專利名稱：：一種在革蘭氏陽性菌中合成的cdp-2-甘油及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及革蘭氏陽性球菌細(xì)菌表面單糖的合成，尤其涉及肺炎鏈球菌23F中單糖的合成，更具體的說，是一種在革蘭氏陽性菌中利用還原酶、磷酸化酶和CDP轉(zhuǎn)移酶合成CDP-2-甘油的制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
：肺炎鏈球菌(Str印tococcuspneumoniae)是革蘭氏陽性球菌，廣泛分布于自然界。肺炎鏈球菌能否致病與其莢膜有密切關(guān)系，因?yàn)槠淝v膜能抵抗人體內(nèi)吞噬細(xì)胞的吞噬作用而大量繁殖，引起疾病。構(gòu)成莢膜的多糖即莢膜多糖，由寡糖重復(fù)單元組成，構(gòu)成這些寡糖重復(fù)單元的單糖包括多種單糖，糖衍生物和糖類似物等，分為常見糖和罕見單糖。常見糖(如葡萄糖，半乳糖)由于在細(xì)菌的其他基本代謝中同樣需要，因此編碼其合成的基因不特別存在與莢膜多糖抗原基因簇中。罕見糖(如鼠李糖，阿拉伯糖和甘露糖)僅存在于莢膜多糖中，編碼其合成的基因位于莢膜多糖抗原基因簇中。肺炎鏈球菌23F血清型的莢膜多糖由包含五個(gè)單糖(兩個(gè)鼠李糖，l個(gè)半乳糖和1個(gè)葡萄糖及l(fā)個(gè)甘油-2-磷酸)的寡糖重復(fù)單元組成。在這四種單糖中，半乳糖和葡萄糖為兩種最常見的單糖，在其它細(xì)菌表面抗原的組成中也有存在。鼠李糖雖為罕見單糖，但是鼠李糖在革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌中的生物合成途徑已經(jīng)被研究。然而甘油_2-磷酸的單糖合成路徑未曾有過鑒定。因此，該合成途徑的鑒定將為生物合成該罕見糖奠定基礎(chǔ)。近年來，由于基因組學(xué)的迅速發(fā)展，已有200余種不同的細(xì)菌多糖基因簇被破譯，常見糖及一些罕見糖的合成基因的功能及其合成途徑也已得到確認(rèn)(http:〃www.microbio.usyd.edu.au/BPGD/default.htm)。糖具有高度的復(fù)雜性和多樣性?；瘜W(xué)的方法只能合成部分單糖，而且成本高昂，化學(xué)合成罕見單糖有許多困難。與生命有關(guān)的罕見單糖非常難分離。大量生產(chǎn)罕見單糖，多年來一直是糖科學(xué)研究的最重要的目標(biāo)。用生物技術(shù)大量生產(chǎn)罕見單糖是最有前景的途徑。運(yùn)用已確定功能的單糖合成酶的組合，產(chǎn)生自然界中不存在或非常重要的罕見單糖，這對(duì)醫(yī)療和生物制藥領(lǐng)域有非常重要的意義。目前，有關(guān)在肺炎鏈球菌23F中合成CDP-2-甘油(甘油_2_磷酸的前體)的酶學(xué)和分子生物學(xué)特性還未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種在革蘭氏陽性菌細(xì)菌表面中利用還原酶合成甘油(glycerol),利用磷酸化酶合成甘油-2-磷酸(glycerol-2-phosphate)，進(jìn)而合成CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)。本發(fā)明的另一目的是提供上述罕見單糖CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)的制備方法。本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量的研究及創(chuàng)造性的勞動(dòng)設(shè)計(jì)出了在肺炎鏈球菌23F中合成甘油(glycerol)，甘油_2_磷酸(glycerol-2-phosphate)，進(jìn)而合成CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)的合成途徑GtplGtp3Gtp21，3_dihydroxyacetone->glyceol->glycerol_2_phosphate->CDP-2-glycerol在此合成路徑中，這三種單糖及其所需要的還原酶，磷酸化酶和CDP轉(zhuǎn)移酶是本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量的研究及創(chuàng)造性的勞動(dòng)設(shè)計(jì)出來的。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案—種在革蘭氏陽性菌細(xì)菌中還原酶合成的甘油(Glycerol)。所述的革蘭氏陽性菌為肺炎鏈球菌23F，所述的還原酶為還原酶Gtpl;所述的編碼還原酶Gtpl的基因具有選自于下列a)、b)或c)的核苷酸序列:a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；b)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，不同于SEQIDNO:l但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:1所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；c)在嚴(yán)格雜交條件下與上述a)或b)中的序列雜交，并且編碼具有活性的還原酶的核苷酸序列。所述的還原酶Gtpl具有選自于下列j)、k)或1)的氨基酸序列j)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；k)SEQIDNO:4所示的氨基酸序列；1)上述k)中缺失、替換或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸后的氨基酸序列，并且具有該序列的蛋白質(zhì)有還原酶的活性。本發(fā)明公開了還原酶Gtpl的重組質(zhì)粒，所述的質(zhì)粒的載體為pET-28a(+)。本發(fā)明公開了還原酶Gtpl的重組菌，所述的重組菌導(dǎo)入了還原酶。本發(fā)明所述的甘油(Glycerol)經(jīng)磷酸化酶Gtp3作用轉(zhuǎn)化為甘油2_磷酸(glycerol_2_phosphate)。所述的編碼磷酸化酶Gtp3的基因具有選自于下列d)、e)或f)的核苷酸序列d)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；e)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，不同于SEQIDNO:2但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:2所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；f)在嚴(yán)格雜交條件下與上述d)或e)中的序列雜交，并且編碼具有活性的磷酸化酶的核苷酸序列。