專利名稱：豬 MLC2 5^， 側(cè)翼啟動(dòng)子區(qū) SNP 作為豬胴體性狀的遺傳標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬育種與豬的分子標(biāo)記輔助選擇領(lǐng)域，具體涉及一種與豬的胴體性狀相關(guān)基因MLC25’側(cè)翼啟動(dòng)子片段的克隆及其作為豬胴體性狀遺傳標(biāo)記的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人類對畜禽生產(chǎn)性能的選擇從無意識到有意識已有幾千年的歷史，而從表型選擇實(shí)踐到基因型選擇理論的探討僅是近幾十年的事情。在對畜禽生產(chǎn)性能進(jìn)行選擇時(shí)，主要是依靠對其目標(biāo)性狀的標(biāo)記，而先前的生化免疫標(biāo)記和細(xì)胞遺傳標(biāo)記檢測位點(diǎn)數(shù)目有限、多態(tài)性貧乏。20世紀(jì)80年代以后，分子遺傳標(biāo)記技術(shù)的誕生和逐步完善，使動(dòng)物育種學(xué)家們又迅速把具有豐富多態(tài)的DNA分子標(biāo)記應(yīng)用到動(dòng)物育種理論中。從而出現(xiàn)了以DNA分子標(biāo)記技術(shù)為主的畜禽經(jīng)濟(jì)性狀標(biāo)記輔助選擇(marker assisted selection,MAS)育種。它 借助分子標(biāo)記來選擇數(shù)量性狀的基因型，同時(shí)利用標(biāo)記信息和個(gè)體表型信息，可以更為準(zhǔn)確地估計(jì)育種值，提高選擇效率，大大加快育種進(jìn)程。DNA分子標(biāo)記是指能反應(yīng)生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它能直接反映基因組DNA間的差異。從1974年Grozdicker首創(chuàng)了第一代分子標(biāo)記至今，DNA分子標(biāo)記先后產(chǎn)生了三代幾十個(gè)種類。第一代為RFLP，第二代為SSR、RAPD, AP-PCR、EST等,第三代為單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)。SNP是由美國麻省理工學(xué)院的 Lander ES 于 1996 年提出的(Lander ES. The new genomics globalviews ofbiology. Science. 1996,274:536-539)。SNP 是指同一位點(diǎn)的不同等位基因之間僅有個(gè)別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等。SNP標(biāo)記在大多數(shù)基因組中存在較高的頻率、數(shù)量豐富，其有望成為最重要最有效的分子標(biāo)記。根據(jù)SNP在基因中的位置可分為基因編碼區(qū) SNP(coding-region SNP, cSNP)、基因周邊 SNP(perigenic SNP, pSNP)以及基因間SNP(intergenic SNP, iSNP)三類。SNP在DNA分子上分布不均勻，在非轉(zhuǎn)錄區(qū)SNP頻率要高于轉(zhuǎn)錄區(qū)SNP頻率，這可能是受進(jìn)化中選擇的壓力影響。轉(zhuǎn)錄區(qū)的SNP —般與蛋白的表達(dá)有關(guān)，而非轉(zhuǎn)錄區(qū)的SNP則可以調(diào)控基因的表達(dá)。所以這兩類SNP不僅都可以作為分子標(biāo)記，還可能與一些動(dòng)物的生產(chǎn)性狀有直接關(guān)系。啟動(dòng)子是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的順式作用元件，位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)，含有基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要信息，基因表達(dá)的強(qiáng)度以及特異性很大程度上決定于它。因此，研究功能基因5’側(cè)翼序列啟動(dòng)子中的SNP可能有更重要的生物學(xué)功能，能夠影響基因的表達(dá)。MLC2 (myosin light chain 2)編碼肌球蛋白輕鏈2,是肌球蛋白的重要組分(肌球蛋白的凝聚狀態(tài)以及熱誘導(dǎo)時(shí)的凝膠特性對肉制品的質(zhì)構(gòu)、脂肪和水的結(jié)合能力等有很大影響)，對肌球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能顯示重要調(diào)節(jié)作用，在肌肉的發(fā)生過程中起著調(diào)控重鏈表達(dá)的作用。MLC2屬于肌鈣蛋白C超家族，能夠可逆的由肌球蛋白輕鏈磷酸酯酶MLCP脫磷酸化和Ca2+/CaM依賴的肌球蛋白輕鏈激酶MLCK磷酸化，參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白互作、Ca2+敏感性、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和影響肌肉性能的其他相關(guān)參數(shù)。另外，MLC2也是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶的底物，能被有絲分裂因子活化蛋白激酶(MAPK)激活，參與多種細(xì)胞信號途徑。Davoli等已將其定位于豬的3號染色體短臂(Davoli et al. Identificationof SNPs, mapping and analysis of allele frequencies in two candidate genes formeat production traits :the porcine myosin heavy chain 2B(MYH4)and the skeletalmuscle myosin regulatory light chain 2(HUMMLC2B). Anim Genet. 2003, 34 :221-225)，徐德全等從雜交親代大白豬與子代長大豬的背最長肌的消減cDNA文庫中篩選到其EST，利用電腦克隆和SMART等技術(shù)，獲得了其cDNA全長序列和全部內(nèi)含子序列(GenBank登錄號分別為 AY754870 和 AY870651, Xu et al. Identification of a differential geneHUMMLC2B between Fl hybrids LandraceXYorkshire and their female parentsYorkshire. Gene, 2005, 352 :118-126)。但有關(guān)豬MLC2啟動(dòng)子區(qū)SNP的研究至今還未見報(bào)道。因此在分子水平上研究豬MLC2基因啟動(dòng)子區(qū)的SNP，分析其與豬胴體等經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)系，具有重要的意義
