專利名稱：表達(dá)prrsv免疫原基因的重組桿狀病毒及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)PRRSV免疫原基因的重組桿狀病毒及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
PRRS(豬繁殖與呼吸綜合癥)是由PRRSV(豬繁殖與呼吸綜合癥病毒)引起的豬的 烈性傳染病之一。被國(guó)際獸醫(yī)局列為B類動(dòng)物傳染病，主要引起母豬繁殖障礙(如流產(chǎn)、早 產(chǎn)、死胎、木乃伊胎)和仔豬呼吸道癥狀。 目前世界上發(fā)生的PRRS有兩個(gè)血清型歐洲型和美洲型。到目前為止我國(guó)流行的 只有美洲型。由于PRRS主要是引起母豬的繁殖障礙，從而給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì) 損失。 PRRSV屬于動(dòng)脈炎病毒科、動(dòng)脈炎病毒屬，是不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒?；?組長(zhǎng)約15Kb，具有感染性，含有8個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)。其中0RF3和0RF5是主要的結(jié)構(gòu)蛋 白基因，編碼的糖蛋白GP3和GP5是PRRSV主要的免疫原。既可誘導(dǎo)體液免疫，又可誘導(dǎo)細(xì) 胞免疫。 PRRSV是目前嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一種重要的病毒，目前對(duì)PRRS疾病的控制尚 無(wú)切實(shí)有效的方法，防制PRRS的疫苗主要有滅活苗和弱毒苗，但由于免疫原性和安全性等 方面的問(wèn)題受到限制。因此發(fā)展新型疫苗來(lái)控制PRRSV已是當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種重組桿狀病毒及可作為預(yù)防PRRS感染的亞 單位疫苗。 本發(fā)明提供的表達(dá)PRRSV免疫原基因的重組桿狀病毒，帶有SEQ ID NO. 1所示的
序列。所述重組桿狀病毒表面展示PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白GP5。 本發(fā)明提供一種上述的重組桿狀病毒的制備方法，步驟包括 a、制備0RF5基因。制備方法為用PCR方法擴(kuò)增了 PRRSV陜西株0RF5基因，并將
其克隆到pMD18-T載體，構(gòu)建了 pMD18T-0RF5質(zhì)粒； b、將PRRSV的0RF5基因，插入到桿狀病毒表面展示轉(zhuǎn)座載體pBacSC的p10啟動(dòng)
子下游，構(gòu)建含PRRSV的0RF5基因的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-0RF5 ; c、將上述重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-0RF5轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行同源重組，獲
得重組桿狀病毒基因組DNA。作為優(yōu)選，所述大腸桿菌為感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac。 d、將步驟c得到的重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，得到重組桿狀病毒。優(yōu)選地，
將重組桿狀病毒DNA通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)入昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9中，包裝出重組桿狀病毒。 本發(fā)明提供一種上述的重組桿狀病毒在制備豬繁殖與呼吸綜合癥病毒疫苗中的應(yīng)用。 本發(fā)明提供一種制備豬繁殖與呼吸綜合癥病毒亞單位疫苗的方法重組病毒接種 昆蟲(chóng)細(xì)胞，培養(yǎng)48 72h，收取感染細(xì)胞，-40°C /37t:凍融，離心，取上清測(cè)定病毒PFU，調(diào)整病毒的滴度使其達(dá)到109PFU/ml。上述昆蟲(chóng)細(xì)胞優(yōu)選Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果為 1 、本發(fā)明得到的重組桿狀病毒BacSC-GP5可表面展示PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白GP5，直接經(jīng) 過(guò)超速離心得到桿狀病毒的同時(shí)也就得到了目的蛋白，可以避免現(xiàn)有技術(shù)中表達(dá)系統(tǒng)(包 括傳統(tǒng)的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng))表達(dá)目的蛋白分離純化的繁瑣過(guò)程。而，現(xiàn)有技術(shù)的表達(dá)系 統(tǒng)中表達(dá)的目的蛋白是分泌到Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)基中，需要通過(guò)蛋白純化系統(tǒng)來(lái)純化目的蛋 白，這樣費(fèi)時(shí)費(fèi)力，代價(jià)昂貴，不能大規(guī)模應(yīng)用于目的蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)，這也是目前蛋白 表達(dá)最令人頭疼的地方。 2、轉(zhuǎn)座載體中添加eGFP基因，可以通過(guò)熒光顯微鏡直接觀察熒光的有無(wú)來(lái)檢測(cè) 重組病毒的產(chǎn)生情況，大大簡(jiǎn)化病毒滴度的測(cè)定。 3、該重組桿狀病毒表面展示的蛋白可與PRRSV抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。 4、本發(fā)明得到的一株重組桿狀病毒BacSC-GP5可剌激小鼠產(chǎn)生有效的體液免疫
