專利名稱：一種亞洲璃眼蜱的組胺結(jié)合蛋白HaHBP的基因序列和重組表達(dá)與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及亞洲璃眼蜱組胺結(jié)合蛋白HaHBP的基因 序列與在大腸桿菌中的重組表達(dá)，及其在制備抗組胺藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蜱是一種常見的吸血?jiǎng)游矬w表寄生蟲，又是人和動(dòng)物許多疾病的傳播媒介。通過(guò) 蜱傳播的病原體有真菌、病毒、立克次氏體、螺旋體、細(xì)菌和原蟲等。因此，防治蜱及蜱傳病 十分重要，其中基因工程疫苗的研發(fā)是一個(gè)重要研究方向。亞洲璃眼蜱屬于三宿主型蜱，廣 泛分布于中國(guó)的新疆、內(nèi)蒙、寧夏和中亞各地區(qū)，可叮咬人類，可寄生在牛、羊、馬、犬、兔等 家畜身上，引起宿主癢痛、貧血、消瘦和麻痹等癥狀。尤其它可以傳播新疆出血熱和Q熱等 疾病。在蜱的吸血過(guò)程中，必然會(huì)引起宿主一系列免疫排斥和防御反應(yīng)，為了克服宿主 的排斥反應(yīng)，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間吸血，蜱唾液腺產(chǎn)生大量的活性分子，它們?cè)诳鼓⒚庖哒{(diào)節(jié)等 方面起重要作用。組胺結(jié)合蛋白(HBP)是其中一種重要的免疫調(diào)節(jié)蛋白，具有抗組胺的作 用從而減少宿主癢覺和炎癥反應(yīng)，有利于整個(gè)吸血過(guò)程。炎癥的發(fā)生由炎癥介質(zhì)(如組胺 和補(bǔ)體分子等)介導(dǎo)。臨床上，用化學(xué)藥物控制組胺引起的病理學(xué)疾病(如過(guò)敏和消化道 潰瘍等)，其原理是阻斷組胺靶細(xì)胞表面Hl或H2受體。蜱的抗炎癥反應(yīng)機(jī)理則不同，它是 通過(guò)唾液腺分泌與組胺本身結(jié)合的蛋白分子而達(dá)到目的。最早是從非洲具尾扇頭蜱唾液腺 中分離和鑒定了三個(gè)組胺結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)它們與組胺的高親和的空間結(jié)合特點(diǎn)，隨后完成 了基因克隆和蛋白活性位點(diǎn)的分析(Paeser^et al. 1999，2000)，此后在其他幾種蜱體也發(fā) 現(xiàn)類似分子(Nuttall and Labuda，2004)，蜱的組胺結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)上與哺乳動(dòng)物組胺受體 明顯不同，又具有高度結(jié)合能力，被認(rèn)為具有醫(yī)學(xué)上直接的治療價(jià)值以及可作為發(fā)展新型 抗炎癥藥物的平臺(tái)分子(Mans，et al. 2005)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于研究亞洲璃眼蜱體內(nèi)組胺結(jié)合蛋白分子，為設(shè)計(jì) 新型抗組胺生物藥物提供基礎(chǔ)。本發(fā)明提供了一種亞洲璃眼蜱的組胺結(jié)合蛋白(Hyalomma asiaticumHistamine Binding Protein, HaHBP)基因序列，其基因核苷酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列見圖1。HaHBP 基因全長(zhǎng)902bp，3’端有“polyA”和加尾信號(hào)“AATAAA”，起始密碼子和終止密碼子分別位于 142-144bp和823-825bp處，開放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)681bp，編碼227個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量 約為25.9kDa(包括信號(hào)肽)，等電點(diǎn)(pi)為7. 96。對(duì)編碼的氨基酸進(jìn)行信號(hào)肽分析，發(fā)現(xiàn) 該氨基酸序列有信號(hào)肽，切割位點(diǎn)位于第26-27個(gè)氨基酸處。生物信息學(xué)分析，該分子為組 胺結(jié)合蛋白的同源分子。本發(fā)明的另一目的是提供了亞洲璃眼蜱的組胺結(jié)合蛋白HaHBP在大腸桿菌中的重組表達(dá)方法。本發(fā)明根據(jù)亞洲璃眼蜱的組胺結(jié)合蛋白HaHBP基因生物信息學(xué)分析結(jié)果， 將不包含信號(hào)肽序列的實(shí)際編碼區(qū)亞克隆到原核表達(dá)載體PGEX-4T-1中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì) 粒pGEX-4T-l/HaHBP，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)表達(dá)菌后，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析 顯示，重組GST融合蛋白獲得高效表達(dá)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，融合蛋白GST-HaHBP以包涵體形 式成功表達(dá)，大小為49kDa左右，與預(yù)期大小一致。本發(fā)明的又一目的是提供了亞洲璃眼蜱的組胺結(jié)合蛋白HaHBP在制備抗組胺藥 物中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)行了重組HaHBP結(jié)合組胺試驗(yàn)，通過(guò)Histamine-ELISA方法，結(jié)果顯示 HaHBP具有結(jié)合組胺的能力，而對(duì)照GST蛋白并沒有結(jié)合組胺的能力，本發(fā)明的亞洲璃眼蜱 的組胺結(jié)合蛋白HaHBP可用于制備抗組胺藥物。


