專(zhuān)利名稱(chēng)：一個(gè)編碼冰緣植物冷誘導(dǎo)蛋白基因及其在抗凍轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)編碼冰緣植物冷誘導(dǎo)蛋白基因及其在抗凍轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用， 特別是涉及一個(gè)編碼高山離子芥GRP(Glycine-rich RNA bindingprotein)基因及其在抗 凍轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
GRP基因編碼一類(lèi)受低溫誘導(dǎo)而產(chǎn)生的蛋白(冷誘導(dǎo)蛋白)，是主要的基因轉(zhuǎn)錄后 調(diào)節(jié)蛋白家族，特別是在植物非生物脅迫應(yīng)答中，這種蛋白發(fā)揮了重要功能(Mazzucotelli E et al 2008)。GRP是一種RNA結(jié)合蛋白，其分子結(jié)構(gòu)的特征是N-端含有一個(gè)保守的RNA 識(shí)別區(qū)域(RRM)，在C-端是富含甘氨酸的酸性區(qū)域，甘氨酸的含量可高達(dá)70%。GRP蛋白 是一種脅迫應(yīng)答蛋白，在脅迫下GRP作為一種分子伴侶與單鏈RNA結(jié)合，防止其重新自發(fā)折 疊。目前對(duì)擬南芥GRP基因家族中的AtRZ-Ia (C-端含有zinc-finger結(jié)構(gòu)的GRP)的研究 比較深入，AtRZ-Ia是一種冷誘導(dǎo)蛋白，轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)AtRZ-Ia的擬南芥已經(jīng)構(gòu)建成功(Kim Y0, et al. 2005, Kim Y0, et al. 2006)。在低溫脅迫下，與野生株相比，過(guò)表達(dá)AtRZ-Ia的 轉(zhuǎn)基因擬南芥出芽較早，播種苗生長(zhǎng)好。而且與野生株相比，過(guò)表達(dá)株的冷凍耐受性更好。高山離子芥是十字花科離子芥屬多年生植物，分布在高海拔亞高山草甸和礫石 質(zhì)山坡上。其環(huán)境條件的特點(diǎn)是氣候寒冷、空氣稀薄、輻射強(qiáng)、勁風(fēng)。本實(shí)驗(yàn)采樣地處 于43. 05N，86. 49E的烏魯木齊河源區(qū)流石碓，海拔3600 3900m。該地區(qū)年平均氣溫 在-5 -7°C之間，6 8月平均氣溫為3. 6°C，氣溫日差較大，是一種伴隨反復(fù)凍融的冰凍 環(huán)境。并且處于迎風(fēng)坡，流石碓中礫石保水性差，時(shí)常造成干旱脅迫。高山離子芥在外部形 態(tài)結(jié)構(gòu)和生態(tài)策略上沒(méi)有顯著的抗性特征，為了耐受長(zhǎng)期低溫、強(qiáng)紫外、大風(fēng)和生理干旱， 適應(yīng)這些不利的環(huán)境條件，勢(shì)必通過(guò)表達(dá)抗性基因來(lái)維持自身的生理代謝和生長(zhǎng)發(fā)育，以 避免或減輕嚴(yán)酷的環(huán)境脅迫的危害。高山離子芥與擬南芥同屬于十字花科，兩者的基因組具有很高的保守性。由于高 山離子芥處于冰緣環(huán)境，積累了適應(yīng)低溫的有益突變，所以克隆高山離子芥的GRP基因并 應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因作物中具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述，本發(fā)明的目的是提供一種編碼冰緣植物冷誘導(dǎo)蛋白基因及其編碼產(chǎn) 物；本發(fā)明的另一目的提供編碼冰緣植物冷誘導(dǎo)蛋白基因在抗凍轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用。(1) 一種編碼冰緣植物高山離子芥GRP (Chorispora bungeana GRP, ChGRP)冷誘 導(dǎo)蛋白基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示1)序列表中序列1的DNA序列；ATGGCGTCCGCAGATGTTGAGTTCAGGTGCTTCGTTGGCGGTCTAGCCTGGGCCACTGATGACAGAGCTCTCGAGACTGCATTCTCCCAGTACGGCGACGTTGTTGATTCCAAGATCATTAACGACCGTGAG