和細(xì)胞免疫。 5、本發(fā)明得到的一株重組桿狀病毒BacSC-GP5對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是安全的，無(wú)任何病理 現(xiàn)象出現(xiàn)。 6、本發(fā)明得到的一株重組桿狀病毒具有很好的遺傳穩(wěn)定性，經(jīng)多次傳代后外源基 因不丟失。 7、本發(fā)明所使用的目的基因?yàn)镻RRSV(美洲株，自陜西分離)國(guó)內(nèi)分離株，從而構(gòu) 建的重組桿狀病毒可作為我國(guó)預(yù)防PRRS的亞單位疫苗。


圖1是重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-0RF5構(gòu)建流程圖。 圖2是重組病毒BacSC-GP5感染Sf9細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)。 圖3是共軛聚焦顯微鏡分析重組桿狀病毒BacSC-GP5的GP5蛋白在Sf9細(xì)胞膜上
的展示。 圖4是重組桿狀病毒BacSC-GP5的GP5蛋白的Western blot分析。 圖5是免疫電鏡分析GP5蛋白在重組桿狀病毒BacSC-GP5囊膜上的展示。 圖5中標(biāo)號(hào)說(shuō)明A.重組桿狀病毒BacSC-GP5 ;B.陰性對(duì)照組，重組桿狀病毒
BacSC。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以 更好的理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
本發(fā)明用PCR方法擴(kuò)增了PRRSV陜西株0RF5基因(具體序列見(jiàn)SEQ IDNO. 1)，并將 其克隆到pMD18-T載體，構(gòu)建了 pMD18T-0RF5質(zhì)粒。酶切pMD18T-0RF5質(zhì)粒，回收0RF5基因。 將回收的0RF5插入到桿狀病毒表面展示轉(zhuǎn)座載體pBacSC的p10啟動(dòng)子下游，構(gòu)建含PRRSV 的0RF5的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-0RF5 ;將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入桿狀病毒/昆蟲(chóng)表 達(dá)系統(tǒng)感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac內(nèi)，使其進(jìn)行同源重組，并用卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素 進(jìn)行抗性篩選。重組病毒分別經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、免疫蛋白印記(westernblot)、激
4光共聚焦顯微鏡和免疫電子顯微鏡試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，篩選獲得陽(yáng)性重組桿狀病毒；將篩選的 陽(yáng)性重組桿狀病毒分別免疫BALB/c小鼠和豬并進(jìn)行了免疫學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)。
pBacSC載體的構(gòu)建過(guò)程
1. 1引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)發(fā)表的桿狀病毒AcMNPV(GenBank :AY542374)的gp64基因組序列和綠色熒光 蛋白(eGFP)基因(GenBank :EU048697)基因組序列，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物(Pl/P2、 P3/P4、 P5/P6)。
CACAAGCAAGATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTG-3' ，5'端加上Smal酶切位點(diǎn)；下游引
CGCGCCCATGGGCTAGCGCATGCGCATGC-3'。上游引物P3 5' -GCGCGCCCATCGCATGCTTCAGGGCT AGTGTTTGGTCATGTA-3';下游引物P45' -CCC GGTACCTTAATATTGTCTATTAC-3' ，5'端加上 Kpn I酶切位點(diǎn)。預(yù)期擴(kuò)增片斷為267bp，含有GP64信號(hào)肽(SP)序列，6個(gè)組氨酸(His6) 標(biāo)簽，4個(gè)多克隆位點(diǎn)(Bsshl、 Ncol、 Nhel、 Sphl) ， GP64跨膜區(qū)(TM)和GP64胞質(zhì)區(qū)(CTD)基因。 上游引物P55' -GCTGGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3' 5'端加上BamHI 酶切位點(diǎn)。下游引物P65 ' -AAGCTTCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA-3 ' ， 5 '端加上 HindIII酶切位點(diǎn)。預(yù)期擴(kuò)增片斷為717bp，含有完整的綠色熒光蛋白基因(eGFP)基因。
