專利名稱：：一種分泌表達黑曲霉木聚糖酶的食品級重組乳酸乳球菌及制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種可表達分泌型黑曲霉木聚糖酶的食品級重組乳酸乳球菌，同時還提供了該乳酸乳球菌的制備方法和應(yīng)用，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：黑曲霉(Aspergillusniger)木聚糖酶B可以高效降解木聚糖，備受國內(nèi)外科研工作者重視。木聚糖酶B通過降解木聚糖主鏈上木糖殘基之間的0-1，4_糖苷鍵，將木聚糖降解成短鏈的木寡糖和木二糖以及少量的的木糖和阿拉伯糖，是降解木聚糖的關(guān)鍵酶之一。但是黑曲霉表達的木聚糖酶B是誘導(dǎo)酶，同時有葡萄糖等物質(zhì)存在時，木聚糖酶B的合成受到阻遏；又由于黑曲霉菌種自身的特性導(dǎo)致其所合成的木聚糖酶B需經(jīng)分離純化才能使用，因此限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。L.lactisNZ3900/pNZ8149表達系統(tǒng)是乳酸菌食品級高效表達系統(tǒng)NICE(thenisincontrolledexpression,NICE)系統(tǒng)中的一員，pNZ8149載體以lacF為選擇標(biāo)記，lacF缺陷型L.lactisNZ3900作為宿主，利用乳糖進行篩選，L.lactisNZ3900/pNZ8149表達系統(tǒng)是典型的食品級表達系統(tǒng)。但是由于該系統(tǒng)是胞內(nèi)表達系統(tǒng)，外源基因產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)大量表達易形成包涵體，產(chǎn)物分離時需要對菌體進行破碎處理，處理不當(dāng)會影響產(chǎn)物活性和產(chǎn)物回收率等指標(biāo)，因此在實際應(yīng)用中該系統(tǒng)還存在一定的缺陷。目前，國內(nèi)外對黑曲霉木聚糖酶B和L.lactisNZ3900/pNZ8149系統(tǒng)均以開展了較多的研究工作，但對于將PNZ8149載體改造為分泌表達載體以及利用改造后的分泌表達載體在L.lactisNZ3900中表達黑曲霉木聚糖酶B則未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種可表達分泌型黑曲霉木聚糖酶的食品級重組乳酸乳球菌，可表達分泌型黑曲霉木聚糖酶B，有利于木聚糖酶B發(fā)揮活性。本發(fā)明還提供上述重組乳酸乳球菌的制備方法，解決了原pNZ8149載體胞內(nèi)表達的局限。本發(fā)明的可表達分泌型黑曲霉木聚糖酶B的食品級重組乳酸乳球菌，其特征在于菌株中含有表達載體pNZS-XYNB，所述的表達載體pNZS-XYNB是在載體pNZ8149加入了以下元件乳酸乳球菌MG1363的Usp45信號肽基因SPusp45序列；黑曲霉木聚糖酶B的成熟肽編碼序列XYNB。本發(fā)明所述食品級重組乳酸乳球菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)將乳酸乳球菌MG1363的Usp45信號肽基因SPusp45序列克隆到表達載體PNZ8149的啟動子PnisA下游；2)利用特異性引物通過PCR方法刪除啟動子序列和信號肽基因序列間的Ncol酶切位點，將基因SPusp45融合到PnisA下游，構(gòu)建的載體pNZS；3)將黑曲霉木聚糖酶B基因克隆到分泌表達載體pNZS的多克隆位點中，構(gòu)建了可表達分泌型黑曲霉木聚糖酶B的載體pNZS-XYNB，將pNZS-XYNB載體利用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入受體菌L.IactisN3900，篩選培養(yǎng)得到分泌表達黑曲霉木聚糖酶B的食品級重組乳酸乳球菌。本發(fā)明所述的構(gòu)建方法，其特征在于SPusp45信號肽基因序列的引物為5'端引物Pl:5'GGGCCATGGATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTC3‘3'端引物P2:5'TATGCATGCAGCGTAAACACCTGACAACGGGGCTGCAGCAGAAAGTATCACTGTAGACA3'改造載體刪除NcoI酶切位點用引物為5'端引物P2:5'ATGAAAAAAAAGATTATCTCAGC3'3'端引物P3:5'GGTGAGTGCCTCCTTATAAT3'本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明提供的表達分泌型黑曲霉木聚糖酶B的食品級重組乳酸乳球菌，可以表達木聚糖酶B，并將木聚糖酶B分泌到培養(yǎng)基中，分泌率最高可達47.94%。