專利名稱：重組桿狀病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種含豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染性 克隆的重組桿狀病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)是豬繁殖與呼吸綜合征，即豬“藍(lán)耳病”病原，于上世紀(jì)八十年代末首先發(fā)現(xiàn) 于美國，九十年代初相繼分離于歐洲和美國。PRRSV屬于套式病毒目(Nidovirales)，與馬 動(dòng)脈炎病毒(Equine arteritis virus, EAV)、猴出血熱病毒(Simian hemorrhagic fever virus, SHFV)禾口 HILSI月兌fiBlit"(Lactate dehydrogenase-elevating virus, LDV) 一起形成動(dòng)脈炎病毒科。根據(jù)病毒的血清學(xué)和遺傳學(xué)特征，將病毒分成兩型，即PRRSV I型(歐洲型，代表株為Lelystad Virus)和PRRSV II型(美洲型，代表株為VR-2332)，兩 株間基因組的同源性約為63%。PRRSV基因組為一單股正義RNA，長約15Kb，有5，端帽狀 結(jié)構(gòu)和3，poly(A)尾，含9個(gè)開放性閱讀框(open reading frames, ORFs)。左端占基因 組總長四分之三的ORF Ia和Ib編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，其余的0RF(2a，2b和3-7)編碼病 毒結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)需要通過不連續(xù)轉(zhuǎn)錄(discontinuous transcription)產(chǎn)生 至少七個(gè)亞基因組mRNA(subgenomic mRNA，sgmRNA)，這與冠狀病毒中結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)機(jī)制 相同。非結(jié)構(gòu)蛋白與病毒基因組的復(fù)制和亞基因組mRNA的轉(zhuǎn)錄相關(guān)。結(jié)構(gòu)蛋白中，GP2a、 GP3、GP4和GP5是4種膜糖蛋白；M蛋白是非糖基化的膜蛋白，N蛋白是核衣殼蛋白，以及新 發(fā)現(xiàn)的E蛋白是由0RF2b編碼的73個(gè)氨基酸的非糖基化。根據(jù)病毒粒子中蛋白的含量，可 將結(jié)構(gòu)蛋白分成主要結(jié)構(gòu)蛋白(包括GP5、N和M蛋白)和次要結(jié)構(gòu)蛋白(包括GP2a、GP3、 GP4和E蛋白)。結(jié)構(gòu)蛋白中，GP5和GP3可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。ItMMi^IiE (Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) 是導(dǎo)致養(yǎng)豬業(yè)損失慘重的一種主要傳染病，世界各國豬場普遍流行。我國自1996年郭寶清 等從豬群中分離出PRRSV以來，各地陸續(xù)報(bào)道存在PRRSV感染，如今我國豬群中的PRRSV感 染率高達(dá)90%。特別是2006年我國華東和南方部分地區(qū)爆發(fā)的“豬高熱綜合征”，導(dǎo)致了 約3000萬頭生豬死亡，沉重打擊了我國養(yǎng)豬業(yè)。調(diào)查認(rèn)為，高致病性PRRSV是其主要致病原 之一。目前，我國預(yù)防PRRS的主要途徑是接種疫苗，商品化的疫苗有CH-Ia株和NVDC-JXA1 株，弱毒活疫苗有CH-IR株和JXAl-R株。由于PRRSV的易感細(xì)胞僅有豬肺泡巨噬細(xì)胞和 MA104及其衍生細(xì)胞系Marc-145。豬肺泡巨噬細(xì)胞為原代細(xì)胞，不易獲得大量細(xì)胞用來生 產(chǎn)疫苗，且質(zhì)量也難以控制。而用于生產(chǎn)疫苗的基質(zhì)細(xì)胞MA104和Marc-145細(xì)胞都為美國 勃林格公司專利所限制。因此，有必要尋找一種新的無需通過MA104細(xì)胞或Marc-145細(xì)胞 的途徑來呈遞或生產(chǎn)PRRSV。病毒反向遺傳技術(shù)的興起極大地促進(jìn)了病毒的研究。現(xiàn)代病毒的研究，已越來越 依賴于病毒的反向遺傳技術(shù)。通過建立病毒的感染性克隆，并在克隆的特定區(qū)域進(jìn)行突變、 缺失、插入及置換等操作，來解析特定基因的功能、突變蛋白對(duì)病毒的影響、尋找病毒的毒力決定因子及作為病毒疫苗的研發(fā)平臺(tái)等。在利用感染性克隆拯救病毒中，體外實(shí)驗(yàn)常用 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生病毒，也有將感染性克隆直接注射入體內(nèi)或通過基因槍或電擊接種體 內(nèi)產(chǎn)生病毒，但效率低，操作繁瑣，難以將感染性克隆作為疫苗推廣使用或在非敏感細(xì)胞上 產(chǎn)生病毒來研究非細(xì)胞培養(yǎng)病原。大的DNA病毒，如禽痘病毒、腺病毒、偽狂犬病毒和桿狀病毒等，常作為異源蛋白 的真核表達(dá)載體，在真核細(xì)胞中表達(dá)功能性蛋白，或作為疫苗載體，在機(jī)體中表達(dá)呈遞異源 蛋白刺激免疫反應(yīng)。但是，到目前為止，還沒有出現(xiàn)含豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感 染性cDNA克隆的重組桿狀病毒的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能有效呈遞感染性PRRSV的重組桿狀病毒， 該重組桿狀病毒包含豬繁殖與呼吸綜合征病毒的感染性克隆，在昆蟲和哺乳細(xì)胞中都能成 功表達(dá)出感染性PRRSV顆粒。此外，還需要提供一種上述重組桿狀病毒的構(gòu)建方法和應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了 一種重組桿狀病毒，該重組桿狀病毒包含編碼豬繁 殖與呼吸綜合征病毒感染性病毒顆粒蛋白的核苷酸序列。優(yōu)選的，所述重組桿狀病毒包含SEQ ID NO. 1所示的豬繁殖與呼吸綜合征病毒全 基因組序列。更優(yōu)選的，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒全基因組序列置于CMV啟動(dòng)子的控 制下，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒全基因組序列的3’末端添加有丁型肝炎病毒的核酶序 列。最優(yōu)選的，所述重組桿狀病毒的保藏號(hào)為CCTCC V201005。