ACCGGAAGATCAAGGGGATTTGGATTCGTCACATTCAAGGACGAGAAATCCATGAAAGACGCCATT
GAGGGAATGAACGGACAAGATCTCGATGGTCGCAGCATCACTGTGAACGAGGCTCAGTCCCGTGGAAGCGGTGGCGGAGGTGGTGGCCGTGGAGGCGGCGGTGGTGGATACCGCAGCGGTGGAGGCGGTGGCTATGGAGGTGGTGGTGGAAGTTACGGAGGCGGTGGAGGTAGACGCGAGGGTGGATACAGCGGCGGTGGTGGAGGCTACCCCTCAAGAGGAGGTGGCGGAGGAGGTTACGGTGGTGGTGGTGGCCGACGTGAGGGTGGATACGGAGGTGGTGAAAGTGGTGGATACGGAGGAAGCGGTGGAGGTGGAGGCGGATGGTAA。(2) 一種由序列表中序列1的DNA序列所述的核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)，它具有 序列表中序列2的氨基酸殘基序列。2)序列表中序列2的氨基酸序列MASADVEFRCFVGGLAWATDDRALETAFSQY⑶VVDSKIINDRETGRSRGFGFVTFKDEKSMKDAIEGMNGQDLDGRSITVNEAQSRGSGGGGGGRGGGGGGYRSGGGGG
YGGGGGSYGGGGGRREGGYSGGGGGYPSRGGGGGGYGGGGGRREGGYGGGESGGYGGSGGGGGGW。本發(fā)明中的GRP基因和擬南芥的DNA序列具有90%以上同源性(圖1)，且編碼相 同功能蛋白質(zhì)，蛋白序列的同源性在80%以上(圖2)。本發(fā)明序列表1的DNA序列有528個(gè)堿基組成，編碼序列表2中由176個(gè)氨基酸 殘基組成的蛋白質(zhì)序列。含有本發(fā)明基因CbGRP的表達(dá)載體及細(xì)胞系也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。將序列 1基因的cDNA插入植物表達(dá)載體pBI121 (Clontech公司)的CAMV35S啟動(dòng)子下游的BamHI/ Xba I之間，得到重組表達(dá)載體pBI121-CbGRP(其圖譜如圖1所示)，用凍融法(《植物基因 工程》，王關(guān)林主編)將重組載體pBI121-CbGRP轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌LBA4404 (Invitrogen公 司)中。含有重組質(zhì)粒pBI121-CbGRP的根瘤農(nóng)桿菌LBA4404侵染煙草葉盤(pán)，葉盤(pán)在過(guò)夜培 養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期農(nóng)桿菌菌液中浸6-9秒種后，置于培養(yǎng)基上共培養(yǎng)，待菌株在葉盤(pán)周?chē)?長(zhǎng)至肉眼可見(jiàn)菌落時(shí)再轉(zhuǎn)移到含有抑菌劑的培養(yǎng)基中除去農(nóng)桿菌，同時(shí)在該培養(yǎng)基中加入 抗生素進(jìn)行轉(zhuǎn)化體選擇，3 4周培養(yǎng)可獲得轉(zhuǎn)化的再生植株。轉(zhuǎn)基因植株的冷凍耐受性實(shí)驗(yàn)。借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，分析了 CbGRP基因在組 成型過(guò)表達(dá)時(shí)對(duì)煙草植株抗凍性的影響。CbGRP轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性煙草植株，在MSIII (KanlOOmg/ L+Cef500mg/L)中繼代培養(yǎng)，每罐放4個(gè)植株。同時(shí)在另一培養(yǎng)罐中接種4個(gè)非轉(zhuǎn)基因煙草 繼代培養(yǎng)植株。同時(shí)置25°C光照培養(yǎng)。至長(zhǎng)出2片葉片。兩罐同時(shí)進(jìn)行冷處理。冷處理程 序0°C 24h，-4°C 24h，恢復(fù)25°C光照培養(yǎng)，培養(yǎng)15天后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片長(zhǎng)大，面 積從0.41 士0.03cm2生長(zhǎng)至1.03士0.04cm2，ρ < 0. 05，二者有顯著性差異。而非轉(zhuǎn)基因植 株葉片面積基本不變，由0. 39士0. 06cm2,生長(zhǎng)至0. 42士0. 07cm2, ρ > 0. 05，二者無(wú)顯著性差 異。說(shuō)明，與非轉(zhuǎn)基因植株相比，轉(zhuǎn)基因植株有較高的冷凍耐受性(見(jiàn)圖2)。


