專利名稱：基于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的重組人神經(jīng)生長因子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因技術(shù)，具體涉及一種制備重組人神經(jīng)生長因子的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor, NGF)是最早發(fā)現(xiàn)和最典型的神經(jīng)營養(yǎng)因 子，同時也是神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的生物活性分子之一，它對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分 化、生長、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用，可影響外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)某些 神經(jīng)元的存活和分化，對保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能有重要作用，目前NGF已被開發(fā)成治療 外周神經(jīng)損傷的藥物應(yīng)用于臨床，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)損傷、偏癱、卒中、顱腦損傷、小兒腦癱等 神經(jīng)性疾病領(lǐng)域。然而，天然的NGF含量極低，給分離純化帶來相當(dāng)?shù)睦щy。迄今為止已批準(zhǔn)上市使 用的神經(jīng)生長因子均為從小鼠頌下腺中分離純化的鼠源性的神經(jīng)生長因子。雖然這類產(chǎn)品 中的鼠源性NGF與人體NGF的結(jié)構(gòu)具有高度的同源性，生物效應(yīng)也無明顯的種間特異性，但 是鼠源性蛋白制品不論在化學(xué)結(jié)構(gòu)上還是空間結(jié)構(gòu)上都有別于人源性蛋白制品，且對人來 說，動物源性的蛋白常常具有較高的免疫原性，容易引起人體內(nèi)的抗原反應(yīng)，嚴(yán)重者甚至?xí)?危及生命。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的重組人神經(jīng)生長因子 的制備方法，實現(xiàn)NGF的安全的大量的制備。本發(fā)明的技術(shù)方案為基于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的重組人神經(jīng)生長因子的制備 方法，其步驟是(1)將編碼人神經(jīng)生長因子的基因可操作地連接于表達(dá)載體Bacmid，構(gòu)建表達(dá)人 神經(jīng)生長因子的重組表達(dá)載體；(2)所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，收獲重組病毒顆粒，構(gòu)建表達(dá)人神經(jīng)生長因 子的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)；(3)培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞，并用重組病毒感染，獲得大量重組人神經(jīng)生長因子。所述步驟(1)的方法是(1. 1)將人神經(jīng)生長因子基因片段用BamHI、HindIII雙酶切后插入 pFastBac Dual質(zhì)粒，構(gòu)建pFastBac Dual+[rh β -NGF]重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌 株，篩選重組子，提取pFastBacTMDual+[rh β -NGF]重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR與酶切鑒定插入正確 后，測序驗證其序列正確性；(1. 2)將上述鑒定正確的pFastBac Dual+[rh β -NGF]質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有Bacmid質(zhì)粒 的大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，獲取含重組人神經(jīng)生長因子基因的穿梭 質(zhì)粒Bacmid+[rh β -NGF]，經(jīng)PCR鑒定后再經(jīng)測序驗證其序列正確性；