桿狀病毒常作為異源蛋白的真核表達(dá)載體，在真核細(xì)胞中表達(dá)功能性蛋白，或作 為疫苗載體，在機(jī)體中表達(dá)呈遞異源蛋白刺激免疫反應(yīng)。由于桿狀病毒不能在哺乳細(xì)胞中 復(fù)制和表達(dá)自身蛋白，因此是一種安全的基因治療載體。優(yōu)選的，本發(fā)明的桿狀病毒是指苜蓿銀紋夜蛾多形核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種包含上述重組桿狀病毒的細(xì)胞。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，包括以下步 驟構(gòu)建含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染性基因序列的供體質(zhì)粒；將所述供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過篩選獲得包含豬繁殖與呼吸綜 合征病毒感染性基因序列、以及桿狀病毒全基因組序列的質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到sf9昆 蟲細(xì)胞中，以獲得重組桿狀病毒。所述重組桿狀病毒中，豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染性基因序列置于桿狀病毒的 核多角體啟動(dòng)子的下游，形成核多角體啟動(dòng)子和CMV啟動(dòng)子串聯(lián)的重組桿狀病毒；豬繁殖 與呼吸綜合征病毒感染性基因序列的3’端位于SV40轉(zhuǎn)錄終止/多腺苷加尾信號(hào)上游。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述重組桿狀病毒在制備預(yù)防或治療豬繁殖 與呼吸綜合征的疫苗中的應(yīng)用。在本發(fā)明的另一方面，還提供了 一種上述重組桿狀病毒用于建立體外病毒培養(yǎng)系
4統(tǒng)的用途。本發(fā)明重組桿狀病毒，利用桿狀病毒的呈遞作用，在昆蟲細(xì)胞、以及PRRSV敏感和 非敏感哺乳細(xì)胞中都能成功表達(dá)出感染性PRRSV顆粒，可用于研制PRRSV疫苗，避免利用哺 乳細(xì)胞作為基質(zhì)細(xì)胞生產(chǎn)疫苗時(shí)的外源污染。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中PRRSV的RT-PCR檢測圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例2陽性重組質(zhì)粒pBacAPS的Sma I酶切鑒定圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例2重組bacmid的SF12-SR683和SF14413-SR15497引物的 PCR鑒定圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例2重組桿狀病毒AcAPRRS的SF12-SR683和SF14413-SR15497 引物的PCR鑒定圖；圖5是本發(fā)明實(shí)施例2AcAPRRS和AcLacZ的生長曲線圖；圖6是本發(fā)明實(shí)施例2中sf9細(xì)胞上抗桿狀病毒GP64單抗(AcVl)、抗PRRSV nsp2 單抗(Anti-nSp2)和抗N蛋白單抗(Anti-N)的染色結(jié)果圖；圖7是本發(fā)明實(shí)施例2PRRSV顆粒的電子顯微鏡圖；圖8是本發(fā)明實(shí)施例2sf9細(xì)胞上清中PRRSV RNA的RT-PCR檢測圖；圖9是本發(fā)明實(shí)施例3Marc_145細(xì)胞上抗N蛋白單抗(anti-N)的染色圖；圖10是本發(fā)明實(shí)施例3Marc_145細(xì)胞上清中PRRSV的RT-PCR檢測圖；圖11是本發(fā)明實(shí)施例3vASM與APRRS的5'末端和3'末端序列的比較分析圖；圖12是本發(fā)明實(shí)施例3vASM和APRRS在Marc_145上的空斑形態(tài)圖；圖13是本發(fā)明實(shí)施例3vASM和APRRS在Marc_145細(xì)胞上的一步生長曲線圖；圖14是本發(fā)明實(shí)施例4BHK-21細(xì)胞和vero細(xì)胞上抗N蛋白單抗染色圖；圖15是本發(fā)明實(shí)施例4AcAPRRS接種BHK-21細(xì)胞和vero細(xì)胞后產(chǎn)生的PRRSV曲 線圖。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物 學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，馬學(xué)軍，舒躍龍的譯.北京 科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行。實(shí)施例IPRRSV感染性克隆pCAPRRS的構(gòu)建根據(jù)GenBank 登錄號(hào)為 GQ330474 的 PRRSV APRRS 全長序列、pCMV_Script 的載體 序列和丁型肝炎病毒(HDV)的核酶序列，設(shè)計(jì)合成8條引物；以一對(duì)引物從pCMV-Script 中擴(kuò)增CMV啟動(dòng)子的序列，并克隆入pBluescript SK(+)中，再以一對(duì)從pAPRRS中擴(kuò)增 PRRSV 5’端片段，并克隆入CMV啟動(dòng)子的下游；以雙酶切將CMV啟動(dòng)子及5’序列片段置換 下pAPRRS中的T7及相應(yīng)5，序列片段；以其余4條引物從pAPRRS中擴(kuò)增PRRSV 3，端片 段，擴(kuò)增獲得的片段在PRRSV 3’末端加有HDV核酶序列，通過酶切將含核酶序列的3’片段 置換下相應(yīng)的片段，獲得的克隆稱為pCAPRRS。以pCAPRRS轉(zhuǎn)染MA-104細(xì)胞，通過免疫熒光和RT-PCR檢測，證實(shí)pCAPRRS轉(zhuǎn)染Marc_145細(xì)胞后，可產(chǎn)生PRRSV。具體過程如下1. 1引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank 登錄號(hào)為 GQ330474 的 PRRSV APRRS 全長序列、pCMV-Script 的載體 序列和丁型肝炎病毒(HDV)的核酶序列，設(shè)計(jì)合成8條引物，具體序列如下