圖1為表達(dá)載體的構(gòu)建圖譜。圖2為對(duì)照和轉(zhuǎn)基因植株抗凍的比較。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明下述的實(shí)施例中，所用的實(shí)驗(yàn)材料為高山離子芥(C.bimgeana)和煙草 (Nicotiana tabacum)。實(shí)施例1.高山離子芥GRP基因序列的克隆高山離子芥采樣。擬定候選標(biāo)準(zhǔn)是無(wú)分泌蠟質(zhì)的腺體、無(wú)表皮絨毛、無(wú)角質(zhì)層加 厚；利用采集杖挖掘冰川附近的高山離子芥植物，用聚乙烯袋收集帶土植株，運(yùn)輸時(shí)去掉聚 乙烯袋移栽到塑料泡沫運(yùn)輸箱內(nèi)。利用RNA提取分離試劑盒(Trizol GibcoBRL)分離高山離子芥葉片中總RNA。其 具體方法是收集高山離子芥材料lOOmg，立即置于液氮中研磨，加入Iml Trizol試劑，充 分混勻；室溫放置5min ；加入0. 2ml新鮮氯仿，劇烈振搖15s，室溫溫育3min ；4°C，12000g離 心15min ；上清水相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1. 5ml離心管中，加入0. 5ml異丙醇沉淀RNA ；RNA沉淀 用Iml 75%乙醇洗滌后溶于適量DEPC處理過(guò)的水中，-70°C保存?zhèn)溆?。根?jù)生物信息學(xué)提供的序列資料設(shè)計(jì)以下引物5，端引物TACTCTAGAATGGCGTCCGCAGATGTT (其中劃線序列為 Xba I 位點(diǎn))；3，端引物:AATAGGATCCCCATCCGCCTCCACCTCC,(其中劃線序列為 BamH I 位點(diǎn))。通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到CbGRP的cDNA序列，具體方法是依據(jù)Plant RT-PCRKit 2. 01 (TaKaRa ,Japan)的用戶(hù)手冊(cè)進(jìn)行。1-2 μ g總RNA (大約1-2 μ 1)，和Kit的各種反轉(zhuǎn)錄 試劑混合(MgCl2 4μ 1 ;10XRNA PCR Buffer 2 μ 1 ；RNaseInhibitor 0. 5 μ 1 ；RNase free Water 8. 5 μ 1 ；dNTP Mixture 2 μ 1 ；ReverseTranscriptase 1 μ 1 ；Oligo dT-Adaptor Ιμ )。混勻后，42°C 30min ;99°C 5min ;5°C 5min，完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。吸取2μ1反轉(zhuǎn)錄產(chǎn) 物，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)94°C 2min后進(jìn)入擴(kuò)增程序94°C lmin、62°C lmin、72°C lmin， 30個(gè)循環(huán)后，72°C 7min。擴(kuò)增得到的CbGRPcDNA序列自起始密碼子到終止密碼子總長(zhǎng)528 堿基，編碼176個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量16. 7kD，等電點(diǎn)5. 43。2、CbGRP基因的表達(dá)模式比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，CbGRP在高山離子芥冷適應(yīng)過(guò)程中是積累的。Western-blotting雜交表明，CbGRP在高山離子芥冷適應(yīng)過(guò)程中在根，莖，葉中都 是積累的，無(wú)組織表達(dá)特異性。