圖1亞洲璃眼蜱HaHBP基因的核苷酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，ATG為起始密碼 子，TAC為終止密碼子，劃線氨基酸序列為預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列，箭頭為信號(hào)肽切割點(diǎn)位置。圖2亞洲璃眼蜱HaHBP的氨基酸序列與其他蜱的組胺結(jié)合蛋白的同源性分析。 AAT92202為太平洋硬蜱的組胺結(jié)合蛋白序列，AAT66812為肩突硬蜱的組胺結(jié)合蛋白序列。 *代表三個(gè)分子都一致的氨基酸殘基，眷代表二個(gè)分子一致的氨基酸殘基。圖3重組HaHBP的表達(dá)和純化，1，純化后的HaHBP ；2，誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌體蛋 白；3，無(wú)誘導(dǎo)的重組菌體蛋白；M，為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；4，無(wú)誘導(dǎo)的含pGEXT-4T-l載體菌體 蛋白；5，誘導(dǎo)后的含pGEXT-4T-l載體菌體蛋白；6，純化的GST蛋白。圖4重組HaHBP與組胺的結(jié)合實(shí)驗(yàn)。不同濃度的重組蛋白或?qū)φ誈ST蛋白包被96 孔板，加上標(biāo)記的組胺，洗脫后顯色測(cè)定OD值。1，2，3，4，5分別代表濃度為2，1.5，1，0.5， 0. 1微克/孔重組HaHBP或GST蛋白?！醮鞨aHBP蛋白組實(shí)驗(yàn)，▲代表GST蛋白組實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1亞洲璃眼蜱的組胺結(jié)合蛋白HaHBP的基因克隆和序列分析1.材料和方法1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物亞洲璃眼蜱來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)獲得。新西蘭大白兔購(gòu)自中科 院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1. 2試驗(yàn)菌種、質(zhì)粒及試劑大腸桿菌菌株DH5 α、BL21 (DE3)購(gòu)自博大泰克公司， 質(zhì)粒 pGEM-T Easy 和 T4 DNA 連接酶購(gòu)自 Promega 公司，TRIZOL 試劑、5 ‘ RACE 和 3 ‘ RACE 試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自賽百盛公司；TaqDNA聚合酶和DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；引物由賽百盛公司合成。1. 3亞洲璃眼蜱總RNA的提取取接種于新西蘭大白兔體上吸血4天的半飽血雌蜱，IXPBS清洗后，用液氮于研 缽中充分研磨，研磨完全后加入TRIZOL試劑，在勻漿器中充分勻漿，提取亞洲璃眼蜱半飽 血雌蜱的總RNA ；1.4 快速擴(kuò)增 cDNA 3'末端(3' RACE)和 5 ‘末端(5 ‘ RACE)根據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所通過(guò)消減文庫(kù)獲得的一個(gè)組胺結(jié)合
5蛋白的EST序列(向飛宇等，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39，2347-2353)，設(shè)計(jì)3，RACE和 5' RACE 引物，3' RACE-GSP 5' -CGGCTCTGCAAGAGAACGCTCC-3‘ ；3' RACE-Nested-GSP 5，CAACTTTACCTGCGAGGACAGACC-3，，以單鏈cDNA為模板經(jīng)兩輪擴(kuò)增，擴(kuò)增出全長(zhǎng)基因的3， 端，擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性 5min ；94°C 45s ；53°C 40s ；72°C Imin ；總延伸 IOmin ；35 個(gè)循環(huán)， 5，RACE-GSP1 :5，-GTAGACTAGTTTCATTG-3，；5，RACE-GSP2 :5，-CTCCACCATCTGGCCGAGCATTATC G-3，；5，RACE-Nested-GSP :5，-GGTTCGGTGCACCATACAGTGTCTG-3，，以步驟(1)中總 RNA 為模 板，用GSPl引物在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA第一鏈(sscDNA)，純化cDNA，然后在cDNA加 上d(C)尾，再經(jīng)GSP2和Nested-GSP引物經(jīng)兩輪擴(kuò)增，擴(kuò)增出全長(zhǎng)基因的5’端，擴(kuò)增條件 94°C預(yù)變性 4min ；94°C 45s ；55°C 40s ；72°C Imin ；總延伸 7min ；35 個(gè)循環(huán)；1.5目的基因的克隆上述步驟(2)PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用DNA膠回收試劑盒回收目的片段，再 將目的片段連接到PGEM-T Easy載體，并轉(zhuǎn)化于DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用藍(lán)白斑篩選和PCR鑒 定的方法篩選出陽(yáng)性克隆并搖菌測(cè)序，將測(cè)序所得序列與原序列拼接出全長(zhǎng)；1. 