1. 2SP-His6-四個(gè)酶切位點(diǎn)-TM-CTD序列(具體序列見(jiàn)SEQ IDNO. 2)的擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系如下10XPCR Buffer 5 ii L、 dNTPs 4 ii L、 Pl/P2， P3/P4各1 ii L、 Taq DNA多聚酶1 ii L、加水至50ii L。反應(yīng)程序95 。C變性5min ;94。C lmin， 56 。C lmin， 72°C 30sec，共30個(gè)循環(huán)；最后72"延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取10 y L PCR產(chǎn)物加入lyL 6XLoading Buffer于0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，分析擴(kuò)增產(chǎn)物。
1. 3eGFP基因的擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系如下10 X PCR Buffer 5 ii L、 dNTPs 4 ii L、 P5/P6各1 ii L、 TaqDNA多 聚酶1 y L、pEGFP-Cl質(zhì)粒(BD Biosciences Clontech) 1 ii L、加水至50 ii L。反應(yīng)程序95。C 變性5min ;94。C lmin，56。C lmin，72。C 2min，共30個(gè)循環(huán);最后72"C延伸10min。反應(yīng)結(jié)束 后取10 ii L PCR產(chǎn)物加入1 y L 6 X Loading Buffer于0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，分析擴(kuò)增產(chǎn) 物。 1. 4PCR產(chǎn)物與pFastBacTM Dual載體的連接 參照上海生工UNIQ-10膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收目的基因。將eGFP基因插入載
體pFastBacTM Dual (Life Technologies)的Polyhedrin啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)(MCS)
的BamHI和HindIII酶切位點(diǎn)處。同樣方法將SP_His6_四個(gè)酶切位點(diǎn)-TM-CTD基因插入
到已經(jīng)插入了 eGFP基因的pFastBacTM Du al載體的另外一個(gè)p10啟動(dòng)子下游多克隆位點(diǎn)
(MCS)的Smal和Kpnl酶切位點(diǎn)處，從而構(gòu)建成功pBacSC載體。具體的操作方法、參數(shù)都是
按照分子生物學(xué)常規(guī)方法進(jìn)行。 下面敘述本發(fā)明的具體實(shí)施方法 1. PRRSV陜西株0RF5基因的克隆 1. 1引物的設(shè)計(jì)
根據(jù)發(fā)表的PRRSV CH-la株(GenBank :AY032626)的基因組序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性 引物(P1/P2)。上游引物Pl 5' -GCTCTCGAGAGCAACAACAGCAG-3' 5'端加上EcoR I酶切 位點(diǎn)。下游引物P2 5' -GATCTGCAGGAGACGACCCCATTGTT-3' ，5'端加上Xho I酶切位點(diǎn)。 預(yù)期擴(kuò)增片斷為507bp，含有去掉信號(hào)肽基因的完整0RF5基因。
1. 2病毒基因組的提取 取出-80°C保存的PRRSV陜西分離株細(xì)胞毒，按照Trizo 1提取試劑盒提取病 毒RNA。取RNA作模板3 ii L，加入0RF5下游引物P2 1 ii L、 dNTP 4 ii L、 RNase-Inhibitor 0. 5iiL、AMV 0. 5iiL、5XAMV Buffer 4iiL，力口DEPC H20至20 ii L， 42°C lh，即得cDNA模板；
PCR反應(yīng)體系如下10XPCR Buffer 5 ii L、 dNTPs 4 ii L、 Pl/P2各1 ii L、 TaqDNA 多聚酶1 y L、 cDNA 6 ii L、加水至50 ii L。反應(yīng)程序95。C變性5min ;94。C lmin， 56°C lmin， 72°C lmin，共30個(gè)循環(huán)；最后72t:延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取10 y L PCR產(chǎn)物加入lyL 6XLoading Buffer于0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，分析擴(kuò)增產(chǎn)物。
1. 3PCR產(chǎn)物的純化與回收 參照上海生工UNIQ-10膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收目的基因。
2.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法) 以無(wú)菌接種環(huán)刮取凍存于-7(TC冰箱的大腸桿菌菌種，劃線接種于不含氨芐青霉 素(Amp)的LB瓊脂平板，37t:培養(yǎng)16h左右。挑取單一菌落，接種到100mlLB培養(yǎng)基中， 37°C、250r/min振搖培養(yǎng)到0D600 = 0. 4 0. 6，在無(wú)菌條件下將細(xì)菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到兩個(gè)無(wú) 菌并以冰預(yù)冷的聚丙烯離心管中(以下操作均需無(wú)菌)，冰浴10min，使培養(yǎng)物冷卻到0°C ; 4。C、2000r/min離心10min，棄上清，以10ml用冰預(yù)冷的75mmol/L CaCl2、 10mmol/L (p朋.5) 溶液重懸沉淀，冰浴10min，4°C，2000r/min離心10min，棄上清，以2ml用冰預(yù)冷的，含15% v/v、)甘油的75mmol/L CaCl2、 10mmol/L Tris *C1 (p朋.5)溶液重懸每管沉淀，用無(wú)菌吸頭 將感受態(tài)細(xì)胞分裝于無(wú)菌微量離心管中，每管200 ii 1 ;標(biāo)明菌株、體積和日期，置-7(rc冰 箱凍存?zhèn)溆谩?3. 0RF5基因片段與pMD18-T載體的連接反應(yīng)取0. 5 ii g pMD18-T載體，力n 3 5倍摩爾量的0RF5DNA片段，2 yl 5 X連接緩沖 液加水定容至10iil，最后加入1Weiss單位T4DNA連接酶，混勻并離心，16。C連接1 4h， 取7 iil連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化上述E co. li感受態(tài)細(xì)胞。