Quantitative real-time RT PCR試驗(yàn)表明，CbGRP的mRNA的轉(zhuǎn)錄在高山離子芥 冷適應(yīng)過(guò)程中是升高的。2. 1.蛋白組學(xué)研究方法2. 1. 1高山離子芥冷適應(yīng)的處理挑選非缺刻緣型高山離子芥再生植株，高度約4厘米，分為兩組，一組置于4°C光 照培養(yǎng)箱，光照16/8hrs，冷適應(yīng)30天，另一組置于20°C光照培養(yǎng)箱，光照16/8hrs，培養(yǎng)30 天，作為對(duì)照組。2. 1. 2高山離子芥冷適應(yīng)葉片蛋白的提取及2-D電泳樣品的處理分別取冷適應(yīng)和對(duì)照植株的葉片500mg，加液氮研磨，分別加入300ul的細(xì)胞裂解 緩沖液(50mM Tris,pH8. 0,2mM EDTA, 50mMNaCl, and proteaseinhibitor cocotail)混勻，
5冰浴20min, 12000rpmX 30min,吸取上清 300ul。按操作說(shuō)明，用 cleaning up Kit (Bio-RAD) 處理提取上清。2. 1. 3 2-D 電泳2. 1. 3. 1 等點(diǎn)聚焦將1.3 cleaning up kit處理提取的沉淀中加入等點(diǎn)聚焦樣品緩沖液(7Mure a ,2Mthiourea, 0. 05 % dodecylmaltoside,4 % 3-[ (3-cholamido-propyl)-dimethylammonio]-1-pro pane sulfonate,20mMTris,20mM DTT,0.5 % IPG buffer, and 0.001 % bromophenol blue)350ul，用酚試劑法測(cè)定蛋白濃度，等點(diǎn)聚焦上樣蛋白量為600ug/350ul/膠條。等 點(diǎn)聚焦膠條為PH3-10，17cm固定化膠條。上樣方法為聚焦盤(pán)上樣法。在PROTEIN IEF cell (BioRad)上進(jìn)行等點(diǎn)聚焦。等點(diǎn)聚焦程序:50V主動(dòng)水化16hr ；250V,快速30min ； 1000V 快速 Ihr ； 10，000V 線性 5hr ； 10，000V 快速，直到 60，000V/hr ；500V 快速保存。等點(diǎn)聚焦完成后，將膠條置于膠條盤(pán)中，加入6ml的膠條平衡緩沖液I (50mMTris， ρΗ8·8，6Μ urea, 30% glycerol, 2% SDS, and 20mM DTT)，室溫?fù)u床 10_15min，取出膠條平衡 緩沖液 I，加入膠條平衡緩沖液 II(50mMTris, ρΗ8· 8，6M urea, 30% glycerol, 2% SDS, and 20mM iodoacetamide)，室溫?fù)u床15min。倒出膠條平衡緩沖液II。將膠條浸入電泳緩沖液 中，輕輕漂洗，置于干凈的濾紙上。2. 1. 3. 2 SDS-PAGE 電泳配制12%的SDS-PAGE膠，將等電聚焦膠條置于SDS-PAGE膠的上方，加5ml 1 %的 低溶點(diǎn)瓊脂糖，用特制鑷子將等電聚焦膠條推下與SDS-PAGE膠上沿緊密接觸，直到低溶點(diǎn) 瓊脂糖凝固，開(kāi)始電泳，電泳程序，70V，45mins，145V，8hrs。2. 1. 3. 3考馬斯亮蘭染色SDS-PAGE 電泳結(jié)束后，用 1 % 的 Coommassie brilliant blue R250(l % Coommassie brilliant blue R250,10 % HAc, 30 % methol)染色 lhr，脫色液(10 % HAc， 30% methol)脫色至背景無(wú)色。2. 1.3.4 2-D膠的表達(dá)分析PAGE凝膠用凝膠成像儀成像，用Imaginmaster 2D Elite software軟件進(jìn)行分 析。2. 1. 3. 5目的蛋白點(diǎn)的挖取和處理根據(jù)軟件分析結(jié)果，用毛細(xì)管吸取表達(dá)升高最大的4個(gè)點(diǎn)，放入EP管加入20ul 5% HAc, -80°C保存，送相關(guān)單位進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定。2. 1. 3. 6 MALDI-TOF-MS 和數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)由上?