彌補了傳統(tǒng)原核表達系統(tǒng)不能分泌表達的不足，同時又避免了采用釀酒酵母和畢赤酵母等真核表達系統(tǒng)帶來的蛋白糖基化嚴(yán)重等問題，大大降低了酶產(chǎn)品的制備難度，有利于木聚糖酶B發(fā)揮活性。將發(fā)明應(yīng)用于木聚糖酶飼料添加劑等的生產(chǎn)，則具有宿主安全益生、產(chǎn)酶時期可控、菌體生長周期短和產(chǎn)物不需提取就可以同重組菌一起直接投入應(yīng)用的優(yōu)點，因此具有重要的實際意義和廣闊的開發(fā)前景！圖1為構(gòu)建含有SPusp45信號肽基因的重組乳酸乳球菌表達載體的技術(shù)路線圖。圖2為構(gòu)建含有XLNB的重組乳酸乳球菌表達載體的技術(shù)路線圖。圖3為SPusp45的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖4為SPusp45的測序圖。圖5為線形pNZS載體環(huán)化后電穿孔轉(zhuǎn)化子的平板篩選圖。圖6為pNZS載體改造后的測序圖譜。圖7為pNZS-gus質(zhì)粒DNA的PCR鑒定圖。圖8為重組乳酸乳球菌菌株L.IactisN3900/pNZS-gus和L.IactisN3900/pNZS的GUS染色圖片。圖9為黑曲霉總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖10為XYNB基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖11為表達載體pNZS-XLNB的電穿孔轉(zhuǎn)化子的平板篩選圖。圖12為重組乳酸乳球菌菌株L.IactisN3900/pNZS-XLNB質(zhì)粒DNA的PCR和酶切鑒定圖。圖13為pNZS-XLNB質(zhì)粒測序后的XLNB基因核苷酸序列同參考序列AspergillussulphureusxylanaseBmRNA,completecds(DQ168666)的DNAMAN比對圖。圖14為pNZS-XLNB質(zhì)粒測序序列經(jīng)Primmerpremier5.0軟件翻譯后的氨基酸序列同參考序列AspergillussulphureusxylanaseBmRNA,completecds(DQ168666)的氨基酸序列DNAMAN比對圖。圖15為木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實施例方式下述實施方式中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，工具酶均購自寶生物公司。1、分泌表達載體pNZS的構(gòu)建及驗證分泌表達載體pNZS的構(gòu)建技術(shù)路線如圖1所示，具體步驟如下(1)引物設(shè)計根據(jù)GeneBbankEU382094公布的乳酸乳球菌MG1363的Usp45信號肽基因SPusp45序列，利用Primmerpremier5.0軟件設(shè)計一對各長50bp的引物，且在兩條引物3’端引入19bp的互補序列，5’端分別引入Ncol和SphI酶切位點以及保護堿基，互補序列和酶切位點用下劃線標(biāo)出，如下5’端引物P1:5，GGGCCATGGATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTC3，3，端引物P2:5’TATGCATGCAGCGTAAACACCTGACAACGGGGCTGCAGCAGAAAGTATCACTGTAGACA3’根據(jù)SPusp45序列設(shè)計一對鑒定引物，如下P35，ATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCT3，P45，AGCGTAAACACCTGACAAC3，根據(jù)pNZ8149載體序列和SPusp45序列，利用Primmerpremier5.0軟件設(shè)計一對用于改造載體的引物，如下5，端引物P5:5，ATGAAAAAAAAGATTATCTCAGC3，3，端引物P6:5’GGTGAGTGCCTCCTTATAAT3’(2)SPusp45序列的克隆以步驟(1)所示引物P1、P2在不添加模板的條件下進行PCR克隆SPusp45，體系和條件如下反應(yīng)體系25iiL10Xbuffer(5mMMg2+Plus)2.5uL>dNTPMixture(lOmmol/L):0.4uL>PI(50pmol/L):0.5iiL、P2(50pmol/L):0.5uL,Taq酶(5u/u1):0.2iiL、滅菌ddH20:upto25y1。