引物名稱引物序列(5’ -3’ ) 1. 2CMV啟動(dòng)子序列的克隆1. 2. IpCMV-Script 質(zhì)粒的提取將含pCMV-Script的T0P10細(xì)菌接種含卡那霉素的LB液體，培養(yǎng)12h，按說明書以 華舜質(zhì)粒小量抽提(W5002)提取pCMV-Script。1. 2. 2CMV啟動(dòng)子片段的擴(kuò)增以PCMVF和PCMVR為引物，以5ng的pCMV-Script為模板，進(jìn)行PCR。將PCR產(chǎn)物以的瓊脂糖電泳，按說明書以博大泰克小量DNA片段快速膠回收試 劑盒回收約600bp目的片段。1. 2. 3CMV啟動(dòng)子片段的克隆以Not I酶切上述回收的CMV啟動(dòng)子片段，37°C酶切12h，以的瓊脂糖電泳回 收酶切片段。同時(shí)以Not I和EcoRV酶切pBluescript SK(+)，并以的瓊脂糖電泳回收 載體片段。以T4連接酶將酶切的CMV啟動(dòng)子片段和pBluescript SK(+)連接。16°C連接 過夜，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，挑選氨芐抗性菌落，提取質(zhì)粒，并以Not I和Xho I酶切篩選 陽性質(zhì)粒。陽性質(zhì)粒稱為pBSCMV。1. 3 丁型肝炎病毒核酶序列的添加以5ng的pAPRRS為模板，以SF14413為上游引物，以PHDVRl為下游引物，進(jìn)行PCR。將PCR產(chǎn)物以的瓊脂糖電泳，按說明書以博大泰克小量DNA片段快速膠回收試 劑盒回收約IlOObp目的片段。以上輪回收PCR目的條帶為模板，以SF14413為上游引物， 分別以PHDVR2和PHDVR3為下游引物，再進(jìn)行二輪PCR擴(kuò)增。以的瓊脂糖電泳回收第三 輪PCR的目的條帶，并以Xho I和Xba I酶切回收條帶。37°C酶切12h，以的瓊脂糖電 泳回收酶切片段。同時(shí)以Xho I和Xba I酶切pAPRRS，并以的瓊脂糖電泳回收大的片 段。以T4連接酶將酶切的帶核酶的3'端片段與pAPRRS連接。16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化T0P10 感受態(tài)細(xì)胞，挑選氨芐抗性菌落，提取質(zhì)粒，并以SF14413與PHDVR2為引物PCR篩選陽性質(zhì) 粒。陽性質(zhì)粒稱為pAPRRSr。
6
PHDVRl PIIDVR2
1. 4CMV啟動(dòng)子控制下PRRSV感染性克隆的構(gòu)建1.4. IPRRSV 5'末端修飾序列的擴(kuò)增與克隆為了將PRRSV全長克隆置于CMV啟動(dòng)子下游，以CMV-SFl和SR2573為引物，以5ng 的pAPRRS為模板，擴(kuò)增PRRSV 5，端序列并同時(shí)引入酶切位點(diǎn)。以瓊脂糖電泳回收目的片段，并以Sph I酶切該片段。37°C酶切10h，以瓊 脂糖電泳回收酶切片段。同時(shí)，以Xho I酶切pBSCMV，回收后以T4 DNA聚合酶補(bǔ)平粘端， 再以Sph I酶切，瓊脂糖電泳回收大片段。以T4 DNA連接酶將酶切后的5'修飾片段 和pBSCMV相連接，16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞，挑選氨芐抗性菌落，提取質(zhì)粒， 并以Mlu I酶切篩選陽性質(zhì)粒。陽性質(zhì)粒稱為PCM5PS。1. 4. 2CMV啟動(dòng)子下全長PRRSV克隆的拼結(jié)以 Not I 和 Afl II 酶切 pCM5PS 和 ρAPRRSr。37°C酶切12h，以1 %瓊脂糖電泳回收PCM5PS酶切后的小片段和pAPRRSr酶切后 的大片段，并以T4DNA連接酶將回收的兩個(gè)片段連接，16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì) 胞，挑選氨芐抗性菌落，提取質(zhì)粒，并以Sma I酶切篩選陽性質(zhì)粒。陽性質(zhì)粒稱為pCAPRRS。1.4. 3pCAPRRS感染性的鑒定參照說明書，以FuGENE HD將2 μ g pCAPRRS轉(zhuǎn)染Marc_145細(xì)胞。轉(zhuǎn)染3d后， Marc-145細(xì)胞明顯細(xì)胞病變。將細(xì)胞上清在Marc_145細(xì)胞傳一代，2d后即出現(xiàn)明顯的細(xì) 胞病變。按說明書以QIAamp Viral RNA Mini Kit提取Marc-145細(xì)胞第一代及傳代上清 中的RNA為模板，以Qst為引物，用Quant Revers Transcriptase作反轉(zhuǎn)錄。以SF14413 和SR15497為引物作PCR0將PCR產(chǎn)物以瓊脂膠電泳，如圖1所示出現(xiàn)約IOOObp的目的條帶(箭頭所指 的目的條帶)，這表明pCAPRRS轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞可產(chǎn)生感染性PRRSV。在圖1中，“1”指 DNA MarkerDL2000, “2”指轉(zhuǎn)染pCAPRRS的Marc-145細(xì)胞上清，“3”指傳代上清。在實(shí)施例1中，將pAPRRS中的T7啟動(dòng)子更換為CMV啟動(dòng)子，并在3 ‘末端插入丁 型肝炎病毒核酶序列，獲得pCAPRRS。將pCAPRRS直接轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，3天后出現(xiàn)細(xì)胞 病變，傳代及RT-PCR證實(shí)產(chǎn)生了 PRRSV，表明pCAPRRS具有感染性。實(shí)施例2豬繁殖與呼吸綜合征病毒重組桿狀病毒的構(gòu)建利用bac-to-bac系統(tǒng)，將pCAPRRS中PRRSV APRRS全長cDNA重組入桿狀病毒中， 構(gòu)建了重組桿狀病毒AcAPRRS。AcAPRRS在sf9細(xì)胞上連續(xù)傳5代，通過對(duì)嵌合處序列分析， 證實(shí)AcAPRRS具有較好的穩(wěn)定性。比較了 AcAPRRS與空載體桿狀病毒AcLacZ在sf9細(xì)胞上 的生長曲線，結(jié)果顯示AcAPRRS具有與AcLacZ相近的生長動(dòng)力特性。以RT-PCR和間接免 疫熒光檢測了 PRRSV基因在sf9細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，結(jié)果顯示，AcAPRRS感染sf9細(xì)胞后， 有低水平的PRRSV亞基因組轉(zhuǎn)錄和N蛋白的表達(dá)。通過PRRSV顆粒的濃縮與純化，在電鏡 下發(fā)現(xiàn)樣品中存在PRRSV顆粒，并以RT-PCR檢測到樣品中存在PRRSV RNA,這表明AcAPRRS 感染sf9細(xì)胞后產(chǎn)生PRRSV。2. 1引物設(shè)計(jì)根據(jù)PCAI3RRS和bac-to-bac中pFastbac 1的序列，設(shè)計(jì)合成下列引物 2. 2重組供體質(zhì)粒的構(gòu)建以 Not I 和 Xho I 酶切 pCATORS 和 pFastbacl。