所述的磷酸化酶Gtp3具有選自于下列p)、q)或r)的氨基酸序列p)上述g)、h)或i)所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；q)SEQIDNO:5所示的氨基酸序列；r)上述q)中缺失、替換或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸后的氨基酸序列，并且具有該序列的蛋白質(zhì)有磷酸化酶的活性。本發(fā)明所述的磷酸化酶Gtp3的重組質(zhì)粒，所述的質(zhì)粒的載體為pET-28a(+)。本發(fā)明所述的磷酸化酶Gtp3的重組菌，所述的重組菌導(dǎo)入了磷酸化酶Gtp3。本發(fā)明所述的甘油2-磷酸(glycerol-2-phosphate)經(jīng)CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的作用轉(zhuǎn)化為CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)。本發(fā)明所述編碼CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的基因具有選自于下列g(shù))、h)或i)的核苷酸序列g(shù))SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；h)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，不同于SEQIDNO:5但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:3所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；i)在嚴(yán)格雜交條件下與上述g)或h)中的序列雜交，并且編碼具有活性的磷酸化酶的核苷酸序列。本發(fā)明所述的CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2具有選自于下列該m)、n)或o)的氨基酸序列m)上述g)、h)或i)所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；n)SEQIDNO:6所示的氨基酸序列；o)上述n)中缺失、替換或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸后的氨基酸序列，并且具有該序列的蛋白質(zhì)有磷酸化酶的活性。本發(fā)明所述的CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的重組質(zhì)粒，所述的質(zhì)粒的載體為pET-28a(+)。本發(fā)明所述的CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的重組菌，所述的重組菌導(dǎo)入了CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2。應(yīng)當(dāng)指出的是，上述提到的術(shù)語"嚴(yán)格雜交條件"在本說明書中的含義是指在該條件下形成了所謂特異雜交而沒有形成非特異的雜交。例如，該嚴(yán)格雜交條件可以是，相互之間的同源性不小于70%的DNA之間可以雜交而低于上述數(shù)值的DNA之間不能雜交，優(yōu)選的是同源性不少于90%的DNA之間可以雜交。相對(duì)于Southern雜交中普通洗滌條件而言，可以例如為如下的雜交條件將雜交膜置于預(yù)雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.0，7%SDS)中，5(TC預(yù)雜交30min;棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.0，7%SDS，同位素標(biāo)記的核苷酸片段)，5(TC雜交12hr;棄雜交液，加入洗膜液I(2XSSC和0.1%SDS)，5(TC洗膜2次，每次30min;加入洗膜液II(0.5XSSC和0.1%SDS)，5(TC洗膜30min。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)該知道，本發(fā)明的編碼罕見單糖合成的還原酶、磷酸化酶和CDP轉(zhuǎn)移酶的DNA序列，還包括編碼對(duì)SEQIDN0:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示核苷酸序列所表達(dá)的酶分子的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、插入或缺失并仍具有該酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。另外，對(duì)本發(fā)明的罕見單糖合成的還原酶、磷酸化酶和CDP轉(zhuǎn)移酶基因所表達(dá)的酶分子的氨基酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、插入或缺失所得到的蛋白質(zhì)也能達(dá)到本發(fā)明的目的。因而本發(fā)明還包括與SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的氨基酸序列具有至少70%的同源性，優(yōu)選具有至少90%的同源性，但同時(shí)具有還原酶、磷酸化酶和CDP轉(zhuǎn)移酶酶活性的蛋白質(zhì)。上面使用的術(shù)語"多個(gè)"可以是小于100的數(shù)目，優(yōu)選為小于10的數(shù)目。此外，本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)合成成CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)這種新的單糖的酶進(jìn)行了研究，以抑制上述單糖的合成或生產(chǎn)上述這種單糖，詳述如下[OO49](1)調(diào)節(jié)還原酶的方法本發(fā)明涉及到調(diào)節(jié)還原酶Gtpl的功能的方法。在肺炎鏈球菌23F中這個(gè)還原酶將1，3-二羥基丙酮轉(zhuǎn)化為甘油。因?yàn)樗鼡碛羞@個(gè)功能，所以它可以在商業(yè)上用來將1，3-二羥基丙酮轉(zhuǎn)化為甘油。另一方面，本發(fā)明提供一種檢驗(yàn)還原酶Gtpl活性的方法。向待測(cè)樣品中加入足量的NADH，在適宜的條件和足夠的時(shí)間下反應(yīng)，檢測(cè)終產(chǎn)物NAD的生成，進(jìn)而檢測(cè)甘油的生成。(2)調(diào)節(jié)磷酸化酶的方法本發(fā)明涉及到調(diào)節(jié)磷酸化酶Gtp3的功能的方法。在肺炎鏈球菌23F中這個(gè)磷酸化酶將甘油轉(zhuǎn)化為甘油_2-磷酸。另一方面，本發(fā)明提供一種檢驗(yàn)磷酸化酶Gtp3活性的方法。向待測(cè)樣品中加入足量的甘油，在適宜的條件和足夠的時(shí)間下反應(yīng)，Gtp3與Gtp2偶聯(lián)，檢測(cè)終產(chǎn)物CDP-2-甘油的生成。