所述人神經(jīng)生長因子基因片段是ATGTCCATGTTGTTCTACACTCTGATCACAGCTTTTCTGATCGGCATACAGGCGGAACCACTCAGAGAG CAATGTCCCTGCAGGACACCATCCCCCAAGCCCACTGGACTAAACTTCAGCATTCCCTTGACACTGCCCTTCGCAGA GCCCGCAGCGCCCCGGCAGCGGCGATAGCTGCACGCGTGGCGGGGCAGACCCGCAACATTACTGTGGACCCAGGCTG TTTAAAAAGCGGCGACTCCGTTCACCCCGTGTGCTGTTTAGCACCCAGCCTCCCCGTGAAGCTGCAGACACTCAGGA TCTGGACTTCGAGGTCGGTGGTGCTGCCCCCTTCAACAGGACTCACAGGAGCAAGCGGTCATCATCATCCCATCCCA TCTTCCACAGGGGCGAATTCTCGGTGTGTGACAGTGTCAGCGTGTGGGTTGGGGATAAGACCACCGCCACAGACATC AAGGGCAAGGAGGTGATGGTGTTGGGAGAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCAAACAGTACTTTTTTGAGACCAA GTGCCGGGACCCAAATCCCGTTGACAGCGGGTGCCGGGGCATTGACTCAAAGCACTGGAACTCATATTGTACCACGA CTCACACCTTTGTCAAGGCGCTGACCAGGATGGCAAGCAGGCTGCCTGGCGGTTTATCCGGATAGATACGGCCTGTG TGTGTGTGCTCAGCAGGAAGGCTGTGAGAAGAGCCTGA氨基酸序列是MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSTDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRN ITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSWV⑶KT TATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRI DTACYCVLSRKAVRRA-所述構(gòu)建pFastBac Dual+[rh β -NGF]重組質(zhì)粒的方法是在構(gòu)建pFastBac Dual 質(zhì)粒后，利用T4DNA Iigase連接構(gòu)建得到pFastBac Dual+[rh β-NGF]重組質(zhì)粒。所述步驟(2)的方法是(2. 1)取對數(shù)生長期的昆蟲細(xì)胞sf9，用含rhi3 -NGF的穿梭質(zhì)粒Bacmid和脂質(zhì)體 轉(zhuǎn)染試劑cellfectioMOOO混合進(jìn)行轉(zhuǎn)染；(2. 2)轉(zhuǎn)染后的sf9細(xì)胞因Bacmid+[rhi3-NGF]質(zhì)粒的表達(dá)而產(chǎn)生昆蟲病毒顆粒， 并使sf9細(xì)胞裂解；(2. 3)收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清，其中含有攜帶重組人神經(jīng)生長因子的昆蟲桿狀病毒顆 粒及少量重組人神經(jīng)生長因子。所述步驟(1. 1)中含有重組人神經(jīng)生長因子的重組質(zhì)粒的制備步驟包括1. 1. 1)以下述合成的核苷酸序列為引物引物 1:5' CAGCGGATCCATGTCCATGTTGTTCTACAC 3'引物 2 5 ‘ GCTCAAGCTTCTAGATCAGGCTCTTCTCAC 3 ‘以從人血白細(xì)胞中提取的RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增；1. 1.2)從獲得RT-PCR產(chǎn)物中回收合成的人神經(jīng)生長因子基因片段，插入載體 pFastBac Dual，獲得含有人神經(jīng)生長因子的重組質(zhì)粒pFastBac Dual+[rh β -NGF]。本發(fā)明構(gòu)建的含有人神經(jīng)生長因子的表達(dá)載體Bacmid+[rhi3-NGF]，其本質(zhì)為重 組的昆蟲桿狀病毒基因組，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞后，外源基因能隨著病毒外殼蛋白的表 達(dá)而表達(dá)。表達(dá)出的含有信號肽的重組人神經(jīng)生長因子能在昆蟲細(xì)胞內(nèi)完成加工修飾和正 確折疊，并被釋放到細(xì)胞外；本發(fā)明提供了一種用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備重組人神經(jīng)生長因子的新方法， 它與其他表達(dá)系統(tǒng)相比，如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)比較具有以下優(yōu)點表達(dá)產(chǎn)率高；
表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后加工與高等生物相似，可使蛋白產(chǎn)物保持天然結(jié)構(gòu)、生物活性 和免疫活性；可同時表達(dá)多個外源蛋白，來源遍及動物、植物、細(xì)菌、真菌和病毒；桿狀病毒能容納較大的外源基因而不至于影響其本身的增殖；蛋白產(chǎn)物易從無血清的培養(yǎng)上清中純化，無內(nèi)毒素污染；生物安全性高，對植物和脊椎動物均無致病性。上述優(yōu)勢使本發(fā)明具有明顯的技術(shù)創(chuàng)新性和工藝先進(jìn)性，能工業(yè)化生產(chǎn)重組人神 經(jīng)生長因子。按照本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)和方法可以制備得到純度大于98%，生物比活性高于 500000AU/mg的重組人神經(jīng)生長因子。