37°C酶切12h，以的瓊脂糖電泳回收pCAPRRS酶切后的大片段(含PRRSV全長 cDNA)和載體pFastbacl。并以T4 DNA連接酶將PRRSV全長cDNA片段和載體pFastbacl 相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO感受態(tài)細(xì)胞。以質(zhì)粒小量快速提取純化試劑盒提取 重組質(zhì)粒，并以Sma I酶切鑒定，pCAPRRS作為對(duì)照質(zhì)粒，酶切結(jié)果見圖2，鑒定陽性重組質(zhì) 粒稱之為pBacAPS，pBacAPS經(jīng)Sma I酶切后的條帶基本與pCAPRRS的相同，只有一條較 大，這是因?yàn)閜Fastbacl載體質(zhì)粒比pBluescript SK(+)大所致，與預(yù)期結(jié)果一致。在圖2 中，“ 1” 指 DNAMarker DL2000，“ 2，，指 pBacAPS 1，“ 3，，指 pBacAPS2，“ 4，，指 pBacAPS3，“ 5 ” 指 pCAPRRS，“6” 指 DNA Marker DL15000。pFastbacl 載體質(zhì)?？梢詫?PRRSV 全長 cDNA 轉(zhuǎn)座 到桿狀病毒的基因組中。2. 3重組bacmid的篩選以分光光度儀測定pBacAPS的濃度。按照上述轉(zhuǎn)化方法，以Ing pBacAPS轉(zhuǎn)化 DH10BacTME. coli感受態(tài)細(xì)胞。在本發(fā)明中，bacmid是指在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中，一種含 有經(jīng)修飾的桿狀病毒AcMNPV全基因組DNA的質(zhì)粒。以含卡那霉素(50 μ g/ml)，慶大霉素 (7 μ g/ml)和四環(huán)素(10 μ g/ml)的 LB 平板(含 100 μ g/ml 的 Χ-gal 和 40 μ g/ml IPTG)篩 選陽性菌落。挑選白色單菌落在上述三抗LB平板純化一次。參照說明書，以堿裂解法分離 重組桿狀病毒基因組(bacmid)，并以引物SF12-SR683和SF14413-SR15497作PCR檢測。以SF14413-SR15497為引物的PCR如上例1. 4中所述方法。如圖3a和3b所示，所鑒定的6個(gè)菌落，以SF12-SR683和SF14413-SR15497為 引物的PCR鑒定結(jié)果均擴(kuò)增出目的條帶，以SF12-SR683為引物擴(kuò)增出的目的條帶大小為 700bp (見圖3a)，以SF14413-SR15497為引物擴(kuò)增出的目的條帶大小為IOOObp (見圖3b)， 表明篩選得到的重組bacmid都含有PRRSV cDNA序列。在圖3a和3b中，“ 1 ”指DNA Marker DL2000, “2” 指重組 bacmid-1，“3” 指重組 bacmid-2，“4” 指重組 bacmid-3，“5” 指重組 bacmi d-4，“ 6 ” 指重組 bacmi d_5，“ 7 ” 指重組 bacmi d_6，“ 8 ” 指 pBacAPS 對(duì)照，“ 9 ” 指 H2O 對(duì) 照。2. 4重組桿狀病毒的獲得與鑒定參照說明書，以S. N. A. P. MidiPrep Kit從IOOml培養(yǎng)物中提取重組bacmid,并 以分光光度計(jì)測定其濃度，以備轉(zhuǎn)染之用。以SF-900II SFM培養(yǎng)的sf9細(xì)胞，分種于35mm培養(yǎng)皿。經(jīng)過夜生長，細(xì)胞密度達(dá)
870%左右用于轉(zhuǎn)染。按說明書操作，以6μ1 cellfectin將Iyg重組bacmind轉(zhuǎn)染Sf9細(xì) 胞。轉(zhuǎn)染后每天觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變，收獲細(xì)胞上清，并添加FBS至終濃度為 2%, 一部分保存于4°C，另一部分凍存_75°C。重組桿狀病毒稱之為AcAPRRS，該重組桿狀病 毒保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué) 保藏中心)，其保藏號(hào)為CCTCC V201005，保藏日期為2010年2月25日，其分類命名為 Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus(AcMNPV)。將 AcAPRRS在 sf9 細(xì)胞上擴(kuò)大培養(yǎng)，感染后5d收上清，添加2% FBS,凍存于-75°C。按照上述方法，提取DHlOBac Ε. coli中未重組的bacmid轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，獲得的 桿狀病毒稱之為AcLacZ，以作為對(duì)照桿狀病毒。按說明書，以DNeasy Tissue Kit 提取 AcAPRRS 基因組 DNA，以 SF12-SR683 和 SF14413-SR15497為引物，按2. 3所述方法作PCR檢測，并以AcLacZ的DNA做對(duì)照。PCR產(chǎn)物 經(jīng)1 %瓊脂電泳，如圖4a和4b所示，以AcAPRRS基因組DNA為模板可擴(kuò)增出約700bp (見圖 4a)和IOOObp (見圖4b)的條帶，而以AcLacZ基因組DNA為模板則未擴(kuò)增出條帶。這表明， AcAPRRS攜帶有PRRSV基因組cDNA。圖4a是重組桿狀病毒AcAPRRS的SF12-SR683引物的 PCR 鑒定圖，其中，“1” 指 DNA Marker DL2000，“2” 指 AcAPRRS Pl，“3” 指 AcAPRRS P2，“4” 指pBacAPS對(duì)照，“5”指AcLacZ對(duì)照。圖4b是重組桿狀病毒AcAPRRS的SF14413-SR15497 引物的 PCR 鑒定圖，其中，“1”指 DNA Marker DL2000，“2”指 AcAPRRS Pl，HAcAPRRSP2， “ 4 ” 指 pBacAPS 對(duì)照，“ 5 ” 指 AcLacZ 對(duì)照。2. 5重組桿狀病毒在sf9細(xì)胞上的穩(wěn)定性將AcAPRRS在sf9上連續(xù)傳5代。將第5代上清接種Marc-145細(xì)胞，同時(shí)以AcLacZ 作對(duì)照。另以DNeasy Tissue Kit提取第5代AcAI3RRS基因組DNA，以引物PBacF350_CMVnR 和SF15008-M13R為引物分別擴(kuò)增重組病毒中PRRSV 5'和3'嵌合序列。以DNA片段小量 快速回收試劑盒回收目的片段，以PBS-T載體克隆目的片段，篩選陽性克隆，委托上海桑尼 生物。16°C連接過夜，按上述方法轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞，以含X_gal和IPTG的Amp平 板作藍(lán)白斑法篩選陽性克隆。