(3)調(diào)節(jié)CDP轉(zhuǎn)移酶的方法本發(fā)明涉及到調(diào)節(jié)CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2功能的方法。在肺炎鏈球菌23F中這個(gè)CDP轉(zhuǎn)移酶將甘油_2-磷酸轉(zhuǎn)化為CDP-2-甘油。因?yàn)镚tp2擁有這個(gè)功能，所以它可以在商業(yè)上用來將甘油_2-磷酸轉(zhuǎn)化為CDP-2-甘油。另一方面，本發(fā)明提供一種檢驗(yàn)CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2活性的方法。向待測(cè)樣品中加入足量的甘油_2-磷酸，在適宜的條件和足夠的時(shí)間下反應(yīng)，檢測(cè)CDP-2-甘油的生成。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)有活性的物質(zhì)的抑制因子的方法。這種篩選CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2活性抑制因子的方法包括①將包含以下物質(zhì)的待測(cè)樣品在一定條件下培養(yǎng)(a)有CDP轉(zhuǎn)移酶活性的物質(zhì)(b)—個(gè)可能的抑制因子(c)甘油-2-磷酸；②終止反應(yīng)；③比較樣品與對(duì)照(不含可能的抑制因子)中CDP-2-甘油的濃度，如果與樣品比較，對(duì)照中的CDP-2-甘油的濃度降低就說明找到了CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的活性抑制因子。本發(fā)明進(jìn)一步公開了CDP-2-甘油在制備治療肺炎鏈球菌23F引起的細(xì)菌感染藥物方面的應(yīng)用。(1)利用本發(fā)明提供的序列制成反義寡核苷酸，然后利用反義寡核苷酸抑制對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)或者制成藥物，使對(duì)應(yīng)罕見單糖的合成受阻，最終阻止細(xì)菌的繁殖。本發(fā)明中的核酸序列相對(duì)于其正常轉(zhuǎn)錄狀態(tài)可以轉(zhuǎn)化為反義的核酸分子。更合適的情況是，轉(zhuǎn)化一個(gè)在起始密碼子之前的區(qū)域或一個(gè)未被觀察的區(qū)域，以得到反義序列。特別地，本發(fā)明中的核酸分子包含的核酸序列或其中的片段，特別是SEQIDN0:1，SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示的核酸序列相對(duì)于其正常轉(zhuǎn)錄狀態(tài)可以轉(zhuǎn)化為反義的核酸分子。本發(fā)明的反義核酸分子或其中一個(gè)片段可以通過使用天然存在的核苷酸或者各種用來增加分子的生物穩(wěn)定性或增加與mRNA或天然的基因結(jié)合的物理穩(wěn)定性的修飾的核苷酸(比如硫代磷酸化衍生物和吖啶替代核苷酸)進(jìn)行化學(xué)合成。還可以用生物方法合成反義序列將表達(dá)載體以重組質(zhì)粒、噬菌體質(zhì)?；驕p活病毒的形式轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。這樣，反義序列可以在高效調(diào)節(jié)區(qū)的控制下合成。合成效率取決于載體轉(zhuǎn)入的細(xì)胞種類。(2)利用本發(fā)明中的酶可制備單克隆抗體、多克隆抗血清或嵌和抗體衍生物等，這樣來抑制對(duì)應(yīng)酶的活性，使對(duì)應(yīng)罕見單糖的合成受阻。本發(fā)明中蛋白的活性可以被針對(duì)本發(fā)明中蛋白的抗體抑制?？梢杂脗鹘y(tǒng)方法制備抗體。比如，利用本發(fā)明中的蛋白或多肽，使用標(biāo)準(zhǔn)方法來制備多克隆抗血清或單克隆抗體。用具有免疫原性形式的多肽來免疫哺乳動(dòng)物(比如小鼠、大鼠或兔子)使之產(chǎn)生抗體反應(yīng)。使多肽具有免疫原性的技術(shù)包括將其連接到載體上或其它本領(lǐng)域公知的方法，比如加入佐劑。免疫過程可以通過檢測(cè)抗體在血漿或血清中的滴度方法控制。利用抗原這樣的免疫原和標(biāo)準(zhǔn)的ELISA實(shí)驗(yàn)或其它免疫檢測(cè)方法來評(píng)估抗體的水平。免疫過程之后可以獲得抗血清，如果需要可以血清中分離多克隆抗體。為生產(chǎn)單克隆抗體，可以從被免疫的動(dòng)物中涉及抗體產(chǎn)生細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)。這些細(xì)胞可以通過標(biāo)準(zhǔn)的體細(xì)胞融合方法和骨髓瘤細(xì)胞融合，使之穩(wěn)定并產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。這些技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的，比如雜交瘤技術(shù)是由Kohler和Milstein(Nature256，495-497(1975))發(fā)明的，人體B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，Immunol.Today4，72(1983))，通過EBV-雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生人體單克隆抗體(Cole等，《腫瘤治療中的單克隆抗體》(1985))AllenR.Bliss，Inc，77-96頁)，和組合抗體庫的篩選(Huse等，Science246，1275(1989))。利用免疫化學(xué)方法篩選雜交瘤細(xì)胞，然后產(chǎn)生與多肽特異反應(yīng)的抗體，并且可分離出單克隆抗體。嵌合抗體衍生物，比如由非人類動(dòng)物的可變區(qū)合人類的恒定區(qū)組成的抗體也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如嵌合抗體分子由來自鼠、小鼠或其它物種抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)和人類的恒定區(qū)組成?？梢杂脗鹘y(tǒng)方法制備含有識(shí)別本發(fā)明中某一蛋白的免疫球蛋白可變區(qū)的嵌合抗體(比如Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，6851(1985);Takeda等，Nature314,452(1985);Cabilly等，U.S.Pat.No.4，816，567;Boss等，U.S.Pat-No.4，816，397;Tanaguchi等，EuropeanPatentPublicationEP171496;EuropeanPatentPublication0173494，UnitedKingdompatentGB2177096B)。