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min；94°C變性20sec，42°C退火15sec，72°C延伸20sec，30cycles，72°C后延伸8min；上述PCR產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測見(圖3)，圖中泳道1為SPusp45片段PCR產(chǎn)物，在約81bp處有特異亮帶，表明目的基因擴增成功。將擴增產(chǎn)物經(jīng)T-A克隆送三博遠(yuǎn)志公司測序(TA克隆系列購自TAKARA公司)，測序結(jié)果見(圖4)，結(jié)果表明所得序列與Genebank上公布的SPusp45序列完全一致。(3)重組分泌表達載體pNZS的構(gòu)建SPusp45的PCR產(chǎn)物和pNZ8149質(zhì)粒同時進行NcoI和SphI限制性酶切，將酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，電擊轉(zhuǎn)化L.lactiSN3900，轉(zhuǎn)化子經(jīng)平板篩選(胰蛋白胨20.Og，酵母粉5.Og，氯化鈉4.Og，醋酸鈉1.5g，抗壞血酸0.5g，15.Og瓊脂粉，蒸餾水定容至1L，pH值7.0，滅菌后加入終濃度0.5%的乳糖，和0.004%溴甲酚紫)，平板篩選獲得的陽性重組質(zhì)粒命名為pNZ-S，pNZ-S載體用步驟(1)設(shè)計的引物P3、P4進行PCR鑒定，以鑒定正確的重組質(zhì)粒pNZ-S為模板，用步驟(2)設(shè)計的引物P5、P6和PrimeSTARTMHSDNAPolymerase進行擴增，體系參照PrimeSTARTMHSDNAPolymerase說明書，經(jīng)PCR反應(yīng)刪除啟動子和SPusp45基因間的NcoI酶切位點，將SPusp45基因融合在啟動子下游作為載體上的信號肽基因片段，消除NcoI位點中ATG堿基對翻譯起始影響的同時縮短了外源基因序列同SD序列的相對距離，有助于提高轉(zhuǎn)錄效率，擴增產(chǎn)物經(jīng)磷酸化后用T4DNA連接酶連接重新環(huán)化，獲得的載體命名為pNZS，連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化L.lactisN3900，平板篩選見(圖5)，陽性菌落呈黃色，經(jīng)篩選獲得攜帶陽性重組質(zhì)粒pNZS的菌株，利用引物P4進行測序，測序由三博遠(yuǎn)志公司完成，測序結(jié)果見(圖6)，圖中1代表上游啟動子，2代表下游信號肽，測序顯示已經(jīng)成功刪除了NcoI酶切位點，分泌表達系統(tǒng)L.IactisN3900/pNZS構(gòu)建成功。(4)利用gus報告基因驗證分泌表達載體pNZS的分泌表達特性，gus為本實驗室保存，序列參照Genebank中AF502128，將gus插入pNZS多克隆位點中，電擊轉(zhuǎn)化L.IactisN3900，經(jīng)篩選獲得陽性重組菌命名為L.IactisN3900/pNZS-gus,pNZS-gus的PCR鑒定結(jié)果見(圖7)，在約1840bp處出現(xiàn)亮帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符，圖中泳道1為gus基因PCR擴增產(chǎn)物。將L.IactisN3900/pNZS-gus菌株進行GUS染色，按10ngNisin/lml培養(yǎng)基的量加入Msin進行誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時誘導(dǎo)培養(yǎng)后，進行培養(yǎng)物菌體與培養(yǎng)基分離，分離后的培養(yǎng)基經(jīng)0.22μm醋酸纖維素濾膜過濾除菌，然后對培養(yǎng)基進行⑶S染色，以L.IactisN3900/pNZS為對照，染色結(jié)果見(圖8)，結(jié)果表明L.lactiSN3900/pNZS-guS菌株可以正確表達有活性的⑶S蛋白，并將蛋白分泌細(xì)胞外，由此證明分泌表達載體pNZS構(gòu)建成功。