將陽性克隆委托上海桑尼生物公司測定序列。序列比較分析 表明，經(jīng)sf9細(xì)胞傳代后，重組桿狀病毒中與PRRSV病毒嵌合處序列并未出現(xiàn)改變。3. 1. 8AcAPRRS與AcLacZ在sf9細(xì)胞上的生長曲線將AcAPRRS和AcLacZ以0. 1M0I (感染復(fù)數(shù))接種35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的sf9細(xì)胞， 27°C孵育lh，并以SF-900 II SFM洗兩遍，每培養(yǎng)皿加入SF-900 II SFM 3ml，27°C培養(yǎng)。接 種后每24h收取細(xì)胞上清200 μ 1，保存于_75°C。以96孔板中的sf9細(xì)胞測定各點(diǎn)的每毫 升半數(shù)組織感染量(TCID5ciAil)。桿狀病毒TCID5Q/ml的具體測定方法如下(a)以SF-900 II SFM將樣品作10倍系列稀釋，每個(gè)96孔板稀釋四個(gè)樣品。(b)向96孔板中每孔加入50 μ 1稀釋病毒液。(c)再向每孔加入100 μ 1 Sf9細(xì)胞液(3 X IO5細(xì)胞/ml)。(d)上樣后的96孔板置27°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1周后觀察并記錄細(xì)胞病變。(e)以Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度，并以GraphPad Prism軟件繪制病毒的生長 曲線。
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AcAPRRS和AcLacZ的生長曲線如圖5所示，在對(duì)數(shù)生長期，AcLacZ的增殖速度比 AcAPRRS稍快，但感染后96h，AcAPRRS和AcLacZ的滴度都可達(dá)到107TCID5(1/ml，且二者的峰 值滴度相近。這表明，長達(dá)16kb的PRRSV基因組cDNA的插入不影響重組桿狀病毒的生產(chǎn)。2. 6間接免疫熒光(IFA)以0. 2M0I (感染復(fù)數(shù))的AcAPRRS接種35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的sf9細(xì)胞，同時(shí)以 0. 2M0I的AcLacZ和5M0I的PRRSV APRRS接種sf9細(xì)胞作為病毒對(duì)照，設(shè)一 35mm細(xì)胞培 養(yǎng)皿中的sf9細(xì)胞作為空白對(duì)照。接種3d后以抗PRRSV NSP2單抗(Anti_nsp2)、抗PRRSV N蛋白單抗(Anti-N)和抗桿狀病毒GP64單抗(AcVl)作IFA檢測NSP2蛋白和N蛋白的表 達(dá)。IFA方法如下將細(xì)胞以PBS洗一次，每平皿加入Iml冰甲醇在-20°C固定lOmin。以含的 Tween-20的PBS洗兩次，每次5min。加入BSA 37°C封閉30min，用抗PRRSV N蛋白的特 異性單抗37°C孵育1. 5h，PBS洗5次，每次3-5min，再加入FITC標(biāo)記羊抗鼠的二抗，37°C孵 育lh，PBS洗3遍后，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。如圖6所示，以抗NSP2和N蛋白單抗作熒光染色，僅有AcAPRRS感染的昆蟲細(xì)胞 呈陽性染色；以抗GP64單抗作熒光染色，則AcAPRRS和AcLacZ感染昆蟲細(xì)胞呈陽性染色。 這表明，PRRSV不能感染sf9細(xì)胞，sf9細(xì)胞中出現(xiàn)的PRRSV蛋白是由于AcAPRRS所攜帶的 PRRSV基因組發(fā)生轉(zhuǎn)錄與表達(dá)所致。2. 7sf9細(xì)胞中產(chǎn)生的PRRSV顆粒純化以0. 2M0I的AcAPRRS接種T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的sf9細(xì)胞，接種7天后，收獲細(xì)胞 上清，以2000rpm 4°C離心20分鐘，然后IOOOOrpm 4°C離心30分鐘(Sigma，H-12150)，取上 清。將上清以50，OOOXg 4°C離心lh(BeckMan，SW32 Ti)，二次離心以沉淀去除其中的桿狀 病毒，上清在30%蔗糖墊上以106，750\8超速離心211出6010&111，SW32 Ti)，沉淀以STE緩 沖液重懸。收集的重懸液再在30%蔗糖墊上以106，750 Xg超速離心2h，沉淀以STE重懸。 將最終的重懸液滴一滴在銅網(wǎng)上，以的磷鎢酸負(fù)染1分鐘，在電子顯微鏡下觀察。經(jīng)過 濃縮和純化的重懸液中，存在一些直徑為45-60nm的顆粒(見圖7)，與PRRSV顆粒大小一 致。為了檢測AcAPRRS感染的sf9細(xì)胞上清經(jīng)濃縮純化的樣品中是否存在PRRSV基因 組RNA，以北京天根公司RNApr印pure Cell/Bacteria Kit提取上清中的核酸。為了消除 樣品中的DNA污染，在提取過程中使用DNase I。為了檢測RNA，先使用Qst為引物作RT，再 以SF14413和SR15497為引物作PCR0為了檢測是否存在DNA，直接以SF14413和SR15497 為引物作PCR。檢測結(jié)果如圖8，超離心樣品經(jīng)過DNase I消化后，PCR檢測為無條帶(圖8 中“2”)，而RT-PCR檢測出現(xiàn)預(yù)期大小條帶(圖8中“1”)，這表明樣品中含有PRRSV RNA0在實(shí)施例2中，通過bac-to-bac系統(tǒng)獲得了重組桿狀病毒AcAPRRS，通過傳代后 序列分析證實(shí)AcAPRRS的穩(wěn)定性；通過與AcLacZ的生長曲線比較分析，表明長達(dá)16kb的 PRRSV序列插入對(duì)重組桿狀病毒的生產(chǎn)無影響；通過間接免役熒光證實(shí)，AcAPRRS攜帶的 PRRSV cDNA可在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)；通過病毒純化和核酸檢測，證實(shí)AcAPRRS感染的sf9細(xì) 胞上清中存在包裝有PRRSV RNA的PRRSV顆粒。實(shí)施例3Marc_145細(xì)胞上產(chǎn)生感染性豬繁殖與呼吸綜合征病毒將重組桿狀病毒AcAPRRS接種Marc_145細(xì)胞，3天后接種的Marc_145細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，以抗PRRSV N蛋白單抗作免疫熒光染色，出現(xiàn)熒光。將接種的Marc-145細(xì)胞上 清在Marc-145細(xì)胞上傳代，傳代接種細(xì)胞均能出現(xiàn)細(xì)胞病變。以RT-PCR檢測接種與傳代 的Marc-145細(xì)胞上清，樣品均呈現(xiàn)PRRSV陽性。