4.轉(zhuǎn)化 將適量連接產(chǎn)物DNA(體積質(zhì)粒< 1 y 1，連接產(chǎn)物< lOiU， DNA < 50ng)加入 200 iil上述感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min ;42。C水浴熱沖擊90s，冰浴冷卻2min ; 加入200ii1 37t:預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，37t: 150r/min振搖培養(yǎng)50min ;取培養(yǎng)液涂布于含 Amp (50 ii g/ml)的LB瓊脂平板，37。C培養(yǎng)14h 16h后，得到轉(zhuǎn)化菌落。
5.質(zhì)粒的提取(堿裂解法) 挑取單個(gè)上述轉(zhuǎn)化菌落，接種到2ml含50 ii g/ml Amp的LB培養(yǎng)液(下同)中， 37°C 250r/min振搖培養(yǎng)12 16h ;將1. 5ml轉(zhuǎn)入微量離心管中，12000r/min離心30s，棄 上清。以200 ii 1冰預(yù)冷的溶液I (50rnmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris Cl， pH8. 0 ;10mmo1/ L EDTA，pH8. 0)重懸沉淀，加入200 新配制的溶液II (0. 2mol/LNaOH， 1 % SDS)，顛倒數(shù)次 混勻，加入200 ii 1用冰預(yù)冷的溶液III (3mol KAc， 5mol/L冰乙酸)，顛倒混勻，4°C 12000r/min離心10min，取上清，分別用等量飽和酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)，氯仿/異戊醇 (24 : 1)各抽提一次；加2倍體積冷無(wú)水乙醇，混合均勻，置-20°C 30min，4。C 12000r/min 離心10min，棄上清，沉淀用70%冷乙醇洗滌抽干。以20 含終濃度20 y g/ml RNA酶(無(wú) DNA酶)的TE(10mmol/L Tri s HCl， pH8. 0， lmmol/LEDTA， pH8.0，下同)溶解沉淀，并于 37t:水浴中作用30min，瓊脂糖凝膠電泳檢查或-2(TC保存。
6.重組質(zhì)粒pMD18T-0RF5的酶切鑒定 將1. 0 ii g質(zhì)粒DNA與適量水混勻，使其總體積為18 ill ，分別加入2 3單位EcoR I和Xho I限制性內(nèi)切酶及l(fā)iU相應(yīng)的10X限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，輕彈管壁混勻并離 心，置最適反應(yīng)溫度水浴2 3h，瓊脂糖凝膠電泳檢查。酶切結(jié)果均與預(yù)計(jì)完全相同者，即 為目的重組質(zhì)粒。完全酶切后，_201:保存，以備進(jìn)一步鑒定或回收片段之用。
7.攜帶PRRSV 0RF5基因重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體質(zhì)粒的構(gòu)建 用Xhol和EcoRI雙酶切pMD18T-0RF5質(zhì)粒，回收0RF5基因，將其插入到同樣經(jīng)過(guò) Xhol和EcoRI雙酶切的桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pBacSC，進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建含有0RF5基因的桿 狀病毒轉(zhuǎn)座載體pBacSC-0RF5。具體試驗(yàn)操作過(guò)程與pMD18T-0RF5重組質(zhì)粒構(gòu)建相同。
8.同源重組
8. 1制備"三抗"LB平板 將高壓蒸汽滅菌后的LB液體培養(yǎng)基(含1.5%瓊脂粉)置超凈臺(tái)內(nèi)，待其溫度 冷卻至5(TC左右時(shí)加入以下三種抗生素至終濃度為卡那霉素(Kan)50iig/mL、慶大霉素 (Gm) 7 ii g/ml和四環(huán)素(Tet) 10 y g/ml，并加入X-gal (終濃度為150 y g/mL和IPTG(終濃 度為40ii g/mL)混勻后立即鋪制平板。
8. 2轉(zhuǎn)化過(guò)程 取重組質(zhì)粒pBacSC-0RF510 y L (4 ii g)加入100mL制備好的感受態(tài)大腸桿菌 DH10Bac管內(nèi)，輕輕混勻，將離心管放入冰水混合物中冰浴30min，將離心管放入42。C熱休 克2min，再迅速移至冰水中放置5min。加入滅菌的LB液體培養(yǎng)基900mL， 37。C搖床200rpm/ min振蕩培養(yǎng)lh，加入卡那霉素(終濃度為50 ii g/mL)、慶大霉素(終濃度為7 y g/ml)后 繼續(xù)搖床200rpm/min振蕩培養(yǎng)4h。 6000rpm/min離心10min，保留細(xì)菌沉淀及LB液體 約300iiL，用新鮮的LB液體培養(yǎng)基將其以10—、10—2和10—3不同的稀釋度稀釋。然后各取 100 ii L分別均勻涂布于"三抗"LB平板，將平皿于37t:倒置培養(yǎng)24 48h，觀察藍(lán)白菌落 的生長(zhǎng)情況。