與本發(fā)明中某個(gè)蛋白特異反應(yīng)的單克隆或嵌合抗體可以通過產(chǎn)生人類恒定區(qū)嵌合體來進(jìn)一步類人化。人類恒定區(qū)嵌合體中的可變區(qū)，特別是抗原結(jié)合位點(diǎn)的保守骨架區(qū)是人源的，只有高變區(qū)是非人源的。這種免疫球蛋白分子可以通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)制備(比如Teng等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80，7308-7312(1983);Kozbor等，ImmunologyToday,4，7279(1983);01sson等，Meth.Enzymol.，92，3-16(1982)和PCTPublicationW092/06193或EP0239400)。類人化的抗體也可進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)(ScotgenLimited,2HollyRoad，Twickenham,Middlesex,GreatBritain)。(3)還可利用本發(fā)明中的核酸分子或蛋白分子制成疫苗來抑制細(xì)菌感染本發(fā)明也涉及一種通過服用疫苗使機(jī)體對(duì)本發(fā)明中的蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答來抑制或處理由肺炎鏈球菌23F引起的細(xì)菌胞感染的方法。在美國針對(duì)肺炎鏈球菌的有效多價(jià)多糖疫苗，一種是適用于嬰幼兒的，是2002年2月通過許可的存在于蛋白載體上的7價(jià)多糖疫苗(4，6B，9V，14，18C，19F和23F)，另一種是適用于成人的23價(jià)多糖疫苗。本發(fā)明還提出一種生產(chǎn)可作為商品或其它反應(yīng)底物的CDP-2-甘油的方法，該方法包括在生產(chǎn)CDP-2-甘油過程中使用上述酶的步驟。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下面特舉實(shí)施例，并配合說明書附圖，作詳細(xì)說明如下。圖1Gtpl，gtp2和gtp3反應(yīng)的毛細(xì)管電泳圖；圖2Gtp2反應(yīng)產(chǎn)物的一級(jí)質(zhì)譜；圖3Gtp2反應(yīng)產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜；圖4Gtp2反應(yīng)產(chǎn)物的核磁共振圖。具體實(shí)施例方式為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下面特舉實(shí)施例，并配合說明書附圖，作詳細(xì)說明如下。以下各實(shí)施例僅僅是用于說明不是限制本發(fā)明。實(shí)施例一合成酶某因的克降1.肺炎鏈球菌23F的總DNA提取(1)取其過夜培養(yǎng)的新鮮培養(yǎng)物3ml，離心收集菌體，菌體懸于500y150mMTris緩沖液中(pH8.0)，離心去上清，菌體重懸于500ii150mMTris緩沖液中(pH8.0)加入20iil0.5MEDTA(pH8.0)，混勻后37。C保溫20分鐘，之后加入20y120mg/ml溶菌酶，混勻后37。C保溫15分鐘，再加入25iU20mg/ml蛋白酶K，溫柔混勻后再加入30ii110%SDS，5(TC保溫至澄清，再加入10ii125mg/mlRNA酶，65。C保溫30分鐘，分別用等體積酚氯仿異戊醇抽提2次，氯仿異戊醇抽提1次，最后一次的上清溶液加入2.5倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于100iilTE緩沖液(pH8.0，10mMTris，lmMEDTA)。將分離到的待測(cè)肺炎鏈球菌單菌落用血平板，371:，5%C02培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。(2)將過夜培養(yǎng)的血瓊脂培養(yǎng)基上的菌體刮至1.5ml的印pendorf管中，加入500iiL50mM的Tris(pH8.0)重懸，10000rpm離心3分鐘，棄上清。(3)加入500iiL50mMTris(pH8.0)重懸，20iiL0.5MEDTA(pH8.0)，吹勻，37°C保溫20分鐘。(4)力B20iiL20mg/mL溶菌酶，混勻，37。C保溫20分鐘。(5)力B25iiL20mg/mL蛋白酶K，輕柔混勻。(6)力B30iiL10%SDS，5(TC水浴2小時(shí)至溶液澄清。(7)力B10iiL25mg/mLRNase，65。C水浴30分鐘。(8)加等體積的苯酚氯仿異戊醇(25:24:l)，輕柔顛倒數(shù)分鐘，12000rpm離心10分鐘，上清轉(zhuǎn)移至另一印pendorf管中，重復(fù)抽提一次。(9)上清液轉(zhuǎn)移至一新的印pendorf管中，加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，12000rpm離心10分鐘，上清液轉(zhuǎn)移至另一印pendorf管中。(10)加2.5倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，輕搖，沉淀DNA。(11)用毛細(xì)管繞起DNA，并用70%冰乙醇洗滌。(12)開蓋37"保溫30分鐘，揮發(fā)乙醇。(13)將DNA溶于100iiLTE中，DNA置-2(TC冰箱保存。2.還原酶Gtpl基因的克隆和篩選取前面所述的肺炎鏈球菌23F總DNA溶液作為模板，以下列寡核苷酸序列為引物，并按下述設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)PCR。設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)如下95°C，3min;95。C，30s;50.9°C，30s;72。C，lmin;72。C，7min;4°C，2h。引物序列見SEQIDNO:7SEQIDNO:7上游引物5，-GGGAATTCCATATGTTGAAAAATAATGATTTAAAGATA-3，下游引物5，-CCGCTCGAGCTACAACTCGCTTATGAGTTC-3'將上述PCR產(chǎn)物用Ndel和Xhol雙酶切，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收lkb酶切產(chǎn)物片段，與經(jīng)同樣限制型內(nèi)切酶酶解并切膠回收的質(zhì)粒pET-28a(+)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a后，涂于50iig/mlKan(卡那霉素)的LB固體培養(yǎng)基上。37。C培養(yǎng)12小時(shí)后，挑取單克隆菌落提取質(zhì)粒鑒定，插入有SEQIDNo:l所示的DNA序列的pET-28a(+)質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pLW1282，含有該質(zhì)粒的重組大腸桿菌DH5a為H1550。