以上結(jié)果表明，AcAPRRS接種Marc_145細(xì) 胞后，能產(chǎn)生感染性PRRSV。將源自于AcAPRRS的PRRSV稱之為vASM。比較了 vASM與親本 毒株P(guān)RRSVAPRRS的一步生長曲線和空斑形態(tài)，結(jié)果顯示，vASM與APRRS的生長特性相近。 5' -Race和3' -Race分析結(jié)果顯示，vASM與APRRS具有相同的末端序列。上述結(jié)果表 明，重組桿狀病毒未改變攜帶外源病毒基因組的特性。3. 1引物設(shè)計(jì)本例所用引物如下 3. 2間接免疫熒光生長于6孔板中的Marc-145細(xì)胞，當(dāng)生長成單層時(shí)，用PBS洗兩次，以5M0I的 AcAPRRS 接種 Marc-145 細(xì)胞。同時(shí)以 5M0I 的 AcLacZ 和 0. 01M0I 的 PRRSV APRRS 作為對(duì)照 病毒接種Marc-145細(xì)胞。37°C吸附2h后，用PBS洗細(xì)胞一次，每孔加入3ml含2% FBS的 MEM,在37°C含5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后，以抗PRRSV N蛋白單抗按上例2. 6方法進(jìn)行 IFA。IFA結(jié)果如圖9，AcAI3RRS和AI3RRS接種Marc-145細(xì)胞出現(xiàn)陽性染色，而AcLacZ 接種細(xì)胞與陰性對(duì)照細(xì)胞一樣，未顯示熒光。這表明AcAPRRS接種的Marc-145細(xì)胞中出現(xiàn) PRRSV N蛋白的表達(dá)，且AcAPRRS接種細(xì)胞的熒光染色率與APRRS接種細(xì)胞的熒光染色率相 近，顯示AcAPRRS接種Marc-145細(xì)胞可能產(chǎn)生感染性PRRSV。3. 3AcAPRRS轉(zhuǎn)導(dǎo)Marc-145細(xì)胞后子代PRRSV病毒的產(chǎn)生生長于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的Marc-145細(xì)胞單層，用PBS洗兩次，以5M0I的 AcAPRRS接種Marc-145細(xì)胞，同時(shí)以另一 35mm培養(yǎng)皿中的Marc-145細(xì)胞接種AcLacZ作為 對(duì)照。37°C吸附Ih后，用PBS洗細(xì)胞一次，每培養(yǎng)皿加入3ml含2% FBS的MEM，37°C含5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3d后AcAI3RRS接種的Marc-145細(xì)胞上出現(xiàn)細(xì)胞病變。4d后，AcAPRRS 接種的Marc-145細(xì)胞病變顯著，而AcLacZ接種的Marc-145細(xì)胞未出現(xiàn)病變。收獲上清，稱 之為vASM，凍存于-75°C備用。再將vASM作1 100稀釋，和AcLacZ轉(zhuǎn)導(dǎo)Marc-145細(xì)胞上清(vALZ)原液分別感染Marc-145細(xì)胞，vASM接種的Marc-145細(xì)胞2d后即出現(xiàn)細(xì)胞病 變，3d后收獲其上清。vALZ接種的Marc-145細(xì)胞至接種后7d未出現(xiàn)病變。按說明書，以 QIAamp Viral RNAMini Kit提取vASM第一代Fl及繼代上清F2中的RNA為模板，按1. 4. 3 中所述方法，以Qst為引物用Quant Revers Transcriptase作反轉(zhuǎn)錄。以SF14413-SR15497 作為引物，作PCR檢測。RT-PCR檢測結(jié)果(見圖10)顯示，AcAPRRS接種的Marc-145細(xì)胞 的上清中的vASM與其傳代均為PRRSV陽性，而AcLacZ接種的Marc-145細(xì)胞上清與傳代均 為PRRSV陰性。這表明，AcAPRRS接種的Marc-145細(xì)胞產(chǎn)生感染性PRRSV。3. 35' -Race 禾口 3' -Race以 QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取 vASM在Marc-145 上原代(Fl)和第二代(F2) 的RNA，以大連寶生物公司的5' -Full Race Kit和3' -Full Race Core Set，按試劑盒 說明書進(jìn)行5' -Race和3' -Race。具體方法如下。5' -Race 按試劑盒說明書，經(jīng)過去磷酸化、“去帽子”和5' RACE Adaptor的連 接的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下30°C IOmin ；42°C Ih ；70°C 15min。反應(yīng)結(jié)束后，cDNA凍存 于-30°C備用。以上述cDNA為模板，以5' outer primer和SR1124為引物進(jìn)行第一輪PCR。以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，以5' inner primer和SR683為引物進(jìn)行第二輪PCR 的擴(kuò)增。3' -Race (1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42°C Ih ；70°C 15min。反應(yīng)結(jié)束后，cDNA凍存于_30°C備用。(2)以上述cDNA為模板，以SF14413和3' outer primer為引物，僅作一輪PCR。以的瓊脂膠回收5' -Race和3' -Race的PCR目的條帶，并以pBS-Τ載體 克隆，委托上海桑尼生物公司測序。序列分析結(jié)果如圖11所示，在圖11中，“A”為PRRSV APRRS末端序列，“B”為vASM Fl和F2的5，末端與APRRS 5，末端序列的比較，“C”為vASM Fl和F2的3，末端與APRRS 3，末端序列的比較，可見vASM Fl和F2序列與APRRS的末端 序列一致，這表明，AcAPRRS可介導(dǎo)產(chǎn)生的完整的PRRSV。3. 4空斑試驗(yàn)將vASM和PRRSV APRRS作10倍系列稀釋至IO"5,分別取1(T3、IO"4和IO"5稀釋病 毒液200 μ 1接種6孔板中的Marc-145細(xì)胞單層。37°C吸附Ih后，以PBS將細(xì)胞洗滌二 次，每孔加入5ml覆蓋培養(yǎng)基(含2%FBS和瓊脂糖)。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后，以 5%的結(jié)晶紫染色?？瞻呓Y(jié)果如圖12，vASM所致空斑與APRRS所致空斑大小相近。3. 5—步生長曲線分別以5M0I的vASM和PRRSV AI3RRS接種35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的Marc-145細(xì)胞單 層。接種Ih后以PBS洗細(xì)胞2次，每平皿加入3ml含2% FBS的MEM，置37°C C02中培養(yǎng)。 分別于接種后4h、8h、12h、16h、20h、24h和28h收獲200ul細(xì)胞上清，同時(shí)補(bǔ)充200ul含2% FBS的MEM。收獲上清凍存于_75°C，以96孔板中的Marc-145細(xì)胞測定不同時(shí)間點(diǎn)上清中 的病毒 TCID5Q/ml。PRRSV的TCID5Q/ml的測定方法如下