8. 3白斑鑒定 用滅菌的牙簽挑取5 10個(gè)分隔良好的白色菌落，再次接種于含"三抗"的平 板上，37t:倒置培養(yǎng)24h，觀察菌落表型的變化，進(jìn)一步證實(shí)為白色菌落。再用滅菌牙簽挑 取6個(gè)白色菌落和2個(gè)藍(lán)色菌落，分別放入裝有6ml LB培養(yǎng)基的試管中，再加入卡那霉素 (Kan)50ii g/mL、慶大霉素(Gm) 7 y g/ml和四環(huán)素(Tet) 10 y g/ml，三種抗生素，37。C搖床 200rpm/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
8. 4重組桿狀病毒DNA的提取與制備 將上述培養(yǎng)菌液分裝至1. 5mL的Eppendorf管中，12000rpm/min離心lmin。棄凈 上清，加入300ii L溶液I(50mmol/L Tris-HCL pH8. 0， 1Ommol/L EDTA，滅菌備用)，重懸沉 淀。加入300iiL溶液I1(0. 2mol/L NaOH，l% SDS)，溫和顛倒混勻，置冰水浴中5min，使細(xì)菌裂解。緩慢逐滴加入300ii L溶液III(5mol/L乙酸鉀60ml，冰乙酸11. 5ml，水28. 5ml， pH5. 5)，加入過(guò)程中輕微搖動(dòng)，置于冰上10min。 12000r/min離心10min，同時(shí)標(biāo)好另一干 凈的E卯endorf管，加入800 y L異丙醇。輕輕將上清轉(zhuǎn)移至已加好異丙醇的新管中，注意 不要吸入蛋白沉淀，將離心管顛倒數(shù)次混勻，置于室溫15min， 12000r/min離心lOmin，棄上 清。分別用75%和100X的乙醇各洗滌一次，14000r/min離心5min，棄上清，風(fēng)干(無(wú)菌條 件下)lh，溶于40 ii L TE緩沖液。
9.重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞 在6孔板中每個(gè)孔中加入Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞9X105 cells,培養(yǎng)基用2mL Sf900 IISFM， 含有雙抗?jié)舛葹?.5X終濃度(50units/ml penicillin, 50 u g/ml str印tomycin)。細(xì)胞 來(lái)自培養(yǎng)3 4天的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的，活力大于97X細(xì)胞，并置于27t:培養(yǎng)箱中l(wèi)h;在 這lh中準(zhǔn)備下列實(shí)驗(yàn)。取2支1. 5ml E卯endorf管標(biāo)為A、 B，分別加入100 y L無(wú)抗生素 的Sf90011 SFM培養(yǎng)液，A管中加入5iiL的上述重組桿狀病毒DNA，混勻。B管中加入6iiL 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin，混勻(注意脂質(zhì)體是一個(gè)油脂的懸浮物，可能會(huì)沉淀，使用前 顛倒管子5 10次，將其混均勻)?；旌螦管和B管，輕輕混勻，置室溫45min，使其形成 Cellfectin-DNA混合物。取已經(jīng)貼壁生長(zhǎng)良好的Sf9單層細(xì)胞，棄舊培養(yǎng)液，用無(wú)抗生素 的Sf90011 SFM培養(yǎng)液洗滌1遍。取上述Cellfectin-DNA混合物，加入O. 8ml不含抗生素 的Sf90011 SFM混合均勻。從細(xì)胞中吸棄清洗用的培養(yǎng)基，將混合均勻的脂質(zhì)體和重組DNA 混合物鋪到細(xì)胞上，覆蓋細(xì)胞，放置28t:培養(yǎng)6h后。吸棄混合物，加入含抗生素的Sf90011 SFM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。收集細(xì)胞用于表達(dá)蛋白的分析，同時(shí)收集培 養(yǎng)上清作為原毒種，分小管貯存于-201:，用于重新感染Sf9細(xì)胞。
10.重組桿狀病毒BacSC-GP5的PCR鑒定 取病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物2mL，反復(fù)凍融3次，12000r/min離心15min，取上清 437. 5ii L，加入12. 5ii L蛋白酶K(20mg/mL)和50 ii L SDS液(10% ) ，37。C水浴30min ;等 體積酚/氯仿抽提一次，取上清；等體積氯仿復(fù)提，取上清；加入l/10體積NaAc(2mol/L)和 2倍體積無(wú)水乙醇，-20。C放置2h ;4。C 15000r/min離心15min，取沉淀；70%乙醇洗滌一次， 沉淀用30iiL TE溶液溶解，即為提取的DNA，-70。C保存?zhèn)溆?。PCR時(shí)取5yL即可。PCR反 應(yīng)條件為95。C預(yù)變性5min后，按95。C變性lmin，54。C退火lmin，72。C延伸2min共30個(gè)循 環(huán)，最后72t:延伸10min。
11.重組桿狀病毒量的放大與濃縮 懸浮培養(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞待細(xì)胞濃度達(dá)1X106 cell/ml，以MOI = 1 (Multiplicity ofinfection，MOI)的重組桿狀病毒量感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，利用病毒會(huì)在宿主昆蟲(chóng)細(xì)胞中復(fù)制達(dá) 到病毒量放大的目的。感染3 4天后離心除去細(xì)胞及細(xì)胞碎片，收集上清液即完成病毒 量的放大。 12.重組病毒表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)
