專利名稱:Sx1近交系小鼠的dna分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及DNA序列,具體涉及山西省自行培育的SX1近交系小鼠微衛(wèi)星(SSR) 位點(diǎn)DNA分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù):
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在生物醫(yī)學(xué)和科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)題也 亟待解決。預(yù)先了解不同品系或近交系的遺傳純度及背景信息,對(duì)于實(shí)驗(yàn)材料的選取和實(shí) 驗(yàn)結(jié)果分析都有很大幫助。國(guó)內(nèi)外針對(duì)近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量控制均制定了相應(yīng)的檢 測(cè)標(biāo)準(zhǔn),但檢測(cè)方法多集中于形態(tài)學(xué)、染色體及蛋白水平。對(duì)于毛色相同的小鼠形態(tài)學(xué)鑒定 較為困難,而染色體和蛋白水平的鑒定所需樣本量大,對(duì)飼養(yǎng)成本較大的近交系小鼠難以 普及應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從小鼠基因組中克隆出SXl近交系小鼠特異的SSR位點(diǎn),并用于 SX1近交系小鼠鑒定。 本發(fā)明通過(guò)大量篩選SSR分子標(biāo)記,獲得4個(gè)SX1近交系小鼠的SSR位點(diǎn)特征性 DNA條帶,經(jīng)對(duì)其克隆、測(cè)序和同源比較,確定D2Mitl7,D9Mitl8,D12Mit136和DXMitl86四 個(gè)位點(diǎn)的特征性DNA序列,這些位點(diǎn)DNA序列可作為分子遺傳學(xué)標(biāo)記,用于SX1近交系小鼠 鑒別。 本發(fā)明獲得的SX1近交系小鼠DNA分子標(biāo)記,由核苷酸序列1、序列2、序列3和序 列4組成(見序列表)。 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)該小鼠在4個(gè)位點(diǎn)D2Mitl7, D9Mitl8, D12Mitl36和DXMitl86的微衛(wèi) 星片段長(zhǎng)度與兩個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品系BALB/c和C57BL/6在這些位點(diǎn)的片段長(zhǎng)度不一致。經(jīng)進(jìn) 一步的克隆、測(cè)序,獲得SX1近交系小鼠在這些位點(diǎn)的特征性序列信息D2Mitl7包含28個(gè) TG重復(fù)單元和19個(gè)AG重復(fù)單元;D9Mitl8包含20個(gè)GT重復(fù)單元;D12Mit136包含28個(gè) CA重復(fù)單元;DXMitl86包含23個(gè)CA重復(fù)單元。 用4個(gè)SSR位點(diǎn)引物來(lái)擴(kuò)增小鼠尾尖基因組DNA樣本,經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝 膠電泳(PAGE)篩選,克隆測(cè)序,若獲得4個(gè)特征性序列,為SX1近交系小鼠。
這4個(gè)SSR位點(diǎn)引物如下
D2Mitl7 上游弓|物AGGCAATTACAAGGCCTGG
下游弓|物CACCCATCTCCCTCAGTCAT
D9Mitl8 上游弓|物TCACTGTAGCCCAGAGCAGT
下游弓|物CCTGTTGTCAACACCTGATG
D12Mitl36
上游引物TTTAATTTTGAGTGGGTTTGGC 下游引物TTGCTACATGTACACTGATCTCCA DXMH186 上游弓I物ATCAATGCATAGTATTTGGGCC 下游引物AATTTGTCACTGCGGGTAGG 本發(fā)明克服了常規(guī)形態(tài)標(biāo)記,細(xì)胞標(biāo)記及生化標(biāo)記鑒定方法的不足,提供了對(duì)實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物小鼠快速、準(zhǔn)確鑒定的分子標(biāo)記方法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1SX1近交系小鼠SSR位點(diǎn)DNA分子標(biāo)記序列獲得及應(yīng)用
1、采用常規(guī)酚_氯仿法提取SX1近交系小鼠及兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品系BALB/c, C57BL/6 尾尖總基因組DNA。即剪取小鼠尾尖2-3mm,9g/L生理鹽水洗凈,剪碎,加入360ii1 TES, 40ii 110% SDS,4ii 1 Proteinase K(20mg/ii 1) , 4 ii 1 RNase (10mg/ii 1),充分混勻后,55°C 消化過(guò)夜。加入等體積飽和酚(pH7. 6)緩慢混勻20min。 10, 000r/min離心10min。取上清液 于另一EP管中,加入等體積酚氯仿異戊醇(25 : 24 : 1)緩慢抽提20min, 10, OOOr/min 離心10min。取上清液于另一EP管中,加入等體積氯仿異戊醇(24 : 1)緩慢抽提20min, 10, OOOr/min離心10min。取上清液于另一 EP管中,加入2倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇-2(TC放置 2h。 10, OOOr/min離心5min。 DNA沉淀于管底,用70%預(yù)冷乙醇洗滌2次。37。C烘干。溶 于適量TE。 2、參照相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)Mouse Genome Database (http//www. informatics, jax. org), 獲得19對(duì)微衛(wèi)星引物并由上海英濰捷基生物有限公司合成。 