2、表達分泌型黑曲霉木聚糖酶B的重組L.IactisN3900的獲得(1)黑曲霉木聚糖酶B基因XYNB的擴增利用添加0.5%木聚糖的察氏培養(yǎng)基對黑曲霉進行菌絲體培養(yǎng)，并用DNS法跟蹤測量木聚糖酶B活性，當(dāng)酶活最大時利用購自TAKARA公司的RNA提取試劑盒提取黑曲霉總RNA,按試劑盒提取步驟進行總RNA的提取。提取出的總RNA利用無RNA酶的DnaseI(購自TAKARA公司)作酶切純化處理，按說明書操作。純化后的總RNA經(jīng)甲醛變性凝膠電泳檢測見(圖9)，結(jié)果證明所提取的RNA均有三條帶，分別為28S、18S、5.8SRNA條帶，亮度符合試驗要求。純化后的總RNA利用反轉(zhuǎn)錄酶按說明書進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。根據(jù)GenBank已發(fā)表的木聚糖酶B基因XYNB(GenBank的登錄號為DQ168666)RNA序列，應(yīng)用PrimerPremierS.O引物設(shè)計軟件分別設(shè)計一對特異性引物，為了便于定向克隆和載體構(gòu)建，在上游引物和下游引物的5’端分別加入限制性內(nèi)切酶位點和保護堿基(畫線部分為加入的酶切位點)5，端引物P7:SphI5，TTTGCATGCATGCTCACCAAGAACCT3，3，端引物P8:Spel5’CGGACTAGTTTACTGAACAGTGATGGAG3’以cDNA為模板，通過PCR擴增黑曲霉木聚糖酶基因的DNA片段，PCR擴增反應(yīng)體系如下反應(yīng)體系:25u1；10Xbuffer(Mg2+plus)2.5uL>dNTPMixture(20mmol/L)0.5iiL、P7(50pmol/L):1iiL、P8(50pmol/L)1uL>Template(70ng/u1):1iil、Taq酶(5u/ill):0.2iiL、滅菌ddH20:upto25yl。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性50sec，53°C退火35sec，72°C延伸50sec，30cycles，72°C后延伸8min；PCR反應(yīng)結(jié)束后，全量反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果見(圖10)所示，圖中泳道1為XYNB片段PCR產(chǎn)物在約678bp處有特異亮帶，所得目的條帶符合預(yù)期大小。(2)、木聚糖酶基因重組乳酸乳球菌表達載體pNZS-XYNB的構(gòu)建含有目的基因的重組乳酸乳球菌表達載體pNZS-XYNB的構(gòu)建過程見圖2所示，具體步驟如下1)、重組表達載體pNZS-XYNB的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌XYNB的PCR產(chǎn)物和表達載體pNZS質(zhì)粒DNA分別用SphI和Spel雙酶切，酶切體系20iU，37°C酶切3h。反應(yīng)結(jié)束后，全量反應(yīng)液于的瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段。用T4DNA連接酶連接，反應(yīng)體系20iU，混勻，16°C反應(yīng)16h。連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化L.lactisN3900，在篩選培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，篩選結(jié)果見(圖11)，陽性轉(zhuǎn)化子可以在含有乳糖和溴甲酚紫的篩選平板上生長，菌落呈黃色，初步表明本發(fā)明所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒進行PCR和酶切鑒定，結(jié)果見(圖12)，泳道1為XLNB的PCR產(chǎn)物，泳道2為pNZS-XLNB的SphI、Spel雙酶切產(chǎn)物，產(chǎn)物條帶符合預(yù)期大。將pNZS-XYNB質(zhì)粒送往三博遠(yuǎn)志公司測序鑒定，測序所得核苷酸序列同參考序列DQ168666的DNAMAN比對，結(jié)果(見圖13)，同源率為99.26%。