12. 1熒光顯微鏡觀察鑒定重組病毒 重組pBacSC-0RF5轉(zhuǎn)座載體上帶有eGFP基因，可以表達(dá)綠色熒光蛋白，可以通過(guò) 熒光顯微鏡觀察發(fā)出熒光的細(xì)胞數(shù)量來(lái)確認(rèn)轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48h后細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的 CPE變化，轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)熒光(見(jiàn)附圖2)，產(chǎn)生了具有感染活性的重組桿狀病毒BacSC-GP5。
12. 2SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
8
將擴(kuò)增后的純化重組病毒BacSC-GP5，以10M0I分別接種于10ml培養(yǎng)瓶1 X 106個(gè) /ml Sf9細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)桿狀病毒陰性對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照，至75%細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)，棄 培養(yǎng)液，用lml的TEN(40mmol/L Tris *C1 pH7. 5， lmmol/L EDTA， 150,1/L NaCl)洗脫細(xì) 胞，收集于E卯endorf管中，3000r/min離心5min，棄上清，細(xì)胞沉淀用PBS洗3次，加60 裂解緩沖液(lOmmol/LTris 'Cl，pH7. 4， lmmol/L MgCl2，0. 5% NP40， 20 ii g/ml DNase I)裂 解，冰浴30min，煮沸3min， 5000r/min離心5min， -20。C凍存。 取30iil細(xì)胞裂解液與等量2X樣品緩沖液(100mmol/L Tris Cl，p朋.8，4% SDS， 0. 2 %溴酚藍(lán)，20 %甘油，使用前加入2. 5 % 13 -巰基乙醇)混勻，于10 %凝膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。 12. 3免疫印跡(Western blot) 經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白后，將其電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂乳或3%牛 血清白蛋白緩沖液(10mmol/L Tri s Cl， pH7. 5， 150,1/L NaCl， 0. 05% Tween20) 37°C 封閉2h，洗滌緩沖液(lOmmol/L Tris Cl pH7. 5， 150mmol/LNaCl，0. 05% Tween20)洗滌 3次，每次5 10min，將豬抗PRRSV陽(yáng)性血清用封閉緩沖液稀釋(1 : 300)覆蓋膜上，室 溫感作2h，洗滌3 5次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬IgG(1 : 4000)室溫感作2h，洗 滌3 5次后，每次5 10min，最后用蒸餾水清洗一次，夾出硝酸纖維素膜稍晾干，配制 ECL(enhancedchemiluminescence)工作液，在可見(jiàn)光下室溫孵育膜數(shù)分鐘，將印跡膜用保 鮮膜包被粘貼固定于X光片曝光暗盒。然后轉(zhuǎn)入暗室將X光膠片壓在膜上曝光數(shù)秒到數(shù)分 鐘，顯影定影后蛋白質(zhì)條帶可清晰顯示在X光膠片上。
12. 4激光共軛聚焦顯微鏡分析 在6孔培養(yǎng)板中放入無(wú)菌載玻片，Sf9細(xì)胞先接種于無(wú)菌之載玻片上，細(xì)胞接入量 為每孔加入1 X 106。細(xì)胞吸附lh后，吸棄培養(yǎng)基，加入重組桿狀病毒BacSC-GP5在MOI = IO下感染。2天后吸棄培養(yǎng)基，再添加lml甲醇丙酮(1 : 1)混合液于-2(TC冰箱下固定 5分鐘，之后再加入lml PBS(phosphate-bufferedsaline)搖床轉(zhuǎn)速50r/min清洗2次，每 次5min。接著以lml的2% BSA(bovinese進(jìn)26 albumin)在37。C下反應(yīng)30min。之后再 加入lmlPBS(phosphate-buffered saline)搖床轉(zhuǎn)速50r/min清洗2次，每次5min。接下 來(lái)分別加入豬抗PRRSV陽(yáng)性血清(1 : 100)在37t:下反應(yīng)lh。以lml的PBS清洗3次后， 再加入FITC標(biāo)記的羊抗豬IgG(l : 100)37t:下反應(yīng)lh。最后再以lml的PBS清洗3次。 在激光共軛焦顯微鏡(confocal microscope, TCS SP2， Leica， Germany)下觀察，帶有GP5 重組蛋白質(zhì)細(xì)胞膜會(huì)被FITC染色而呈現(xiàn)綠色熒光。
12. 5免疫電子顯微鏡檢測(cè) 取15iU純化的昆蟲(chóng)桿狀病毒液滴于蠟板上，將封有炭膜的銅網(wǎng)有炭膜的一面向 下懸浮在昆蟲(chóng)桿狀病毒液面上，吸附30min。滴入含有1 % BSA的PBS液1滴于蠟板上，將 銅網(wǎng)有炭膜的一面輕浮于液滴上室溫封阻20min，然后用PBS液洗滌3次，每次5min。洗滌 的方法和封阻的方法相同，用濾紙?jiān)诰W(wǎng)緣將水吸干。將銅網(wǎng)分別浮于豬抗PRRSV陽(yáng)性血清 (1 : 50)液滴上(大約15iU)，室溫30 60min.同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，不加第一抗體，用 PBS代替。PBS漂洗洗3次，每次5min，濾紙吸干。將銅網(wǎng)懸浮于膠體金標(biāo)記的羊抗豬IgG 第二抗體液滴上(1 : 50倍稀釋)，室溫孵育30 60min。 PBS漂洗洗3次，每次5min，濾 紙吸干。將銅網(wǎng)懸浮在2%的磷鴇酸液滴上負(fù)染2min，在室溫干燥，電鏡觀察。