3、PCR反應(yīng)體系優(yōu)化。本發(fā)明采用梯度PCR法對(duì)PCR反應(yīng)體系和循環(huán)程序進(jìn)行優(yōu) 化。PCR循環(huán)體系為94。C預(yù)變性3min后,經(jīng)94。C 45s,50_65°C lmin,72。C 90s,循環(huán)40次, 最后72"延伸10min, l(TC保存。 4、 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。用8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)經(jīng)溴化乙錠染色 后,凝膠呈象做進(jìn)一步的分型驗(yàn)證。根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠上DNA泳動(dòng)距離進(jìn)行結(jié)果判讀,泳 動(dòng)距離最長(zhǎng)的帶設(shè)定英文字母a,依次為b, c, d……。若發(fā)現(xiàn)SX1在某一 SSR位點(diǎn)的擴(kuò)增片 段與兩標(biāo)準(zhǔn)品系不同。就將該位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收。 5、PCR產(chǎn)物回收。依據(jù)以上方法選擇回收4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物,應(yīng)用DNA膠 回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。 6、應(yīng)用DNA重組技術(shù)回收克隆DNA序列。將回收產(chǎn)物插入pGEM-T easy vector, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行克隆,酶切驗(yàn)證后送往北京奧科生物公司測(cè)序,進(jìn)一步對(duì)序列在NCBI上 做Blast分析。 (1)在0. 5ml低DNA結(jié)合力的離心管中按照T載體說(shuō)明將回收DNA條帶與T載體 連接,具體連接步驟如下10iil反應(yīng)體系中含有5ii1 T4 DNA連接酶2X快速連接緩沖液, lii lpGEM-T Easy vector (50ng) , 3 ii 1 PCR產(chǎn)物,lii 1 T4 DNA連接酶(3Weiss/ii 1)。用移 液器吹打連接反應(yīng)液使之混勻,4t:孵育過(guò)夜,待用。 [OOSO] (2)轉(zhuǎn)化反應(yīng)和細(xì)菌培養(yǎng) 1)從-7(TC冰箱中取出50iU感受態(tài)細(xì)胞DH5a ,冰水解凍,輕撣管壁以混勻細(xì)胞; 2)短暫離心連接反應(yīng)管(4,000g,30s),取一半體積的連接反應(yīng)物于解凍后的感
受態(tài)細(xì)胞中,輕撣混勻,冰水浴30min ; 3)取出離心管,于42t:水浴50-90s ; 4)冰水浴2min ; 5)離心管中加入950 ii 1 SOC液體培養(yǎng)基; 6)37t:,溫和地振搖1. 5h(150轉(zhuǎn)/分),使細(xì)菌復(fù)蘇,并使質(zhì)粒編碼的抗性基因表 達(dá); 7) 1, OOOg,常溫10min離心,倒去絕大部分上清液(留存150 iU左右),重新溫 和地懸浮細(xì)菌,涂于預(yù)先處理好的平板培養(yǎng)基上(提前半小時(shí)涂lOOiU 100mM IPTG和 20 ii 150 ii g/ml X-gal于平板培養(yǎng)基中)。待吸收后倒置放入37。C烘箱中,16h左右觀察藍(lán)、 白菌落,可置4t:短期保存待用; 8)取經(jīng)滅菌的試管若干,加入約4ml左右的液體LB培養(yǎng)基(含0.1%氨芐抗生 素); 9)用滅菌牙簽小心挑取白色菌落,丟于試管中;
10) 37°C , 250轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,至溶液混濁。 (3)應(yīng)用酶切鑒定法進(jìn)一步鑒定陽(yáng)性克隆子。方法與步驟質(zhì)?;厥?,經(jīng)藍(lán)白斑和 氨芐篩選,重組質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng),采用上海華舜生物工程有限公司的產(chǎn)品小量質(zhì)粒快速抽提 純化試劑盒按照其步驟回收質(zhì)粒;將獲得的質(zhì)粒用EcoR I進(jìn)行酶切鑒定,10ul的酶切體 系中含有l(wèi)ul 10Xbuffer,5ul PCR product,0. 208ul EcoR I (12U/ul)和3. 792ul H20。 37t:溫浴120min,取5ul用于1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。根據(jù)酶切的DNA片段長(zhǎng)度與回 收是DNA片段長(zhǎng)度相一致的確定為陽(yáng)性克隆。 (4)將含有目的片段的菌液約1. 5ml送往北京奧科生物公司進(jìn)行測(cè)序。在獲得的 DNA序列兩端找到PCR擴(kuò)增時(shí)采用的特異引物序列,進(jìn)一步確定陽(yáng)性克隆的真實(shí)性。
7、序列分析。對(duì)獲得的DNA序歹lj,在NCBI網(wǎng)站Mouse Genome Resources中進(jìn)行 BlastN搜索,確定為SX1小鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)序列。
8、 SSR位點(diǎn)序列用于SX1近交系小鼠鑒定 (1)參照相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)Mouse Genome Database (http//www. informatics, jax. org) 獲得4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)引物(D2Mitl7, D9Mitl8, D12Mitl36和DXMitl86)。這4個(gè)微衛(wèi)星位