；瞪锛夹g(shù)公司，復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)生物中心，中國(guó)國(guó)家蛋白質(zhì)組學(xué)中心進(jìn) 行質(zhì)譜測(cè)定和數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)。質(zhì)譜結(jié)果在http //www, matrixscience. com上通過(guò)Mascot序 列查尋程序與NCBInrdatabase進(jìn)行比對(duì)。 2. 2. ffestern-blottong 雜交 SDS-PAGE 電泳結(jié)束后，將凝膠按照標(biāo)準(zhǔn)程序(Sambrook J,Fritsch EF,ManiatisT 1989)進(jìn)行Wester-blotting分析。特異性抗體為自行制備的CbGRP多克隆抗體，按一定稀 釋度稀釋后使用。第二抗體為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(Sigma)，按標(biāo)示濃度使用。顯色用ECL(Amersham)顯色劑。2. 3. Quantitative real-time RT-PCR冷適應(yīng)0.5(1、1(1、2(1、3(1、7(1、10(1、20(1、30(1高山離子芥葉片2(^，用111^201試劑研磨 提取RNA，變性瓊脂糖電泳確認(rèn)RNA的完整性。用PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) (Takara)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。目的基因的定量real-time PCR用SYBR Premix EX Taq(Perfect Real Time)(Takara) ^t iCycler iQ Real-time PCR system(Bio-RAD) 上進(jìn)行。Real-time RT-PCR 所用 CbGRP 特異性引物為 CbGRPRTF(5 ‘ -AGGGGATTTGGATTC GTCAC-3 ‘和 CbGRPRTR (5 ‘ -GGACTGAGCCTCGTTCACAG-3 ‘ )。Real-Time PCR 程序?yàn)閍 95°C 10sec，b(95°C 5sec-60°C 20sec)，b循環(huán)40次。內(nèi)控用高山離子芥actin基因特異性 引物 CbActinRTF (5 ‘ -ATACGCTCTTCCACACGCTATTC-3 ‘)和 CbActinRTR (5 ‘ -TCACGATTTCAC GCTCTGCT-3‘ )。RT-PCR所用 RNA 量與 CbGRP 相同。Real Time PCR程序?yàn)閍 95°C IOsec, b (95°C 5sec-59°C 20sec)，b 循環(huán) 40 次。3. CbGRP在煙草中過(guò)表達(dá)表型觀察3. lpBI121_CbGRP重組質(zhì)粒的構(gòu)建將CbGRP的全長(zhǎng)編碼序列亞克隆到PBI121的BamH I/Xba I (見(jiàn)圖1)，轉(zhuǎn)化到大 腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，挑選4單克隆接種到LB(50ug/mlKan)中，堿裂解法提取質(zhì)粒， BamH I/Xba I雙酶切鑒定重組質(zhì)粒。3. 2 pBI 121-CbGRP 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 LBA4404 農(nóng)桿菌LBA4404農(nóng)桿菌在YEB(Rif+)平皿上畫(huà)線，挑取單克隆接種于YEB(Rif+)液體培 養(yǎng)液，28 °C搖床過(guò)夜，1 50轉(zhuǎn)接YEB(Rif+)，28°C搖床培養(yǎng)至0D600 = 0.5。吸取1. 5ml 于1.5ml離心管，冰浴lOmin，12000rpm離心lmin，棄上清，沉淀懸于1. 5ml0. 5MNaCl, 冰浴20min，12000rpm離心lmin，棄上清，沉淀懸于100ul20mM CaCl2，用于轉(zhuǎn)化。2ul pBI 121-CbGRP重組質(zhì)粒加入到50ul農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，放入液氮中5min，然 后立即放入37°C水浴5min，取出離心管，加入0. 