13.重組病毒BacSC-GP5表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果 篩選獲得的重組桿狀病毒BacSC-GP5接種Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞后，在感染細(xì)胞的細(xì)胞膜 處，可觀察到特異的一圈黃綠色熒光，說(shuō)明表達(dá)產(chǎn)物是特異的而且表達(dá)產(chǎn)物展示在Sf9昆 蟲(chóng)細(xì)胞的細(xì)胞膜上(見(jiàn)附圖3)。經(jīng)Western blot分析，重組毒接種的細(xì)胞培養(yǎng)物出現(xiàn)了與 豬抗PRRSV陽(yáng)性血清結(jié)合的大小為25kD的特異帶(見(jiàn)附圖4)，證明了 GP5蛋白在Sf9昆蟲(chóng) 細(xì)胞中得到了表達(dá)。重組病毒BacSC-GP5免疫電子顯微鏡檢測(cè)到與豬抗PRRSV陽(yáng)性血清結(jié) 合的金粒子，并且金粒子位置在重組病毒膨大的囊膜蛋白處，表明GP5蛋白被展示在桿狀 病毒的囊膜上(見(jiàn)附圖5)。 14.重組桿狀病毒BacSC-GP5的免疫原性研究
14. 1重組桿狀病毒BacSC-GP5免疫小鼠 重組桿狀病毒BacSC-GP5接種Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，培養(yǎng)48 72h，收取感染細(xì) 胞。-40°C /37t:反復(fù)凍融3次，3000r/min離心10min，取上清測(cè)定病毒PFU，調(diào)整病毒的滴 度使其達(dá)到109PFU/ml。 BALB/c雌性小鼠12只，體重18 20g，隨機(jī)分2組，采取腹腔注射方式，分別注射 重組桿狀病毒BacSC-GP5和不含0RF5基因的桿狀病毒BacSCO. 5ml。上述2組均免疫二次， 間隔14天，最后一次免疫后的第14天摘眼球取血，頸椎脫臼處死，凝血分離血清供ELISA 檢測(cè)抗PRRSV抗原的IgG抗體以及進(jìn)行中和試驗(yàn)檢測(cè)免疫小鼠的血清中和抗體滴度。無(wú)菌 取其脾臟分別進(jìn)行T淋巴細(xì)胞增值試驗(yàn)和用流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞類的數(shù)量。
14. 2脾臟免疫學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)
14. 2. 1脾臟單淋巴細(xì)胞懸液制備 頸椎脫臼處死小鼠，無(wú)菌條件下取出脾臟，置于盛有RPMI 1640培養(yǎng)基的平皿中， 用玻片研磨，200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾制成單細(xì)胞懸液，1500r/min，離心5min，棄上清。用Hanks 液離心洗細(xì)胞兩次，重懸于含10% NBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)，調(diào)至2 X 107個(gè)/ml備用。 14. 2. 2脾T淋巴細(xì)胞亞類數(shù)量的檢測(cè) 取脾細(xì)胞懸液0. lml，加5ml PBS， 1500r/min，離心10min，洗細(xì)胞兩次，在0. 5ml PBS細(xì)胞懸浮液中分別加熒光標(biāo)記大鼠抗小鼠CD4+和CD8+單克隆抗體(此抗體用PBS按 1 : 10稀釋)室溫避光放置30min，再加5ml PBS洗一次，1500r/min離心10min，將管底細(xì) 胞用200 iil PBS懸浮，待上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。FACS檢測(cè)10000個(gè)細(xì)胞，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 學(xué)處理。 14. 2. 3T淋巴細(xì)胞增值試驗(yàn) (1)脾細(xì)胞的制備將小鼠捕殺、采血、取脾、研磨、過(guò)濾，最后一次用Hank' s液洗 滌，棄上清，再用含有10%犢牛血清的1640培養(yǎng)液lml重懸脾細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2 X 106 個(gè)/ml。 (2)在96孔板中每孔加入淋巴細(xì)胞懸液100 ii 1，對(duì)應(yīng)孔中分別加入特異性剌激原 ConA(lO ii g/ml) 100 y 1作為陽(yáng)性對(duì)照組、20 y g/ml重組桿狀病毒特異性剌激原100 yl為 試驗(yàn)組以及1640培養(yǎng)基100 ii 1為非剌激抗原孔，不同剌激原重復(fù)3個(gè)孔；以只加200 ii 1 1640培養(yǎng)基無(wú)淋巴細(xì)胞的孔作為本底。 (3)68h后，每孔加入MTT(5mg/ml)20iil，避光培養(yǎng)4h ;每孔吸棄100 yl培養(yǎng)液，再加入匿S0 100iil，10min內(nèi)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀630nm測(cè)定個(gè)孔0D值。 (4)結(jié)果計(jì)算SI =(特異剌激原的平均OD值-本底值)/(非剌激原的平均OD
值_本底值) 14. 3ELISA測(cè)定免疫小鼠血清中抗PRRSV抗體 ELISA試劑盒中的包被抗原為滅活的全病毒，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗 鼠IgG抗體。在酶聯(lián)免疫儀450nm測(cè)量各孔OD值。
14. 4重組病毒在本體動(dòng)物豬的免疫學(xué)研究