點(diǎn)引物如下 D2Mitl7 上游引物AGGCAATTACAAGGCCTGG 下游引物CACCCATCTCCCTCAGTCAT D9Mitl8 上游引物TCACTGTAGCCCAGAGCAGT 下游弓|物CCTGTTGTCAACACCTGATG D12Mitl36 上游引物TTTAATTTTGAGTGGGTTTGGC 下游引物TTGCTACATGTACACTGATCTCCA
DXMitl86 上游引物ATCAATGCATAGTATTTGGGCC 下游引物AATTTGTCACTGCGGGTAGG (2)采用常規(guī)酚-氯仿法提取SXl近交系小鼠尾尖總基因組DNA,利用PCR法 獲得以上4個(gè)SSR位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物。PCR循環(huán)體系為94。C預(yù)變性3min后,經(jīng)94。C 45s, 57-61°C lmin(D2Mit17, DXMitl86, 57°C ;D9Mitl8,6rC ;D12Mit136, 59°C ),72°C 90s,循環(huán) 40次,最后72。C延伸10min,l(TC保存。 將PCR產(chǎn)物回收,進(jìn)行DNA重組,克隆轉(zhuǎn)化及測(cè)序。如果獲得如下特征性的序列片 段即為SX1近交系小鼠。D2Mitl7擴(kuò)增片段長(zhǎng)度233bp,序列特征(TG)28(AG)19 ;D9Mitl8 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度206bp,序列特征(GT)20 ;D12Mitl36擴(kuò)增片段長(zhǎng)度194bp,序列特征(CA) 28 ; DXMitl86擴(kuò)增片段長(zhǎng)度112bp,序列特征(CA)23。因此這4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)可作為SX1小鼠 鑒定。 SEQUENCE LISTING 〈110〉山西大學(xué) 〈120>SX1近交系小鼠的DNA分子標(biāo)記及其應(yīng)用 〈160>4 〈210>1 〈211>233 〈212>DNA 〈213>SX1近交系小鼠SSR位點(diǎn)D2Mi "7的DNA序列 〈400〉 1 aggcaattec aaggcctggg agatggtcte aactttecag tttctcggct ggtgtggatg 60 ccctcacaaa cattcteagt gaatctegat gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 120 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtg卿g3 g卿g卿g3 g卿g卿g3 g卿g卿g3 180 g3ggg卿g3 ggg卿gttc 3ggtg3tg朋g卿tgEictg郷g卿tgg gtg 233 〈210>2 〈211>206 〈212>DNA 〈213>SX1近交系小鼠SSR位點(diǎn)D9Mitl8的DNA序列 〈400>2 tcactgtagc ccagagcagt catttctctt tcaaattegg tggcatttte tcctttegte 60 cttetcateg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgte tgtgtgtgtg 120 tgtg朋ggtg cacatec朋g 3gtgtecatt tgcatgtgga atcteagtgt tgacatcagg 180 tgatgacatc aggtgttgac aacagg 206 〈210>3 〈211>194 〈212>DNA 〈213>SX1近交系小鼠SSR位點(diǎn)D12Mitl36的DNA序列 〈400>3
tttaattttg agtgggtttg gctcgcttta tctetctetc tetctetcte tctetctatc 60 tatctetcte tctetctatc tetcteatct atctetctec acacacacac acacacacac 120 acacacacac acacacacac acacacacac acacatetet atgttcaact tggagatcag 180 tgtecatgta gcaa 194 〈210〉4 〈211>112 <212>DNA 〈213〉SX1近交系小鼠SSR位點(diǎn)DXMitl86的DNA序列 〈400〉4 atcaatgcat agtetttggg cctecattag tgtttccccc aacacacaca cacacacaca 60 cacacacaca cacacacaca cacacacaga gttgatccte cccgcagtga ca 11權(quán)利要求
一種SX1近交系小鼠DNA分子標(biāo)記,其特征在于由核苷酸序列1、序列2、序列3和序列4組成。
2. 如權(quán)利要求1所述的SXl近交系小鼠DNA分子標(biāo)記在鑒定SXl近交系小鼠中的應(yīng)用o
全文摘要
本發(fā)明通過(guò)篩選SSR分子標(biāo)記,獲得山西省自行培育的SX1近交系小鼠特異的4個(gè)SSR位點(diǎn)條帶,經(jīng)對(duì)其克隆、測(cè)序和同源比較,獲得該小鼠4個(gè)SSR位點(diǎn)的DNA序列,該序列可作為分子遺傳學(xué)標(biāo)記,用于SX1近交系小鼠的鑒定。本發(fā)明克服了常規(guī)形態(tài)標(biāo)記,細(xì)胞標(biāo)記及生化標(biāo)記鑒定方法的不足,提供了對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠快速、準(zhǔn)確鑒定的分子標(biāo)記方法。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101709334SQ20101003334
公開日2010年5月19日 申請(qǐng)日期2010年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月5日
發(fā)明者任連生, 張建珍, 張建琴, 楊美玲, 聞建華, 馬恩波 申請(qǐng)人:山西大學(xué)