6HaHBP全長(zhǎng)基因的克隆和序列分析根據(jù)步驟(3)獲得HaHBP全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出HBP基因的全長(zhǎng)序 列，并將該全長(zhǎng)基因連接到PGEM-T Easy載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒HaHBP-pGEM-T Easy載 體，利用BLAST、DNAMAN(V5. 2)、Genetyx (v4. 0)生物學(xué)軟件分析HaHBP基因的序列 同源性、開放閱讀框、預(yù)測(cè)編碼的產(chǎn)物大小、等電點(diǎn)、信號(hào)肽等生物信息學(xué)的分析Fl 5，-CCAGTGTTTATCAAGGGTAAAGATG-3，，Rl :5，-TAGAAATTGTACCTTTCCCACTTAC-3 ‘預(yù)計(jì)擴(kuò)增 大小為820bp左右，擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性4min ；94°C 45s ；58°C 45s ；72°C Imin ；總延伸 IOmin ；35個(gè)循環(huán)；2.結(jié)果2. lHaHBP3'末端、5'末端和全長(zhǎng)基因的克隆通過(guò)3，RACE和5，RACE方法，HaHBP基因的3，端和5，端分別獲得了 260bp和 400bp大小的片段。拼接成全長(zhǎng)序列，大小為902bp，根據(jù)拼接的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出 HaHBP全長(zhǎng)序列大小為816bp (圖1)。2. 2HaHBP全長(zhǎng)基因的生物信息學(xué)分析如圖1所示，HaHBP基因全長(zhǎng)902bp，3，端有“polyA”和加尾信號(hào)“AATAAA，，， 起始密碼子和終止密碼子分別位于142-144bp和823-825bp處，開放閱讀框(ORF)全 長(zhǎng)681bp，編碼227個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為25.9kDa(包括信號(hào)肽)，等電點(diǎn)(pi)為 7. 96。對(duì)編碼的氨基酸進(jìn)行信號(hào)肽分析(http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)， 發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列有信號(hào)肽，切割位點(diǎn)位于第26-27個(gè)氨基酸處，表明該蛋白為分泌性 蛋白。經(jīng)Genetyx(v4.0)分析，該基因擬編碼的氨基酸疏水的100個(gè)，親水的有72個(gè)， 中性的有50個(gè)，親水和疏水的氨基酸殘基均勻分布。利用blast分析HaHBP與已報(bào)道的 Ixodespacificus禾口 Ixodes scapularis兩種硬蝶的HBP有顯著同源性，經(jīng)Alignment可知 三者之間在六個(gè)相當(dāng)位置三序列均含有半胱氨酸殘基(C)，同時(shí)，在相近位置有四至五個(gè)色 氨酸殘基(W)(圖2)。實(shí)施例2亞洲璃眼蜱的組胺結(jié)合蛋白HaHBP基因的重組表達(dá)和活性驗(yàn)證1.材料與方法
1. 1試驗(yàn)菌種、質(zhì)粒及試劑大腸桿菌菌株DH5 α、BL21 (DE3)購(gòu)自博大泰克公司，Τ4 DNA連接酶購(gòu)自Promega 公司，質(zhì)粒PGEX-4T-1購(gòu)自Amersham Pharmacia Biotech ；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自賽百盛公 司；Taq DNA 聚合酶、DNA Marker、EcoRI 和 Xhol 內(nèi)切酶購(gòu)自 TaKaRa 公司。GST · Bind 試 劑盒購(gòu)自Novagen ；引物由賽百盛公司合成組胺-HRP酶結(jié)合物、K-Blue底物、終止液購(gòu)自 Neogen 公司。1. 2HaHBP的原核表達(dá)及純化將HaHBP基因的開放閱讀框(ORF)去掉信號(hào)肽后，在余下的編碼區(qū)兩側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì) 引物，F(xiàn)2(引入EcoRI酶切位點(diǎn)GAATTC)5，- § GAATTCGAGAAAGTAATGGCTCACAAAGAGG-3，，R2 (引入 Xho 1 酶切位點(diǎn) CTCGAG)5' CTCGAGCGATTTCGGCAATATTTTCTTCAAT-3，，PCR 擴(kuò)增 HaHBP 基因全長(zhǎng)編碼