采用Sanger雙脫氧法對(duì)此DNA片段進(jìn)行了測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，該基因DNA片段全長(zhǎng)1029bp。由TTG起始密碼開始，到TAG終止密碼子結(jié)尾，其核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。3磷酸化酶Gtp3基因的克隆和篩選取前面所述的肺炎鏈球菌23F總DNA溶液作為模板，以下列寡核苷酸序列為引物，并按下述設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)PCR。設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)如下95。C，3min;95。C，30s;50。C，30s;72。C，lmin;72。C，7min;4。C，2h。引物序列見SEQIDNO:8SEQIDNO:8上游引物5，-CATGCCATGGGCATGAAATTGACAAATAGAGTTGA-3'下游引物5，-CCGCTCGAGGACAATTCCTTTCCACATT-3'將上述PCR產(chǎn)物用NcoI和XhoI雙酶切，經(jīng)O.8%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收O.8kb酶切產(chǎn)物片段，與經(jīng)同樣限制型內(nèi)切酶酶解并切膠回收的質(zhì)粒pET-28a(+)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a后，涂于50iig/mlKan(卡那霉素)的LB固體培養(yǎng)基上。37。C培養(yǎng)12小時(shí)后，挑取單克隆菌落提取質(zhì)粒鑒定，插入有SEQIDNo:2所示的DNA序列的pET-28a(+)質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pLW1207，含有該質(zhì)粒的重組大腸桿菌DH5a為H1445。采用Sanger雙脫氧法對(duì)此DNA片段進(jìn)行了測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，該基因DNA片段全長(zhǎng)834bp。由ATG起始密碼開始，到TAT終止密碼子結(jié)尾，其核苷酸序列如SEQIDNo:2所示。4.CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2基因的克隆和篩選取前面所述的肺炎鏈球菌23F的總DNA溶液作為模板，以下列寡核苷酸序列為引物，并按下述設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)PCR。設(shè)定的PCR循環(huán)參數(shù)如下95。C，3min;95。C，30s;50。C，30s;72。C，lmin;72。C，7min;4。C，2h。引物序列見SEQIDNO:9SEQIDNO:9上游引物5，-CATGCCATGGGCATGAAAGCACTTATTTTAGCA-3'下游引物5'-CCGCTCGAGAGCAAATAGTTTTTCTGCAG-3將上述PCR產(chǎn)物用NcoI和XhoI雙酶切，經(jīng)O.8%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收0.7kb酶切產(chǎn)物片段，與經(jīng)同樣限制型內(nèi)切酶酶解并切膠回收的質(zhì)粒pET-28a(+)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a后，涂于50iig/mlKan(卡那霉素)的LB固體培養(yǎng)基上。37。C培養(yǎng)12小時(shí)后，挑取單克隆菌落提取質(zhì)粒鑒定，插入有SEQIDNo:3所示的DNA序列的pET-28a(+)質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pLW1263，含有該質(zhì)粒的重組大腸桿菌DH5a為HI520。采用Sanger雙脫氧法對(duì)此DNA片段進(jìn)行了測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，該基因DNA片段全長(zhǎng)705bp。由ATG起始密碼開始，到ATT終止密碼子結(jié)尾，其核苷酸序列如SEQIDNo:3所示。實(shí)施例二合成酶的純化1.重組還原酶Gtpl的純化和特性將上述重組菌E.coliDH5aH1550中的質(zhì)粒pLW1282提出，轉(zhuǎn)入到E.coliBL21中，并篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子單克隆接入20ml含50iig/mlKan的LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)12小時(shí)，然后將培養(yǎng)物按1%(V/V)接種量接入200ml含50yg/mlKan的LB培養(yǎng)基(共2個(gè)搖瓶)，37°C，200rpm培養(yǎng)A600為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.lmM，25°C，200rpm誘導(dǎo)4小時(shí)。離心收集菌體，懸于一定量的Bindingbuffer(50mMNaH2P04，pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑)中，利用超聲波破碎細(xì)胞，離心上清液為重組還原酶Gtpl的粗提液。此上清經(jīng)螯合瓊脂糖凝膠(ChelatingS印harose)鎳親合柱層析純化，得到的酶制劑在SDS-PAGE上顯示一條帶。利用已知的蛋白質(zhì)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定此重組該磷酸化酶的分子量為39.1KD，與理論推算的分子量(38.3KD)相似。2.重組磷酸化酶Gtp3的純化和特性將上述重組菌E.coliDH5aH1445中的質(zhì)粒pLW1207提出，轉(zhuǎn)入到E.coliBL21中，并篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子單克隆接入20ml含50iig/mlKan的LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)12小時(shí)，然后將培養(yǎng)物按1%(V/V)接種量接入200ml含50yg/mlKan的LB培養(yǎng)基(共2個(gè)搖瓶)，37°C，200rpm培養(yǎng)A600為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.lmM，37°C，200rpm誘導(dǎo)4小時(shí)。