圖1為含有人神經(jīng)生長因子的昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體Bacmid+[rh β -NGF]構(gòu)建及 結(jié)構(gòu)圖。圖2為本發(fā)明獲得的重組人神經(jīng)生長因子SDS-PAGE電泳圖，其中M為低分子量標(biāo) 準(zhǔn)蛋白，1泳道為純化后的rhi3 -NGF，2泳道為感染的昆蟲細(xì)胞上清；圖3 圖6為本發(fā)明獲得的重組人神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)雞胚背神經(jīng)節(jié)生長情況照 片。其中圖3是樣品稀釋7500倍，約6ng/ml (++++)；圖4是樣品稀釋11250倍，約4ng/ ml (++++)；圖5是樣品稀釋15000倍，約3ng/ml (+++)；圖6是鼠頌下腺神經(jīng)生長因子參考 品稀釋500倍，約2U/ml (+++)。
具體實施例方式本發(fā)明所用的試驗材料如無特別說明均為市售購買產(chǎn)品，各種試劑和培養(yǎng)基的成 分和配制方法可參見常規(guī)實驗手冊中的操作。重組人神經(jīng)生長因子昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建與表達(dá)l.rh β-NGF 基因的獲取1. 1人血白細(xì)胞總RNA的提取方法按常規(guī)提取方法進(jìn)行1)取枸櫞酸鈉抗凝血，離心沉淀白細(xì)胞；2)向約7Χ IO6個細(xì)胞EP管內(nèi)加入 Trizol ImL,輕輕混勻后，靜置5min,加入0. 2mL氯仿，用力震蕩15s 30s，靜置冰上3min， 4°C, 12000轉(zhuǎn)/min，15min ；3)吸上層水相于另一 EP管，加等體積異丙醇，上下顛倒幾次混 勻，震蕩混勻，室溫放置15min,4°C, 12000轉(zhuǎn)/min, IOmin ；4)棄上清，加入0. 3mL75%乙醇 (DEPC水配制)洗滌RNA沉淀，4°C，7500轉(zhuǎn)/min，5min。棄上清，空氣干燥RNA，加入25ul DEPC 水溶 RNA。2) RT-PCR 擴(kuò)增 rh β -NGF 的 cDNA1)以O(shè)ligo (dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄合成rhi3 -NGF片段基因的cDNA第一鏈2)逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增rh β -NGF雙鏈cDNA利用引物1，引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增rh β -NGF片段基因，擴(kuò)增條件為94°C變性30 秒，55°C退火50秒，72°C延伸40秒，共進(jìn)行30個循環(huán)；引物 1 5 ‘ CAGCGGATCCATGTCCATGTTGTTCTACAC3 ‘
引物 2 5 ‘ GCTCAAGCTTCTAGATCAGGCTCTTCTCAC3 ‘3) 1 %瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，得到純化的rh β -NGF基因片段。2.表達(dá)質(zhì)粒 Bacmid+[rh0_NGF]的構(gòu)建2. Irh β -NGF 基因插入 pFastBac Dual 質(zhì)粒將純化的rh β -NGF基因片段用BamHI、HindIII雙酶切后插入pFastBac Dual 質(zhì)粒，并用T4DNA Iigase連接構(gòu)建pFastBacTMDual+[rh β -NGF]重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109菌株，在含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)篩選重組子，經(jīng)PCR與 酶切鑒定正確后，測序；2. 2將上述鑒定正確的pFastBac Dual+[rh β -NGF]質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DHlOBac感受態(tài)細(xì) 胞，此時pFastBac Dual+[rh β -NGF]質(zhì)粒能與DHlOBac內(nèi)的穿梭質(zhì)粒Bacmid發(fā)生位點特 異性轉(zhuǎn)座，從而獲得含有rh β -NGF的表達(dá)質(zhì)粒Bacmid+[rh β -NGF]，經(jīng)PCR鑒定后再測序。Bacmid+[rh3-NGF]質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖見圖 1。3.昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及表達(dá)用含8%胎牛血清的Grace’ s培養(yǎng)基于27°C無二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)Sf9細(xì)胞， 2-3d更換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長至對數(shù)期，用BaCmid+[rhi3 -NGF]質(zhì)粒和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試 劑cellfectioMOOO混合進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作按脂質(zhì)體說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后的sf9細(xì)胞因 Bacmid+[rh β-NGF]質(zhì)粒的表達(dá)而產(chǎn)生昆蟲病毒顆粒，并使sf9細(xì)胞裂解；收獲細(xì)胞培養(yǎng)上 清，其中含有攜帶重組人神經(jīng)生長因子的昆蟲桿狀病毒顆粒及少量重組人神經(jīng)生長因子； 再用上述上清反復(fù)感染sf9細(xì)胞獲取第三批感染的上清(P3)，檢測病毒滴度；用P3感染在 昆蟲無血清培養(yǎng)基中生長的sf9細(xì)胞，5天后，收獲培養(yǎng)上清，其中含有大量重組人神經(jīng)生 長因子。如圖2所示。重組人神經(jīng)生長因子的分離純化制備取收集的培養(yǎng)上清1000ml，于4°C 8000rpm離心lOmin，雙層綢布過濾，濾液用截留 分子量為3k Da的超濾膜超濾濃縮約5 6倍；濃縮物上樣預(yù)先用20mM PB(pH7. 1)平衡好 的CM-S印haroseF. F柱，上樣完畢以平衡液流洗至基線走平，以0. IM NaCl-20mMPB (pH7. 1) 洗脫雜蛋白，0.4M NaCl-20mM PB(pH7. 1)洗脫收集目的物，將該洗脫物用截留分子量為 3k Da的超濾膜超濾濃縮至約20ml，上樣預(yù)先用0. 15M NaCl-20mM PB(pH7. 1)平衡好的 Sephacryl SlOO柱，以平衡液洗脫收集目標(biāo)峰，即為純化的rh β NGF樣品，總蛋白含量為 8. Img0經(jīng)還原性SDS-PAGE電泳檢測為單一條帶；以中國藥品生物制品檢定所分發(fā)的鼠頌 下腺神經(jīng)生長因子參考品為參照，采用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法檢測該樣品生物活性，結(jié)果 顯示比活性為666666. 7AU/mg。如圖3 圖6所示。
權(quán)利要求
一種基于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的重組人神經(jīng)生長因子的制備方法，其步驟是(1)將編碼人神經(jīng)生長因子的基因可操作地連接于表達(dá)載體Bacmid，構(gòu)建表達(dá)人神經(jīng)生長因子的重組表達(dá)載體；(2)所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，收獲重組病毒顆粒，構(gòu)建表達(dá)人神經(jīng)生長因子的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)；(3)培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞，并用重組病毒感染，獲得大量重組人神經(jīng)生長因子。
2.如權(quán)利要求1所述基于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的重組人神經(jīng)生長因子的制備方法， 其特征是所述步驟(1)的方法是(1. 1)將人神經(jīng)生長因子基因片段用BamHI、HindIII雙酶切后插入pFastBac Dual質(zhì) 粒，構(gòu)建pFastBacTMDual+[rh β -NGF]重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株，篩選重組子，提 取pFastBacTMDual+[rh β -NGF]重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR與酶切鑒定插入正確后，測序驗證其序列 正確性；(1. 2)將上述鑒定正確的pFastBacTMDual+[rh β -NGF]質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有Bacmid質(zhì)粒的大 腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，獲取含重組人神經(jīng)生長因子基因的穿梭質(zhì)粒 Bacmid+[rh β -NGF]，經(jīng)PCR鑒定后再經(jīng)測序驗證其序列正確性；所述人神經(jīng)生長因子基因片段是ATGTCCATGTTGTTCTACACTCTGATCACAGCTTTTCTGATCGGCATACAGGCGGAACCACACTCAGAGAGC