區(qū)(去信號(hào)肽序列)，克隆到PGEX-4T-1載體，構(gòu)建表達(dá)重組質(zhì)粒HaHBP-pGEX-4T-l，經(jīng)雙 酶切和測(cè)序鑒定目的片段準(zhǔn)確插入。將HaHBP-pGEX-4T-l轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL21 (DE3)中， 37 0C 180rpm搖床培養(yǎng)，使其OD值達(dá)到0.6-1. O左右時(shí)，用IPTG(終濃度為ImM)誘導(dǎo) GST-HaHBP融合蛋白表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)4h左右收集菌體，超聲裂解菌體收集上清和沉淀，經(jīng)常 規(guī)的12% SDS-PAGE電泳分析蛋白的表達(dá)的情況，最后利用GST · Bind 純化試劑盒純化得 到蜱的組胺結(jié)合蛋白(Hyalomma asiaticumHistamine Binding Protein, HaHBP)。1. 3重組蛋白的結(jié)合組胺試驗(yàn)以純化得到的融合蛋白GST-HaHBP(GST蛋白作陰性對(duì)照)作為抗原包被于ELISA 酶標(biāo)板4°C過(guò)夜，洗滌后，加入組胺-HRP酶結(jié)合物，37。C反應(yīng)2h，充分洗滌后，加入K-Blue 底物顯色I(xiàn)Omin后，加入終止液5min，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。2.結(jié)果2. IHaHBP的原核表達(dá)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，融合蛋白GST-HaHBP以不溶性的包涵體形式成功表達(dá)，大小為 49kDa左右(圖3)，與預(yù)期大小一致。重組蛋白通過(guò)尿素變性、復(fù)性和親和層析，可獲得純 化的重組蛋白。2. 2重組HaHBP結(jié)合組胺試驗(yàn)通過(guò)Histamine-ELISA方法，結(jié)果顯示HaHBP具有結(jié)合組胺的能力(顯色的藍(lán)色 越深表明結(jié)合的組胺越多)，而對(duì)照GST蛋白并沒有結(jié)合組胺的能力(圖4)，本發(fā)明的亞 洲璃眼蜱的組胺結(jié)合蛋白HaHBP可用于制備抗組胺藥物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了克隆的 HaHBP基因?yàn)榫幋a組胺結(jié)合蛋白的新基因。序列表<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所<120> 一種蜱的組胺結(jié)合蛋白HaHBP的基因序列和重組表達(dá)<130>說(shuō)明書、權(quán)利要求書<160>1<170>PatentIn version3. 3<210>1
<211>902<212>DNA<213>組胺結(jié)合蛋白HaHBP的核苷酸序列<400>1agtgcgtacacaacgactgtgcatggaactggaggctctagcccccagtgtttatcaagg60
gtaaagatgacgtctgcttcacaatttccataaaagggcgccgttaagtaagctttccga120
ctagacccagaagattcgacgatggggtacagctccgcgcaacacctgattaaggccgtt180
gttatcgctgcggcagcatcatatgtttttgtgagcgccgagaaagtaatggctcacaaa240
gaggagactggcgatgacaaagttctccctattgtcagtgttttcaacacaacttcgaaa300
ctgtggctgtactgggaaaatgtcacaaaagacaataagttatcagaagaggaacagaca360
ctgtatggtgcaccgaacctagacttgagtgagagctgcacattcattaaaatgtttaac420
atcagcaaggttgacttccacttctggtggaaaacgataatgctcggccagatggtggag480
agccatttttatggagaatttttttcggaaggcgggaataaaccacttggttcgatgaac540
gttactgatctttcagaaaccgaacgaaagccttttgaaacaatgaaactagtctacagg600caagggcatt gcagtgtgtt ttttgtcacg gctctgcaag agaacgctcc tacagtgtgc 660caactttacc tgcgaggaca gaccgtttca aaaaaaccgg cggaaaaatg taaggaatat 720tacgaaaaac actgtggaac gaagattgct gtctacaatg ctacctgcaa aagagaagtc 780aatcgagcag aaaaagaatt gaagaaaata ttgccgaaat cgtagaacaa taattgtaag 840tgggaaaggt acaatttcta aaataaagca agtgattttg gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900aa