離心收集菌體，懸于一定量的Bindingbuffer(50mMNaH2P04，pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑)中，利用超聲波破碎細(xì)胞，離心上清液為重組磷酸化酶Gtp3的粗提液。此上清經(jīng)螯合瓊脂糖凝膠(ChelatingS印harose)鎳親合柱層析純化，得到的酶制劑在SDS-PAGE上顯示一條帶。利用已知的蛋白質(zhì)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定此重組該磷酸化酶的分子量為31.7KD，與理論推算的分子量(33.7KD)相似。3.重組CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的純化和特性E.coliDH5aH1520中的質(zhì)粒pLW1263提出，轉(zhuǎn)入到E.coliBL21中，并篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子單克隆接入20ml含50iig/mlKan的LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm培養(yǎng)12小時(shí)，然后將培養(yǎng)物按1%(V/V)接種量接入250ml含50yg/mlKan的LB培養(yǎng)基(共2個(gè)搖瓶)，37°C，200rpm培養(yǎng)A600為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.lmM，37。C，200rpm誘導(dǎo)4小時(shí)。離心收集菌體，懸于一定量的Bindingbuffer(50mMNaH2P04pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑)中，利用超聲波破碎細(xì)胞，離心上清液為重組CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的粗提液。此上清經(jīng)螯合瓊脂糖凝膠(ChelatingS印harose)鎳親合柱層析純化，得到的酶制劑在SDS-PAGE上顯示一條帶。利用已知的蛋白質(zhì)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定此重組CDP轉(zhuǎn)移酶的分子量為27.5KD，與理論推算的分子量(28.3KD)相似。實(shí)施例三肺炎鏈球菌23F中CDP-2-甘油產(chǎn)物的鑒定1.重組還原酶Gtpl的作用在O.5ml離心管中裝入20iil下列反應(yīng)體系10mM1，3_二羥基丙酮，lmM的NADH，50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，2.97PM實(shí)施例二中制得的重組氧化還原酶Gtpl的純化酶制劑。37。C反應(yīng)0.5小時(shí)。加入等體積的氯仿抽提，水相經(jīng)BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛細(xì)管電泳分析，結(jié)果如圖1所示，結(jié)果顯示NADH完全消失，有新產(chǎn)物NAD生成。初步證明1，3-二羥基丙酮被還原為甘油。2.重組CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的作用在O.5ml離心管中裝入20ii1下列反應(yīng)體系20mM甘油_2_磷酸，50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，5匪的CTP，O.013mM實(shí)施例二中制得的重組CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的純化酶制劑。37。C反應(yīng)0.5小時(shí)。加入等體積的氯仿抽提，水相經(jīng)BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛細(xì)管電泳分析，結(jié)果如圖1所示，結(jié)果顯示CTP完全消失，有新產(chǎn)物生成。重復(fù)此反應(yīng)，積累500iil體系后，經(jīng)FinniganLCQAdvantageMAX質(zhì)譜儀檢測(cè)，初步證明產(chǎn)物為CDP-2-甘油，如圖2所示。3.重組磷酸化酶Gtp3的作用在O.5ml離心管中裝入20ii1下列反應(yīng)體系5mM甘油，50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，0.071mM實(shí)施例二中制得的重組磷酸化酶Gtp3的純化酶制劑。37。C反應(yīng)0.5小時(shí)。加入等體積的氯仿抽提，取水相，再加入相應(yīng)比例的CTP和0.026mM實(shí)施例二中制得的重組CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的純化酶制劑37t:反應(yīng)0.5小時(shí)。結(jié)果如圖1所示，結(jié)果顯示CTP完全消失，有ATP和新產(chǎn)物生成。實(shí)施例四終產(chǎn)物CDP-2-甘油的分離純化及質(zhì)譜檢測(cè)方法將反應(yīng)體系注入島津LC-20AT高效液相色譜中分離，使用Ve皿silMP-C18柱(4.6X250mm)，流動(dòng)相為70%乙腈和30%水，流速為0.6ml/min。將收集到的產(chǎn)物注入FinniganLCQAdvantageMAX質(zhì)譜儀檢測(cè)。使用電噴霧源，負(fù)相，4.5kV，22(TC。以氮?dú)庾鳛榕鲎矚怏w，氦氣為輔助氣體。在做二級(jí)質(zhì)譜時(shí)碰撞能量為20-30eV。^MMi肺炎鏈球菌合成途徑的確定肺炎鏈球菌中CDP-2-甘油合成途徑中的三個(gè)酶Gtpl，Gtp3和Gtp2的功能均未在其它菌株中被鑒定過。通過實(shí)施例三中的實(shí)驗(yàn)證明了肺炎鏈球菌23F中的還原酶Gtpl將1，3-二羥基丙酮轉(zhuǎn)化為甘油，磷酸化酶Gtp3將甘油轉(zhuǎn)化為甘油-2-磷酸，CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2將甘油2-磷酸轉(zhuǎn)化為CDP-2-甘油。至此證明了肺炎鏈球菌23F中CDP-2-甘油的合成途徑可以表述如下1，3二羥基丙酮一甘油一甘油_2-磷酸一CDP-2-甘油實(shí)際制備方法如下10mM的1，3-二羥基丙酮，lmM的NADH，50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，2.97iiM還原酶Gtpl的純化酶制劑，37。C恒溫水浴鍋中反應(yīng)0.5小時(shí)，1，3-二羥基丙酮即被還原成甘油。