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克隆豬MLC25’側(cè)翼啟動(dòng)子區(qū)225bp的序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1(大白豬)和SEQ ID N0:2(梅山豬)所示。通過對2個(gè)豬種的上述序列進(jìn)行Cluster W比對，尋找SNP位點(diǎn)，建立相應(yīng)的SNP分型方法，分析其與與豬胴體性狀的關(guān)系，為豬的胴體性狀標(biāo)記輔助選擇提供有用的遺傳標(biāo)記。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)選擇中國地方豬種梅山豬和外來的歐洲大白豬為實(shí)驗(yàn)材料，從豬血液中提取基因組DNA，以豬MLC2基因的mRNA序列為種子，在豬的基因組中進(jìn)行比對，根據(jù)其5’側(cè)翼序列設(shè)計(jì)如下引物正向引物F : 5 ’ TATCCTTCTGTCCTCCTG 3，，反向引物R : 5 ’ CTCTATGACCTTGGACTTG 3 ’。利用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收、克隆、測序后，利用Cluster W進(jìn)行序列比對。本發(fā)明提供了豬MLC25’側(cè)翼啟動(dòng)子區(qū)即位于該225bp擴(kuò)增片段內(nèi)部的I處核苷酸多態(tài)性(SNP)，即在所述的序列表SEQ ID NO 1的53bp處存在一個(gè)C/A的突變，在序列表SEQ ID NO :2的53bp處存在一個(gè)A/C突變，上述等位基因的突變導(dǎo)致Hinf I酶切位點(diǎn)的改變。其SNP位點(diǎn)如圖2所示。本發(fā)明提供了檢測上述序列53bp處A/C變異的HinfI-RFLP基因型分型方法。進(jìn)一步本發(fā)明提供了利用HinfI-RFLP方法確定不同基因型個(gè)體與豬胴體性狀之間的相關(guān)關(guān)系的關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步克隆了不同基因型大白豬和梅山豬的MLC2基因5’側(cè)翼啟動(dòng)子901bp序列。分別構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，觀察不同基因型MLC2基因5’側(cè)翼啟動(dòng)子序列在細(xì)胞中的活性。


序列表SEQ ID NO 1是所克隆到的大白豬MLC2基因5’側(cè)翼啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列，長度為225bp。序列表SEQ ID NO 2是所克隆到的梅山豬MLC2基因5’側(cè)翼啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列，長度為225bp。圖I是大白豬和梅山豬MLC2基因5’側(cè)翼啟動(dòng)子區(qū)225bp片段的擴(kuò)增條帶圖中M為DL2000Marker ；泳道1_3為以大白豬基因組DNA為模板的擴(kuò)增條帶；泳道4_5為以梅山豬基因組DNA為模板的擴(kuò)增條帶。圖2是大白豬和梅山豬MLC2基因5’側(cè)翼啟動(dòng)子區(qū)225bp序列的比對結(jié)果和SNP位點(diǎn)。圖3是MLC25’側(cè)翼區(qū)HinfI-RFLP檢測結(jié)果瓊脂糖濃度為2% ;圖中泳道M為DL2000Maker ；

圖4是不同基因型大白豬和梅山豬的MLC2基因5’側(cè)翼901bp啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增圖中M為DL2000Marker ;泳道1_3為以大白豬基因組DNA為模板的擴(kuò)增條帶；泳道4_5為以梅山豬基因組DNA為模板的擴(kuò)增條帶。圖5是用于分析不同基因型MLC2基因5’側(cè)翼啟動(dòng)子活性的PGL3_basiC載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖6是不同基因型MLC2基因5’側(cè)翼啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I利用苯酌■抽提法提取大白豬和梅山豬血液總DNA將現(xiàn)場所采大白豬(來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)豬場，為常規(guī)報(bào)道的品種，下同)新鮮血液加入0. 5M乙二胺四乙酸(即EDTA，購自武漢市江潤精細(xì)化工有限責(zé)任公司)作為抗凝劑(按血液量體積比的1/10)，并搖勻，防止凝血。白細(xì)胞分離(I) 4°C, 6000rpm,離心 IOmin,去血清。(2)加入2倍體積雙蒸水，輕輕搖勻沉淀lOmin，破碎紅細(xì)胞。(3) 40C，6OOOrpm,離心 lOmin，去上層紅細(xì)胞漿。(4)利用0. 9% NaCl洗漆沉淀,輕輕搖勻lOmin。(5)4°C,6000rpm,離心lOmin,棄上清,得到白細(xì)胞沉淀?？侱NA 提取(I)在白細(xì)胞沉淀或肌肉組織磨碎漿液中，加入等體積lXSET(lml)，蛋白酶K(10mg/mL)至終濃度100 y g/mL，10%十二烷基硫酸鈉(SDS)至終濃度0. 