將pNZS-XLNB質(zhì)粒測序核苷酸序列經(jīng)Primmerpremier5.0軟件翻譯后的氨基酸序列同參考序列AspergillussulphureusxylanaseBmRNA,completecds(DQ168666)的氨基酸序列進行DNAMAN比對，結(jié)果見(圖14)，同源率100%。保證插入的外源基因在宿主內(nèi)可以正確翻譯的概率，pNZS-XYNB轉(zhuǎn)化的陽性菌株稱為L.lactisN3900/pNZS-XYNB。分泌表達黑曲霉木聚糖酶B的食品級重組乳酸乳球菌構(gòu)建成功。3、木聚糖酶B基因在重組乳酸乳球菌中的誘導(dǎo)表達將L.lactisN3900/pNZS_XYNB陽性重組菌和L.lactisN3900/pNZS空載對照分別按體積比1100比例接種于GM17液體培養(yǎng)基中，30°C過夜培養(yǎng)，取過夜培養(yǎng)物按體積比150進行擴增培養(yǎng)于100ml培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至0D_為0.3到0.5之間時，按10ngNisin/lml培養(yǎng)基的量加入Nisin進行誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時。終止培養(yǎng)后培養(yǎng)物經(jīng)4°C、lOOOOrpm、離心lOmin，分別收集培養(yǎng)物上清和菌體，上清培養(yǎng)基又經(jīng)過0.22ym醋酸纖維素濾膜過濾除菌備用，而菌體洗滌兩次后重懸于0.1MpH5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，用超聲波(功率800W，破碎3S，間歇9S，周期15min，破碎體積為50ml)破碎，破碎物同樣4°C、10000rpm、離心lOmin，收集上清和沉淀。分別取培養(yǎng)物上清、菌體破碎物上清和菌體破碎后沉淀進行酶活檢測。木聚糖酶活性檢測采用DNS法(3，5-二硝基水楊酸比色定糖法)。木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，按表1，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)木糖使用溶液、緩沖液和DNS試劑于各管中(每管號平平行3個樣)，混勻。將標(biāo)準(zhǔn)管同時置于沸水浴中，反應(yīng)7min，取出，迅速冷卻至室溫，準(zhǔn)確加入蒸餾水10ml，混勻。用IOmm比色杯，以空白管(0號管)調(diào)儀器零點，在分光光度計波長550nm處測吸光度，結(jié)果如表2，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(圖15)。以木糖量為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程。線性回歸系數(shù)(r)應(yīng)在0.990以上。對每個新配制的DNS溶液制作新的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1.木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2.標(biāo)準(zhǔn)曲線OD55tlIim出吸光值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1)酶活的定義每分鐘每毫升酶液分解木聚糖生成1Pmol還原糖所需酶量為1個酶活性單位(IU)。2)酶活的計算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中，mf-樣品木糖量(mg);m2_對照品木糖量(mg)；M-木糖摩爾質(zhì)量(150)；T-酶液反應(yīng)時間(min)；V-參與反應(yīng)酶液體積(ml)；N--稀釋倍數(shù)；將上述處理獲得的樣品用0.1MpH5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋10倍，菌體破碎后上清不稀釋，取1ml與用0.1MpH5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配成的的木聚糖溶液0.5mr混合，40°C反應(yīng)15min，加入3mLDNS試劑，煮沸l(wèi)Omin，以100°C煮沸的酶液為空白對照，反應(yīng)結(jié)束用蒸餾水定容至10mL，測550nm光吸收，平行做三組。