然后5mM甘油，5mMATP，5mMCTP，50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，0.05U/mlIP，0.071mM重組磷酸化酶Gtp3的純化酶制劑和0.026mM的重組CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的純化酶制劑，37。C水浴反應(yīng)0.5小時(shí)。加入等體積的氯仿抽提，水相經(jīng)BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛細(xì)管電泳分析，有CDP-2-甘油的生成。如果以甘油_2_磷酸為底物，在下列條件下，同樣可以實(shí)現(xiàn)CDP-2-甘油的制備。20mM的甘油-2-磷酸，5mMCTP，50mM磷酸鹽緩沖液(pH8.07.4)，10mMMgCl2，0.05U/mlIP，O.013mM的重組CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的純化酶制劑。37"C反應(yīng)0.5小時(shí)。12^MMA合成酶的活性鑒定1.重組還原酶的活性鑒定在0.5ml離心管中裝入20ii1下列反應(yīng)體系10mM的1，3_二羥基丙酮，ImM的NADH，50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，2.97yM實(shí)施例二中制得的重組還原酶Gtpl的純化酶制劑。37。C反應(yīng)0.5小時(shí)。加入等體積的氯仿抽提，水相經(jīng)BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛細(xì)管電泳分析。(1)最適酶活溫度上述反應(yīng)條件下，在4-75t:范圍內(nèi)測(cè)定上述重組還原酶Gtpl的活性，結(jié)果表明該酶的最適溫度為37°C。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(2)最佳反應(yīng)pH上述反應(yīng)條件下，在pH5.5-9.5范圍內(nèi)測(cè)定上述重組還原酶Gtpl的活性，結(jié)果表明該酶的最適pH范圍為6.5-7.0。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(3)金屬離子影響上述反應(yīng)條件下，金屬離子為NH4+，Mg2+，Ca2+，Ni2+，Zn2+，Cu2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+條件下，測(cè)定上述重組還原酶Gtpl的活性，結(jié)果表明該還原酶對(duì)金屬離子沒有依賴，但是其中Fe"對(duì)其轉(zhuǎn)化率有促進(jìn)作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(4)H值測(cè)定上述反應(yīng)條件下(60°C)，50mM磷酸鹽緩沖液(pH6.5)，0.496yM酶，5min)，改變一種底物的濃度，測(cè)定NAD+的生成濃度，根據(jù)米氏方程得出上述重組CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的Km12/14頁值和k,底物K邁(mM)Kcat(min-1)V隨(mMmin—1)1，3-二羥基丙酮0.12±0.0150.40±11.230.025±0.006甘油醛0.19±0.0321.47±4.960.021±0.005膽H1.74±0.21247.98±34.390.123±0.022.重組CDP轉(zhuǎn)移酶的活性測(cè)定在O.5ml離心管中裝入20ii1下列反應(yīng)體系5mM甘油_2_磷酸，50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，10mMMgCl2，0.013mM實(shí)施例二中制得的重組CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的純化酶制劑。37。C反應(yīng)0.5小時(shí)。加入等體積的氯仿抽提，水相經(jīng)BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛細(xì)管電泳分析。(1)最適酶活溫度上述反應(yīng)條件下，在4-75t:范圍內(nèi)測(cè)定上述重組CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的活性，結(jié)果表明該酶的最適溫度為37°C。溫度rc)4152537506575轉(zhuǎn)化率(％)13.324.933.660.929.98.75.7(2)最佳反應(yīng)pH上述反應(yīng)條件下，在pH6.0-9.5范圍內(nèi)測(cè)定上述重組CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的活性，結(jié)果表明該酶的最適pH為8.0。pH66.57.07.58.08.59.09.5轉(zhuǎn)化率(％)45.648.557.159.565.149.246.833.1(3)金屬離子的影響上述反應(yīng)條件下，金屬離子為NH4+，Mg2+，Ca2+，Ni2+，Zn2+，Cu2+，F(xiàn)e"條件下，測(cè)定上述重組CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的活性，結(jié)果表明該CDP轉(zhuǎn)移酶對(duì)Mg2+有依賴，其中Fe3+對(duì)其轉(zhuǎn)化率有促進(jìn)作用。Ni"和Cu"對(duì)其酶活的抑制作用最大。離子無Fe2+NH4+Cu2+Ni2+Ca2+Zn2+Co2+Mn2+Fe3+Mg2+轉(zhuǎn)化率(％)084.451.50035.447.717.123.355.455.7(4)Km、k。at值測(cè)定16上述反應(yīng)條件下(37t:，50mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)，0.028yM酶，5min)，改變一種底物的濃度，測(cè)定CDP-2-甘油的生成濃度，根據(jù)米氏方程得出上述重組CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的Km值和kcat。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>3.重組磷酸化酶的活性鑒定在0.5ml離心管中裝入20iU下列反應(yīng)體系5mM甘油，50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，0.071mM實(shí)施例二中制得的重組磷酸化酶Gtp3的純化酶制劑。37。C反應(yīng)0.5小時(shí)。加入等體積的氯仿抽提，取水相，再加入相應(yīng)比例的CTP和0.026mM實(shí)施例二中制得的重組CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的純化酶制劑37t:反應(yīng)0.5小時(shí)。