度為10% (w/v) 0(2)酶解反應(yīng)按照酶與底物(乳清蛋白)的質(zhì)量百分比為6%的量，加入6g木瓜蛋白酶，保持反 應(yīng)溫度為60°C，并通過ZDJ-4A自動電位滴定儀滴加2M的NaOH維持酶解液的pH8. 0恒定， 酶解時(shí)間為4小時(shí)。
2、離心將酶解液加熱至95°C，15min進(jìn)行滅酶，然后冰浴快速冷卻至室溫，用2M鹽酸調(diào)酶 解液至PH7. 0，有沉淀析出，以8000rpm離心20min除去沉淀，即未水解的乳清蛋白。3、超濾將離心后的酶解物上清液用截留分子量為5000Da的超濾膜超濾，收集分子量小 于5000Da的組分。將濾過液減壓濃縮后，采用LABC0NC0真空凍干機(jī)真空冷凍干燥。置 于-20°C貯存?zhèn)溆谩?、大孔吸附樹脂脫鹽如實(shí)施例1中進(jìn)行大孔吸附樹脂脫鹽，脫鹽率為92%。5、濃縮、干燥樣品將脫鹽后的洗脫液減壓濃縮得到濃縮液；將濃縮液采用LABC0NC0真空凍干機(jī)進(jìn) 行真空冷凍干燥，得到白色粉末樣品。然后將樣品溶于蒸餾水中配成5% (w/v)的溶液。樣 品的DPPH自由基清除率為59. 8%。下面通過試驗(yàn)例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的有益效果。試驗(yàn)實(shí)施例1蛋白酶的篩選選用胃蛋白酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶。除了酶解反應(yīng)的蛋白酶不 同，酶解反應(yīng)的溫度和PH值按照各酶的生產(chǎn)廠商要求的最佳值之外，其他操作完全同實(shí)施 例1中的步驟和條件進(jìn)行。酶解液如實(shí)施例1中經(jīng)過超濾、脫鹽、凍干，然后分別溶于蒸餾 水中配成2，4，6，8，10% (w/v)的溶液。測量其對DPPH自由基的清除能力，比較不同蛋白酶 酶解物的抗氧化活性，結(jié)果見表1。由表1中可知，四種酶解產(chǎn)物中，木瓜蛋白酶酶解物對DPPH自由基的清除能力最 強(qiáng)，胃蛋白酶酶解物對DPPH自由基的清除能力最弱。由表1中還可知不同濃度的WPI酶解 物對DPPH自由基都有較強(qiáng)的清除作用，DPPH自由基的清除率隨著濃度的增加而增大。表1.不同蛋白酶WPI酶解物的抗氧化活性
DPPH自由基清除率(％)樣品濃度木瓜蛋白胰凝乳蛋白胰蛋白酶胃蛋白酶酶乳蛋白原(mg/mL)酶酶解物酶酶解物酶解物解物液000000227.112.229.3213.2440.225.531.612.621.7655.534.133.62128.9864.147.834.135.229.71073.163.538.23137.7
試驗(yàn)實(shí)施例2不同分子量范圍的WPI酶解物的抗氧化活性將實(shí)施例1中第3步驟中超濾所用的超濾膜不同，分別用截留分子量為10，OOODa 和5，OOODa的超濾膜進(jìn)行超濾，分別收集分子量小于10，OOODa和5，OOODa的組分。各組分 如實(shí)施例1中濃縮、脫鹽、干燥，最后溶于蒸餾水中配成5% (w/v)的溶液，用于測定DPPH自 由基的清除率，結(jié)果見表2?？梢娙榍宓鞍酌附馕锏姆肿恿糠秶煌?，其抗氧化能力相差也 很大。由表2中可知乳清蛋白酶解物的抗氧化活性成分主要集中在10，OOODa以下。優(yōu)選 的是分子量小于5，OOODa的濾過液，其抗氧化活性明顯增強(qiáng)。表2.不同分子量范圍的WPI酶解物的抗氧化活性 試驗(yàn)實(shí)施例3WPI酶解物對DPPH 和· OH的清除效果比較將實(shí)施例1制備的WPI酶解物凍干粉溶解于蒸餾水中，配成不同濃度的溶液。測 定不同濃度WPI酶解物對DPPH 和· OH的清除能力，結(jié)果見圖1。由圖1可知，不同濃度乳清蛋白酶解物對DPPH ·和· OH均有較強(qiáng)的清除作用，清 除率隨著酶解物濃度的增加而增大。在整個濃度范圍內(nèi)，蛋白酶酶解物對· OH的清除能力 超過對DPPH ·的清除能力。這主要是由于乳清蛋白酶解物富含供氫體，具有提供氫質(zhì)子的 能力，可使具有高度氧化性的自由基還原，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，起到清除自由基或抑 制自由基反應(yīng)的目的。