根據(jù)木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各部分的酶活和木聚糖酶B的分泌率，結(jié)果見表3。表3.重組菌株不同組分酶活和分泌率統(tǒng)計表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表3可知，重組菌株L.lactisN3900/pNZS_XYNB可以表達有活性的黑曲霉木聚糖酶B，并且可以將其分泌到基質(zhì)中，分泌率可達總酶活的47.94%，雖然L.lactisN3900/pNZS-XYNB菌株的產(chǎn)木聚糖酶的活性比其原始菌株黑曲霉低，但是使黑曲霉木聚糖酶B在乳酸乳球菌中表達是首次，同時宿主菌L.lactisN3900和載體均符合食品安全要求，因此L.lactisN3900/pNZS-XYNB菌株仍具有重要的實際應(yīng)用價值和很好的應(yīng)用前景，特別是在飼料添加劑行業(yè)的應(yīng)用，可以直接作為口服飼料添加劑，補充木聚糖酶的同時宿主菌還可以產(chǎn)生有益因子。權(quán)利要求一種可表達分泌型黑曲霉木聚糖酶B的食品級重組乳酸乳球菌，其特征在于菌株中含有表達載體pNZS-XYNB，所述的表達載體pNZS-XYNB是在載體pNZ8149中加入了以下元件乳酸乳球菌MG1363的Usp45信號肽基因SPusp45序列；黑曲霉木聚糖酶B的成熟肽編碼序列XYNB。2.權(quán)利要求1所述食品級重組乳酸乳球菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟1)將乳酸乳球菌MG1363的Usp45信號肽基因SPusp45序列克隆到表達載體pNZ8149的啟動子PnisA下游；2)利用特異性引物通過PCR方法刪除啟動子序列和信號肽基因序列間的Ncol酶切位點，將SPusp45融合到PnisA下游，構(gòu)建的載體pNZS；3)將黑曲霉木聚糖酶B基因(XYNB)克隆到分泌表達載體pNZS的多克隆位點中，構(gòu)建了可表達分泌型黑曲霉木聚糖酶B的載體pNZS-XYNB，將pNZS-XYNB載體利用電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入受體菌L.lactisN3900，通過篩選培養(yǎng)獲得分泌表達黑曲霉木聚糖酶B的食品級重組乳酸乳球菌。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征在于SPusp45序列的引物為5'端引物P15'GGGCCATGGATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTC3'3'端引物P2:5'TATGCATGCAGCGTAAACACCTGACAACGGGGCTGCAGCAGAAAGTATCACTGTAGACA3'改造載體刪除Ncol酶切位點用引物為5'端引物P2:5'ATGAAAAAAAAGATTATCTCAGC3'3'端引物P3:5'GGTGAGTGCCTCCTTATAAT3'。全文摘要本發(fā)明公開一種可分泌表達黑曲霉木聚糖酶的食品級重組乳酸乳球菌及制法，菌株中含有表達載體pNZS-XYNB，所述的表達載體pNZS-XYNB是在載體pNZ8149中加入了以下元件乳酸乳球菌MG1363的Usp45信號肽基因SPusp45序列；黑曲霉木聚糖酶B的成熟肽編碼序列XYNB。本發(fā)明擴增出已知的黑曲霉木聚糖酶基因的成熟肽編碼序列，將其與載體pNZS進行連接，通過電轉(zhuǎn)化進入宿主菌乳酸乳球菌NZ3900細(xì)胞中，在nisin的誘導(dǎo)下進行表達，經(jīng)SDS-PAGE分析和酶活檢測證明，本發(fā)明克隆的黑曲霉木聚糖酶基因在工程菌中可以分泌表達，具有降解木聚糖的活性。文檔編號C12N9/42GK101805718SQ20101014105公開日2010年8月18日申請日期2010年3月31日優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日發(fā)明者付永平,曲靜,王丕武,馬建,馬超申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)