加入等體積的氯仿抽提，水相經(jīng)BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛細(xì)管電泳分析。雖然本發(fā)明已較佳實(shí)施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可做些許的更動(dòng)與改進(jìn)，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。權(quán)利要求一種在革蘭氏陽性菌細(xì)菌中采用還原酶合成的CDP-2-甘油，其中的革蘭氏陽性菌為肺炎鏈球菌23F，所述的還原酶包括Gtp1，CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2和磷酸化酶Gtp3。2.權(quán)利要求l所述的甘油，其還原酶Gtpl編碼的基因選自下列a)、b)或c)核苷酸序列a)SEQIDN0:1所示的核苷酸序列;b)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，不同于SEQIDN0:1但編碼的氨基酸序列與SEQIDN0:1所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；c)在嚴(yán)格雜交條件下與上述a)或b)中的序列雜交，并且編碼具有活性的還原酶的核苷酸序列。3.權(quán)利要求2所述的甘油，其編碼還原酶Gtpl選自于下列j)、k)或l)的氨基酸序列j)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；k)SEQIDN0:4所示的氨基酸序列;1)上述k)中缺失、替換或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸后的氨基酸序列，并且具有該序列的蛋白質(zhì)有還原酶的活性。4.權(quán)利要求2或3所述的甘油，其中還原酶Gtpl的重組質(zhì)粒載體為pET-28a(+)，重組菌是導(dǎo)入了還原酶。5.權(quán)利要求2或3所述的甘油，其特征在于在磷酸化酶Gtp3作用下，將甘油轉(zhuǎn)化為甘油2-磷酸。6.權(quán)利要求5所述的甘油-2-磷酸，其編碼磷酸化酶Gtp3的基因選自于下列d)、e)或f)核苷酸序列d)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列;e)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，不同于SEQIDN0:2但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:2所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；f)在嚴(yán)格雜交條件下與上述d)或e)中的序列雜交，并且編碼具有活性的磷酸化酶的核苷酸序列。7.權(quán)利要求6所述的甘油-2-磷酸，其編碼的磷酸化酶Gtp3選自于下列p)、q)或r)氨基酸序列P)上述d)、e)或f)所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；q)SEQIDNO:5所示的氨基酸序列;r)上述q)中缺失、替換或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸后的氨基酸序列，并且具有該序列的蛋白質(zhì)有磷酸化酶的活性。8.權(quán)利要求7或8所述的甘油_2-磷酸，其中磷酸化酶61。3的重組質(zhì)粒載體為pET-28a(+)，重組菌是通過導(dǎo)入到磷酸化酶Gtp3。9.權(quán)利要求6所述的甘油-2-磷酸，其特征在于在CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的作用下，將甘油2-磷酸轉(zhuǎn)化為CDP-2-甘油。10.權(quán)利要求11所述的CDP-2-甘油，其中所述的編碼CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的基因選自于下列g(shù))、h)或i)的核苷酸序列g(shù))SEQIDN0:3所示的核苷酸序列;h)由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，不同于SEQIDN0:5但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO:3所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；i)在嚴(yán)格雜交條件下與上述g)或h)中的序列雜交，并且編碼具有活性的CDP轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列。11.權(quán)利要求12所述的CDP-2-甘油，其編碼CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2選自于下列該m)、n)或o)的氨基酸序列m)上述g)、h)或i)所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；n)SEQIDNO:6所示的氨基酸序列;o)上述n)中缺失、替換或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸后的氨基酸序列，并且具有該序列的蛋白質(zhì)有磷酸化酶的活性。12.權(quán)利要求11或12所述的CDP-2-甘油，其中CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2的重組質(zhì)粒載體為pET-28a(+)，重組菌是導(dǎo)入到CDP轉(zhuǎn)移酶Gtp2。13.CDP-2-甘油在制備治療肺炎鏈球菌23F引起的細(xì)菌感染藥物方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種在革蘭氏陽性菌細(xì)菌中利用氧化還原酶合成的甘油化合物(Glycerol)，以及采用甘油和磷酸化酶合成甘油-2-磷酸(glycerol-2-phosphat)中間體，進(jìn)而進(jìn)一步合成CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)，本發(fā)明還公開了上述單糖合成中所采用的三種酶以及CDP-2-甘油在治療肺炎鏈球菌23F引起的細(xì)菌感染藥物方面的應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N9/16GK101792475SQ20101014180公開日2010年8月4日申請(qǐng)日期2010年4月8日優(yōu)先權(quán)日2010年4月8日發(fā)明者馮露,徐艷麗,王磊,王荃申請(qǐng)人:南開大學(xué)