5%，搖勻，55°C水浴搖床中溫育過夜消化。(2)在消化液中加入等體積的Tris飽和酹,輕輕搖勻15min,于4°C、IlOOOrpm離心lOmin，小心吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，注意標(biāo)上相應(yīng)的記號。(3)加等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(體積比25 24 I)，緩慢顛倒離心管IOmin,于低溫冷凍離心機(jī)中4°C、IlOOOrpm離心lOmin，小心吸取上清，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)干凈的離心管中。(4)加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比24 : I),緩慢顛倒離心管lOmin，于低溫冷凍離心機(jī)中4°C、IIOOOrpm離心lOmin。
(5)將上清液吸入標(biāo)記好的的離心管中，加入2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，小心混勻后可見白色絮狀DNA沉淀。(6)用槍頭將DNA沉淀挑出，置于裝有對應(yīng)號碼的EP管中，室溫下讓乙醇揮發(fā)干凈，加入適量的超純水溶解DNA。(7)在DNA濃度測定儀上測定其濃度與純度，并在I %瓊脂糖凝膠80伏電泳約2h，紫外燈下檢測DNA提取質(zhì)量。實(shí)施例2 :豬MLC25’側(cè)翼啟動(dòng)子區(qū)特異DNA片段的獲得及SNP檢測方法的建立選擇外來血緣豬“大白豬”和中國地方豬種“梅山豬”(來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)豬場，為常規(guī)報(bào)道的品種)為試驗(yàn)材料，以豬MLC2基因(登錄號AY754870)的mRNA序列為種子，在豬的基因組中進(jìn)行比對，根據(jù)其5’側(cè)翼序列設(shè)計(jì)如下引物正向引物 F : 5 ’ TATCCTTCTGTCCTCCTG 3， 反向引物R : 5 ’ CTCTATGACCTTGGACTTG 3 ’分別以大白豬(國外血緣豬品種)和梅山豬(中國地方豬品種)血液基因組DNA為模板，用上述引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增(見圖I)。PCR反應(yīng)體系見表I。表IPCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.豬MLC2基因5’側(cè)翼啟動(dòng)子片段作為豬胴體性狀的遺傳標(biāo)記，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示，在所述的SEQ ID NO 1的53bp處存在一個(gè)C/A的突變，在SEQ ID N0:2的53bp處存在一個(gè)Α/C突變，導(dǎo)致HinfI酶切位點(diǎn)的改變，引起HinfI-RFLP 多態(tài)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的遺傳標(biāo)記，其中克隆豬MLC2基因5’側(cè)翼啟動(dòng)子片段所用引物的DNA序列如下所示 正向引物 F:5’ TATCCTTCTGTCCTCCTG 3’， 反向引物 R :5’ CTCTATGACCTTGGACTTG 3’。
3.一種篩選豬胴體性狀遺傳標(biāo)記的方法，其特征在于，按照以下步驟 以豬MLC2基因的mRNA序列為種子，在豬的基因組中進(jìn)行比對，以其5’側(cè)翼序列為靶序列設(shè)計(jì)引物，得到如權(quán)利要求2所示引物；從豬血液中提取基因組DNA，用權(quán)利要求2所示的引物在豬基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化和克隆測序，獲得如序列表SEQ IDNO 1和SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；通過序列比對，篩查SNP及其所在限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，進(jìn)行酶切分型，構(gòu)建不同基因型的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察不同基因型的轉(zhuǎn)錄活性，分析不同基因型與豬胴體性狀的相關(guān)關(guān)系。
4.權(quán)利要求I所述的遺傳標(biāo)記在豬胴體性狀標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于豬分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬MLC2的5’側(cè)翼啟動(dòng)子片段作為豬胴體性狀的遺傳標(biāo)記及制備方法與應(yīng)用。該遺傳標(biāo)記具有如序列表SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的序列的第53bp處分別存在一個(gè)C/A和A/C的突變，該等位基因的突變引起DraIII-RFLP的多態(tài)性。利用該遺傳標(biāo)記對大白豬和梅山豬F2代進(jìn)行了與豬胴體性狀的關(guān)聯(lián)分析，檢測了不同基因型的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。本發(fā)明還公開了該遺傳標(biāo)記的分型檢測方法，為豬胴體性狀分子標(biāo)記輔助選擇提供了新的遺傳標(biāo)記和檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK102776273SQ201110445328
公開日2012年11月14日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者劉倩, 劉敏, 夏曉亮, 孫小瑞, 徐德全, 熊遠(yuǎn)著 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)