902<210>2<211>227<212>PRT<213>組胺結(jié)合蛋白HaHBP的氨基酸序列<400>2Met Gly Tyr Ser Ser Ala Gln His Leu lie1510Ala Ala Ala Ser Tyr Val Phe Val Ser Ala2025Lys Glu Glu Thr Gly Asp Asp Lys Val Leu3540Asn Thr Thr Ser Lys Leu Trp Leu Tyr Trp5055
Lys Glu
Ala
Lys
Pro lie
Glu Asn 60
Val Val Val
Val
45
Val
Met
30
Ser
lie Ala 15
Ala His
Val Phe Thr Lys Asp
8
AsnLysLeuSerGluGluGluGlnThrLeuTyrGlyAlaProAsnLeu
65707580
AspLeuSerGluSerCysThrPhelieLysMetPheAsnlieSerLys
859095
ValAspPheHisPheTrpTrpLysThrlieMetLeuGlyGlnMetVal
100105110
GluSerHisPheTyrGlyGluPhePheSerGluGlyGlyAsnLysPro
115120125
LeuGlySerMetAsnValThrAspLeuSerGluThrGluArgLysPro
130135140
PheGluThrMetLysLeuValTyrArgGlnGlyHisCysSerValPhe
145150155160
PheValThrAlaLeuGlnGluAsnAlaProThrValCysGlnLeuTyr
165170175
LeuArgGlyGlnThrValSerLysLysProAlaGluLysCysLysGlu
180185190
TyrTyrGluLysHisCysGlyThrLyslieAlaValTyrAsnAlaThr
195200205
CysLysArgGluValAsnArgAlaGluLysGluLeuLysLyslieLeu
210215220
ProLysSer
22權(quán)利要求
一種亞洲璃眼蜱組胺結(jié)合蛋白HaHB的基因序列，其特征在于所述基因全長(zhǎng)902bp，3’端有“polyA”和加尾信號(hào)“AATAAA”，起始密碼子和終止密碼子分別位于142 144bp和823 825bp處，開放閱讀框681bp，編碼227個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為25.9kDa，等電點(diǎn)為7.96；信號(hào)肽分析表明，在預(yù)測(cè)蛋白的N 端發(fā)現(xiàn)有信號(hào)肽序列，切割位點(diǎn)位于第26 27個(gè)氨基酸處；同源性分析顯示，該分子為組胺結(jié)合蛋白同源分子；所述亞洲璃眼蜱HaHBP基因的核苷酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如下組胺結(jié)合蛋白HaHBP的核苷酸序列agtgcgtaca caacgactgt gcatggaact ggaggctcta gcccccagtg tttatcaagg 60gtaaagatga cgtctgcttc acaatttcca taaaagggcg ccgttaagta agctttccga 120ctagacccag aagattcgac gatggggtac agctccgcgc aacacctgat taaggccgtt 180gttatcgctg cggcagcatc atatgttttt gtgagcgccg agaaagtaat ggctcacaaa 240gaggagactg gcgatgacaa agttctccct attgtcagtg ttttcaacac aacttcgaaa 300ctgtggctgt actgggaaaa tgtcacaaaa gacaataagt tatcagaaga ggaacagaca 360ctgtatggtg caccgaacct agacttgagt gagagctgca cattcattaa aatgtttaac 420atcagcaagg ttgacttcca cttctggtgg aaaacgataa tgctcggcca gatggtggag 480agccattttt atggagaatt tttttcggaa ggcgggaata aaccacttgg ttcgatgaac 540gttactgatc tttcagaaac cgaacgaaag ccttttgaaa caatgaaact agtctacagg 600caagggcatt gcagtgtgtt ttttgtcacg gctctgcaag agaacgctcc tacagtgtgc 660caactttacc tgcgaggaca gaccgtttca aaaaaaccgg cggaaaaatg taaggaatat 720tacgaaaaac actgtggaac gaagattgct gtctacaatg ctacctgcaa aagagaagtc 780aatcgagcag aaaaagaatt gaagaaaata ttgccgaaat cgtagaacaa taattgtaag 840tgggaaaggt acaatttcta aaataaagca agtgattttg gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900aa 