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(a)以含2% FBS的MEM將樣品作10倍系列稀釋，每個(gè)96孔板稀釋四個(gè)樣品。(b)向96孔板中每孔加入50 μ 1稀釋病毒液。(c)再向每孔加入100 μ 1 Marc-145細(xì)胞液(3 X IO5細(xì)胞/ml)。(d)上樣后的96孔板置37°C CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1周后觀察并記錄細(xì)胞病變。(e)以Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度，并以GraphPad Prism軟件繪制病毒的生長 曲線。生長曲線如圖13，雖然在對(duì)數(shù)生長期APRRS的生長速度比vASM稍快，但在感染后 24h，vASM和APRRS都達(dá)到病毒滴度的峰值，且峰值滴度相近。在實(shí)施例3中，重組桿狀病毒接種Marc-145細(xì)胞，出現(xiàn)N蛋白的表達(dá)，并可產(chǎn)生感 染性PRRSV。測定了 AcAPRRS介導(dǎo)產(chǎn)生PRRSV的末端序列，并比較了其與親本株APRRS的一 步生長曲線和空斑，結(jié)果表明AcAPRRS介導(dǎo)產(chǎn)生的PRRSV與親本株末端序列完全一致，生長 特性與親本株也相近，這些表明AcAPRRS對(duì)攜帶的全長PRRSV cDNA的活性無影響。實(shí)施例4BHK-21細(xì)胞和vero細(xì)胞上產(chǎn)生感染性豬繁殖與呼吸綜合征病毒將重組桿狀病毒AcAPRRS接種BHK-21細(xì)胞和vero細(xì)胞。接種2天后，以抗PRRSV N 蛋白單抗作免疫熒光染色，出現(xiàn)熒光。將接種的BHK-21細(xì)胞和vero細(xì)胞上清接種Marc-145 細(xì)胞，2天后，Marc-145細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變。以RT-PCR檢測BHK-21細(xì)胞和vero細(xì)胞上清 及傳代的Marc-145細(xì)胞上清，均呈PRRSV陽性。以上結(jié)果表明，AcAPRRS接種BHK-21細(xì)胞 和vero細(xì)胞后，可產(chǎn)生感染性PRRSV。以AcAPRRS接種BHK-21和vero后，測定了 PRRSV的 生產(chǎn)曲線，結(jié)果顯示，PRRSV的滴度最高可達(dá)104TCID5Q/ml以上。4. IAcAPRRS轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21和vero細(xì)胞后PRRSV N蛋白的表達(dá)分種于6孔板中的BHK-21和vero細(xì)胞，當(dāng)生長成單層時(shí)，用PBS洗兩次，以5M0I 的 AcAPRRS 接種 BHK-21 和 vero 細(xì)胞。同時(shí)以 5M0I 的 AcLacZ 和 5M0I 的 PRRSV APRRS 作 為對(duì)照病毒接種BHK-21細(xì)胞。37°C孵育8h后，以PBS洗細(xì)胞二次，每孔加入3ml含2% FBS 的DMEM，在37°C含5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d后，以抗PRRSV N蛋白單抗按上例3. 2所述 方法作IFA。IFA試驗(yàn)結(jié)果(圖14)顯示，僅有AcAPRRS接種的BHK-21細(xì)胞和vero細(xì)胞呈現(xiàn)陽 性染色，而其它細(xì)胞染色均呈陰性。這顯示，PRRSV雖然不能感染BHK-21和vero細(xì)胞，但 AcAPRRS可介導(dǎo)其攜帶的PRRSV cDNA在其中表達(dá)。4. 2AcAPRRS 轉(zhuǎn)導(dǎo) BHK-21 和 vero 細(xì)胞產(chǎn)生感染性 PRRSV以5M0I的AcAPRRS接種35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的BHK-21和vero細(xì)胞單層，同時(shí)以 AcLacZ作為對(duì)照病毒以5M0I接種BHK-21和vero細(xì)胞。37°C孵育8h后，以PBS洗細(xì)胞二 次，每孔加入3ml含2% FBS的DMEM。接種后3d收獲細(xì)胞上清，并取一部分上清感染35mm 培養(yǎng)皿中的Marc-145細(xì)胞單層。感染2d后，接種過AcAPRRS的BHK-21和vero細(xì)胞上清 均能引致Marc-145細(xì)胞出現(xiàn)病變。3d后收獲上清。按照上例3. 3所述方法，將BHK-21和 vero細(xì)胞上清及Marc-145細(xì)胞上清以QIAamp Viral RNA Mini Kit提取RNA，以Qst為引 物，反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以SF14413-SR15497為引物，作PCR檢測PRRSV序列。PCR檢測結(jié)果顯 示，接種過AcAPRRS的BHK-21和vero細(xì)胞上清及其傳代的Marc-145細(xì)胞上清均呈現(xiàn)PRRSV 陽性，而AcLacZ接種的BHK-21和vero細(xì)胞上清及其傳代的Marc-145細(xì)胞上清則均為陰 性。這表明，AcAPRRS接種BHK-21和vero細(xì)胞后，可產(chǎn)生感染性PRRSV。