同小鼠的免疫學(xué)和檢測(cè)方法。 [ono] 檢測(cè)結(jié)果 獲得的重組桿狀病毒BacSC-GP5提取基因組后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得預(yù)期大小的目的 片段。激光共聚焦顯微鏡觀察試驗(yàn)、免疫金電子顯微鏡觀察和Westernblot檢測(cè)均為陽(yáng)性 結(jié)果，說(shuō)明構(gòu)建的重組桿狀病毒BacSC-GP5可表達(dá)PRRSV糖蛋白GP5囊膜蛋白。重組桿狀 病毒BacSC-GP5可在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)，且BacSC_GP5具有良好的遺傳穩(wěn)定性。將重組桿狀 病毒BacSC-GP5大量擴(kuò)增后進(jìn)行小鼠免疫實(shí)驗(yàn)，可在免疫小鼠血清中檢測(cè)到抗PRRSV的抗 體，表明重組桿狀病毒BacSC-GP5剌激小鼠機(jī)體產(chǎn)生了特異性體液免疫。免疫小鼠脾T細(xì) 胞亞類數(shù)量的檢測(cè)及淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果均顯示小鼠產(chǎn)生了特異性細(xì)胞免疫。
研究結(jié)果表明，本發(fā)明所構(gòu)建的重組桿狀病毒是一種安全、有效的基因工程亞單 位疫苗，具有開(kāi)發(fā)成為用于預(yù)防PRRS的疫苗的良好前景。 以上所述實(shí)施例僅是為充分說(shuō)明本發(fā)明而所舉的較佳的實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范 圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明 的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書(shū)為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種表達(dá)PRRSV免疫原基因的重組桿狀病毒，其特征在于，所述重組桿狀病毒帶有SEQ ID NO.1所示的序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒，其特征在于，所述重組桿狀病毒表面展示 PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白GP5。
3. —種權(quán)利要求1或2所述重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，步驟包括a、 制備0RF5基因；b、 將上述的0RF5基因，插入到桿狀病毒表面展示轉(zhuǎn)座載體pBacSC的p10啟動(dòng)子下游， 構(gòu)建含PRRSV的ORF5基因的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-ORF5 ;c、 將上述重組桿狀病毒轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pBacSC-0RF5轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行同源重組，得重組 桿狀病毒DNA ;d、 將步驟c得到的重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，得到重組桿狀病毒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，所述0RF5基因的制 備方法為用PCR方法擴(kuò)增了 PRRSV陜西株0RF5基因，并將其克隆到pMD18-T載體，構(gòu)建了 pMD18T-0RF5質(zhì)粒，酶切pMD18T-0RF5質(zhì)粒，回收0RF5基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，步驟d所述重組桿狀 病毒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞的方法為將重組桿狀病毒DNA通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)入昆蟲(chóng)細(xì)胞 中。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，步驟c所述大腸桿菌 為感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac。
7. 如權(quán)利要求1或2所述的重組桿狀病毒在制備豬繁殖與呼吸綜合癥病毒疫苗中的應(yīng)用。
8. —種制備豬繁殖與呼吸綜合癥病毒亞單位疫苗的方法，其特征在于，所述重組病毒 接種昆蟲(chóng)細(xì)胞，培養(yǎng)48 72h，收取感染細(xì)胞，_40°C /37t:凍融，離心，取上清測(cè)定病毒PFU， 調(diào)整病毒的滴度使其達(dá)到109PFU/ml。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述昆蟲(chóng)細(xì)胞為Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種表達(dá)PRRSV免疫原基因的重組桿狀病毒及其制備方法和應(yīng)用。具體地說(shuō)涉及一種重組桿狀病毒，所述重組桿狀病毒帶有SEQ ID NO.1所示的序列，其表面展示PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白GP5。利用所述重組病毒接種昆蟲(chóng)細(xì)胞，培養(yǎng)48～72h，收取感染細(xì)胞，-40℃/37℃凍融，離心，取上清測(cè)定病毒PFU，調(diào)整病毒的滴度使其達(dá)到109PFU/ml，制得一種安全、有效的基因工程亞單位疫苗，用于預(yù)防PRRS。
文檔編號(hào)C12N7/01GK101792744SQ20101014080
公開(kāi)日2010年8月4日 申請(qǐng)日期2010年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月7日
發(fā)明者張琪, 童德文, 許信剛 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)