902組胺結(jié)合蛋白HaHBP的氨基酸序列Met Gly Tyr Ser Ser Ala Gln His Leu Ile Lys Ala Val Val Ile Ala1 5 10 15Ala Ala Ala Ser Tyr Val Phe Val Ser Ala Glu Lys Val Met Ala His20 25 30Lys Glu Glu Thr Gly Asp Asp Lys Val Leu Pro Ile Val Ser Val Phe35 40 45Asn Thr Thr Ser Lys Leu Trp Leu Tyr Trp Glu Asn Val Thr Lys Asp50 55 60Asn Lys Leu Ser Glu Glu Glu Gln Thr Leu Tyr Gly Ala Pro Asn Leu65 70 75 80Asp Leu Ser Glu Ser Cys Thr Phe Ile Lys Met Phe AsnIle Ser Lys85 90 95Val Asp Phe His Phe Trp Trp Lys Thr Ile Met Leu Gly Gln Met Val100 105 110Glu Ser His Phe Tyr Gly Glu Phe Phe Ser Glu Gly Gly Asn Lys Pro115 120 125Leu Gly Ser Met Asn Val Thr Asp Leu Ser Glu Thr Glu Arg Lys Pro130 135 140Phe Glu Thr Met Lys Leu Val Tyr Arg Gln Gly His Cys Ser Val Phe145 150 155 160Phe Val Thr Ala Leu Gln Glu Asn Ala Pro Thr Val Cys Gln Leu Tyr165 170 175Leu Arg Gly Gln Thr Val Ser Lys Lys Pro Ala Glu Lys Cys Lys Glu180 185 190Tyr Tyr Glu Lys His Cys Gly Thr Lys Ile Ala Val Tyr Asn Ala Thr195 200 205Cys Lys Arg Glu Val Asn Arg Ala Glu Lys Glu Leu Lys Lys Ile Leu210 215 220Pro Lys Ser225。
2.如權(quán)利要求1所述的亞洲璃眼蜱組胺結(jié)合蛋白HaHBP在大腸桿菌中的重組表達(dá) 方法，其特征在于根據(jù)亞洲璃眼蜱的組胺結(jié)合蛋白HaHBP基因生物信息學(xué)分析結(jié)果，將不 包含信號(hào)肽序列的實(shí)際編碼區(qū)亞克隆到原核表達(dá)載體PGEX-4T-1中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-4T-l/HaHBP，轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)菌后，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，融合蛋白 GST-HaHBP以包涵體形式成功表達(dá)；重組蛋白通過(guò)尿素變性、復(fù)性和親和層析，可獲得純化 的重組蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的亞洲璃眼蜱組胺結(jié)合蛋白HaHBP在大腸桿菌中的重組表達(dá)方 法，其特征在于所使用的宿主菌為BL21，質(zhì)粒為pGEX-4T-l。
4.如權(quán)利要求1所述的亞洲璃眼蜱組胺結(jié)合蛋白HaHBP在制備抗組胺藥物中的應(yīng)用。Arg Lys ProSer Val Phe 160Gln Leu Tyr 175Cys Lys Glu 190Asn Ala Thr Lys lie Leu
全文摘要
本發(fā)明公開了亞洲璃眼蜱組胺結(jié)合蛋白HaHBP的基因序列和在大腸桿菌中重組表達(dá)方法。以亞洲璃眼蜱唾液腺差異表達(dá)基因文庫(kù)的EST數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，利用RACE方法克隆得到其編碼基因，基因全長(zhǎng)序列為902bp，編碼227個(gè)氨基酸殘基，該蛋白預(yù)測(cè)的分子量為25.9kDa，等電點(diǎn)為7.96。生物信息學(xué)分析表明其為組胺結(jié)合蛋白同源分子。將該基因亞克隆到pGEX-4T-1表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)宿主菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，成功表達(dá)出融合重組蛋白，體外活性實(shí)驗(yàn)表明，該重組蛋白具有結(jié)合組胺的能力，可用于制備抗組胺藥物。
文檔編號(hào)C12P21/02GK101928709SQ20091005369
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2009年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日
發(fā)明者周勇志, 周金林, 李莊, 石磊, 郭鳳璕 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所