4. 3BHK-21細(xì)胞和vero細(xì)胞上PRRSV的生產(chǎn)曲線生長于35mm培養(yǎng)皿中的BHK-21細(xì)胞和vero細(xì)胞單層，以PBS洗兩次后，均以5M0I 的AcAPRRS接種。37°C孵育8h后，以DMEM洗兩次，每培養(yǎng)皿加入3ml含2%的DMEM，37°C 培養(yǎng)。在培養(yǎng)中，每8h收獲細(xì)胞上清200μ 1，并相應(yīng)補(bǔ)充200μ 1含2%FBS&DMEM。按上 例3. 5所述方法，以96孔板中的Marc-145細(xì)胞測定各點(diǎn)的PRRSV病毒滴度。如圖15所示，BHK-21和vero細(xì)胞接種AcAI3RRS后，BHK-21細(xì)胞中產(chǎn)生PRRSV較 快，16h即出現(xiàn)PRRSV，而vero細(xì)胞出現(xiàn)PRRSV稍慢。但從產(chǎn)生的PRRSV最高滴度看，vero 細(xì)胞中產(chǎn)生的PRRSV滴度(104'28TCID50/ml)比BHK-21細(xì)胞中的(104 05TCID50/ml)略高。在實(shí)施例4中，以AcAPRRS接種BHK-21和vero細(xì)胞，以抗N單克隆抗體作間接免 疫熒光染色，證實(shí)了 BHK-21和vero細(xì)胞出現(xiàn)N蛋白的表達(dá)。將BHK-21和vero細(xì)胞上清 在Marc-145細(xì)胞上傳代和RT-PCR檢測，證實(shí)了 BHK-21和vero細(xì)胞雖不是PRRSV敏感細(xì) 胞，但經(jīng)AcAPRRS轉(zhuǎn)導(dǎo)，可產(chǎn)生感染性PRRSV。綜上所述，將PRRSV感染克隆pAPRRS中T7啟動(dòng)子替換為CMV啟動(dòng)子，并在PRRSV cDNA3 ‘末端添加HDVr序列，獲得的感染性克隆pCAPRRS直接轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞可產(chǎn)生感 染性PRRSV。將CMV啟動(dòng)子控制下的全長PRRSV cDNA重組入桿狀病毒，獲得的重組桿狀病 毒AcAPRRS在感染的昆蟲細(xì)胞后，可表達(dá)攜帶的PRRSV基因，并產(chǎn)生PRRSV顆粒，這有利于 利用桿狀病毒_昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)來研究體外非培養(yǎng)病毒。AcAPRRS接種Marc-145細(xì)胞后，可 產(chǎn)生感染性PRRSV，且來自AcAPRRS產(chǎn)生的PRRSV與其親本病毒在生長特性上無差異，經(jīng)桿 狀病毒呈遞后產(chǎn)生的PRRSV序列也無變異。此外，AcAPRRS接種PRRSV非敏感細(xì)胞后，也可 產(chǎn)生感染性PRRSV。這表明，可以利用桿狀病毒來建立體外非培養(yǎng)病毒的培養(yǎng)系統(tǒng)，或利用 桿狀病毒作為呈遞系統(tǒng)接種機(jī)體，來研制疫苗，避免利用哺乳細(xì)胞作為基質(zhì)細(xì)胞生產(chǎn)疫苗 時(shí)的外源污染。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能 因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說， 在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
1權(quán)利要求
一種重組桿狀病毒，其特征在于，該重組桿狀病毒包含編碼豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染性病毒顆粒蛋白的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒，其特征在于，所述重組桿狀病毒包含SEQID NO. 1所示的豬繁殖與呼吸綜合征病毒全基因組序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組桿狀病毒，其特征在于，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒 全基因組序列置于CMV啟動(dòng)子下游。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組桿狀病毒，其特征在于，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒 全基因組序列的3’末端添加有丁型肝炎病毒的核酶序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組桿狀病毒，其特征在于，所述重組桿狀病毒的保藏號(hào)為 CCTCC V201005。
6.一種細(xì)胞，其特征在于，包含權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的重組桿狀病毒。
7.—種權(quán)利要求1所述重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟構(gòu)建含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染性基因序列的供體質(zhì)粒；將所述供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過篩選獲得包含豬繁殖與呼吸綜合征 病毒感染性基因序列、以及桿狀病毒全基因組序列的質(zhì)粒，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到sf9昆蟲細(xì) 胞中，以獲得重組桿狀病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述重組桿狀病毒中，豬繁殖與呼吸 綜合征病毒感染性基因序列置于桿狀病毒的核多角體啟動(dòng)子的下游。
9.權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒在制備預(yù)防或治療豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗中 的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒用于建立體外病毒培養(yǎng)系統(tǒng)的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開一種重組桿狀病毒，該重組桿狀病毒包含編碼豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染性病毒顆粒蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明還公開了重組桿狀病毒的構(gòu)建方法及應(yīng)用。本發(fā)明的重組桿狀病毒，在昆蟲細(xì)胞、以及PRRSV敏感和非敏感哺乳細(xì)胞中都能成功表達(dá)出感染性PRRSV顆粒，可用于研制PRRSV疫苗，以及建立體外培養(yǎng)病毒的培養(yǎng)體系。
文檔編號(hào)A61K39/12GK101899421SQ20101011550
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月1日
發(fā)明者于丹丹, 劉萍, 劉長龍, 周艷, 孫志, 莊金山, 李燕華, 王小敏, 藺濤, 袁世山, 鄧宇, 鄭浩, 鄭海紅, 韋祖樟, 高飛, 龍進(jìn)學(xué) 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所