權(quán)利要求
一種具有抗氧化性活性的乳清蛋白活性肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將蛋白酶加入乳清蛋白溶液中進(jìn)行酶解，其中酶解溫度為40～60℃，pH6.0～8.0；(2)酶解完成后，滅活蛋白酶；(3)將酶解液中未水解的乳清蛋白沉淀去除，取上清液；(4)上清液用截留分子量≤10,000道爾頓的超濾膜進(jìn)行超濾，收集分子量≤10,000道爾頓的肽的濾液；(5)濾液濃縮；(6)濃縮液脫鹽；(7)濃縮脫鹽后的溶液，然后冷凍干燥。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的蛋白酶選自胃蛋白酶， 胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的蛋白酶和底物即乳清蛋 白的質(zhì)量百分比是1 6%。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的乳清蛋白溶液濃度為 3 10%，所述的百分比為質(zhì)量體積百分比。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的乳清蛋白溶液在酶解之 前，還進(jìn)行如下預(yù)處理配制好的乳清蛋白溶液在70 100°C條件下，加熱5 20min，然后 冷卻至40 60°C，調(diào)節(jié)pH至所用酶的最適pH。
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)所述的截留分子量 (10，OOODa的超濾膜較佳的是截留分子量為5，OOODa的超濾膜，收集的是分子量彡5，000 道爾頓的肽的濾液。
7.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(5)所述的濾液濃縮的方法是減壓 濃縮；步驟(7)所述的濃縮的方法是減壓蒸發(fā)濃縮，所述的冷凍干燥是真空冷凍干燥。
8.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的滅活蛋白酶的方法是將 酶解液升溫到90 100°C，保持10 20min ；步驟(3)所述的將酶解液中未水解的乳清蛋 白沉淀去除的方法是調(diào)節(jié)酶解液的PH值為pH6. 6 7. 2，然后離心，棄沉淀取上清液，所述 的離心條件是5000 lOOOOrpm，15 30min ；步驟(6)所述的濃縮液脫鹽的方法是采用大 孔吸附樹脂進(jìn)行脫鹽。
9.一種由權(quán)利要求1 8任一項(xiàng)所述的制備方法制得的具有抗氧化性活性的乳清蛋白 活性肽。
10.如權(quán)利要求9所述的具有抗氧化性活性的乳清蛋白活性肽在食品、化妝品或醫(yī)藥 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抗氧化活性的乳清蛋白活性肽及其制備方法。該制備方法包括以下步驟(1)將蛋白酶加入乳清蛋白溶液中進(jìn)行酶解，其中酶解溫度為40～60℃，pH6.0～8.0；(2)酶解完成后，滅活蛋白酶；(3)將酶解液中未水解的乳清蛋白沉淀去除，取上清液；(4)上清液用截留分子量≤10,000道爾頓的超濾膜進(jìn)行超濾，收集分子量≤10,000道爾頓的肽的濾液；(5)濾液濃縮；(6)濃縮液脫鹽；(7)濃縮脫鹽后的溶液，然后冷凍干燥。本發(fā)明獲得的乳清蛋白活性肽具有顯著的抗氧化功能特性且功能特性專一，質(zhì)量穩(wěn)定，可廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。其生產(chǎn)工藝簡單，便于規(guī)?；a(chǎn)，乳清蛋白原料利用率高，生產(chǎn)成本低。
文檔編號C12P21/06GK101928742SQ20091005359
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月23日
發(fā)明者劉志東, 劉振民, 吳正鈞, 周方方, 王蔭榆, 郭本恒 申請人:光明乳業(yè)股份有限公司