AATGTCCCTGCAGGACACACCATCCCCCAAGCCCACTGGACTAAACTTCAGCATTCCCTTGACACTGCCCTTCGCAG AGCCCGCAGCGCCCCGGCAGCGGCGATAGCTGCACGCGTGGCGGGGCAGACCCGCAACATTACTGTGGACCCCAGGC TGTTTAAAAAGCGGCGACTCCGTTCACCCCGTGTGCTGTTTAGCACCCAGCCTCCCCGTGAAGCTGCAGACACTCAG GATCTGGACTTCGAGGTCGGTGGTGCTGCCCCCTTCAACAGGACTCACAGGAGCAAGCGGTCATCATCCCATCCCAT CTTCCACAGGGGCGAATTCTCGGTGTGTGACAGTGTCAGCGTGTGGGTTGGGGATAAGACCACCGCCACAGACATCA AGGGCAAGGAGGTGATGGTGTTGGGAGAGGTGAACATTAACAACAGTGTATTCAAACAGTACTTTTTTGAGACCAAG TGCCGGGACCCAAATCCCGTTGACAGCGGGTGCCGGGGCATTGACTCAAAGCACTGGAACTCATATTGTACCACGAC TCACACCTTTGTCAAGGCGCTGACCATGGATGGCAAGCAGGCTGCCTGGCGGTTTATCCGGATAGATACGGCCTGTG TGTGTGTGCTCAGCAGGAAGGCTGTGAGAAGAGCCTGA氨基酸序列是MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARYAGQTRNITY DPRLFKKRRLRSPRYLFSTQPPREAADTQDLDFEYGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSYCDSVSYWY⑶KTTA DIKGKEVMVLGEYNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWBSTCTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTA CYCYLSRKAYRRA-
3.如權(quán)利要求2所述基于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的重組人神經(jīng)生長因子的制備方法， 其特征是構(gòu)建pFastBac Dual+[rh0-NGF]重組質(zhì)粒的方法是在構(gòu)建pFastBac Dual質(zhì) 粒后，利用T4DNA Iigase連接構(gòu)建得到pFastBac Dual+[rh β-NGF]重組質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求1所述基于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的重組人神經(jīng)生長因子的制備方法， 其特征是所述步驟(2)的方法是(2. 1)取對數(shù)生長期的昆蟲細(xì)胞sf9，用含rhi3-NGF的穿梭質(zhì)粒Bacmid和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 試劑cellfection2000混合進(jìn)行轉(zhuǎn)染；(2. 2)轉(zhuǎn)染后的sf9細(xì)胞因Bacmid+[rhi3-NGF]質(zhì)粒的表達(dá)而產(chǎn)生昆蟲病毒顆粒，并使sf9細(xì)胞裂解；(2. 3)收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清，其中含有攜帶重組人神經(jīng)生長因子的昆蟲桿狀病毒顆粒及 少量重組人神經(jīng)生長因子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的重組人神經(jīng)生長因子的制備方法。它是人神經(jīng)生長因子的基因連接于表達(dá)載體Bacmid，構(gòu)建表達(dá)人神經(jīng)生長因子的重組表達(dá)載體；將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，收獲重組病毒顆粒，構(gòu)建表達(dá)人神經(jīng)生長因子的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)；再培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞，并用重組病毒感染，獲得大量重組人神經(jīng)生長因子。該方法能工業(yè)化生產(chǎn)重組人神經(jīng)生長因子。按照本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)和方法可以制備得到純度大于98％，生物比活性高于500000AU/mg的重組人神經(jīng)生長因子。
文檔編號C12N15/866GK101906423SQ20101023505
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月23日
發(fā)明者李佳楠, 湯華東 申請人:江漢大學(xué);武漢海特生物制藥股份有限公司