5mlYEB，28°C搖床5小時(shí)。取出菌液涂于 YEB (Rif+Kan+)平皿上，挑取單克隆接種于YEB (Rif+Kan+)液體培養(yǎng)基2ml中，28°C搖床過(guò) 夜，菌體為模板PCR鑒定轉(zhuǎn)化陽(yáng)性菌。3. 3轉(zhuǎn)化pBI121-CbGRP重組質(zhì)粒的LBA4404農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染煙草葉盤(pán)挑取轉(zhuǎn)化pBI121-CbGRP重組質(zhì)粒的LBA4404農(nóng)桿菌單克隆，接中于 YEB (Rif+Kan) 2ml 中，28 °C 搖床過(guò)夜，1 50 轉(zhuǎn)接同一 YEB 培養(yǎng)液，28 °C 培養(yǎng)至 0D600 = 0. 5， 用YEB稀釋至0D600 = 0. 2，將菌液倒入無(wú)菌平皿中待用。煙草無(wú)菌試管苗，培養(yǎng)4周，挑取無(wú)菌葉片，用無(wú)菌6mm打孔器鑿成圓盤(pán)，浸 入菌液中，浸泡3分鐘，取出葉盤(pán)，在無(wú)菌濾紙上吸去附著的菌液，接種分化培養(yǎng)基 MSI (MS+IAA1. 0mg/L+KT2. Omg/L)，28 °C暗培養(yǎng)3天。3天后，將葉盤(pán)轉(zhuǎn)接到選擇培養(yǎng)基 MSII(MS+IAA1. 0mg/L+KT2. 0mg/L+Kanl00mg/L+Cef500mg/L)，25 °C 光照(12h/d)培養(yǎng) 2-3 周。選擇培養(yǎng)2-3周后，轉(zhuǎn)化葉盤(pán)將分化出抗性不定芽，當(dāng)芽長(zhǎng)到Icm左右時(shí)，切下，接種到 MSIII (Kanl00mg/L+Cef500mg/L)，25°C光照(12h/d)培養(yǎng) 3 周，長(zhǎng)成煙草再生植株。3. 4轉(zhuǎn)基因再生植株的鑒定3. 4. 1轉(zhuǎn)基因植株基因組PCR鑒定用CTAB法分離轉(zhuǎn)基因再生植株的總基因組DNA (Clark MS)。用CbGRP表達(dá)引物，以轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增CbGRP基因。用未轉(zhuǎn)基因煙草植株DNA為陰性 對(duì)照。3. 4. 2轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)CbGRP蛋白的Western-blot鑒定從轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片、根、莖中提取可溶性蛋白。3. 4. 3轉(zhuǎn)基因煙草植株報(bào)告基因的表達(dá)分析-GUS活性組織化學(xué)定位轉(zhuǎn)基因煙草植株浸泡于底物緩沖液中(lmmol/L X-gluc于lOOmmol/L磷酸緩沖液 (ρΗ7· 0)，IOmmol/L EDTA, 3mmol/L鐵氰化鉀，3mmol/L亞鐵氰化鉀)，真空抽氣5min,置于 37°C過(guò)夜，將組織轉(zhuǎn)入95%乙醇浸泡除去葉綠素。4. CbGRP轉(zhuǎn)基因植株的冷凍耐受性實(shí)驗(yàn)借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，分析了 CbGRP基因在組成型過(guò)表達(dá)時(shí)對(duì)煙草植株抗凍性 的影響。CbGRP轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性煙草植株，在MSIII (Kanl00mg/L+Cef500mg/L)中繼代培養(yǎng)，每 罐放4個(gè)植株。同時(shí)在另一培養(yǎng)罐中接種4個(gè)非轉(zhuǎn)基因煙草繼代培養(yǎng)植株。同時(shí)置25°C 光照培養(yǎng)。至長(zhǎng)出2片葉片。兩罐同時(shí)進(jìn)行冷處理。冷處理程序…！^處，^??？處，恢復(fù) 25°C光照培養(yǎng)，培養(yǎng)15天后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片長(zhǎng)大，面積從0. 41 士0. 03cm2生長(zhǎng) 至1.03士0.04cm2，ρ < 0. 05，二者有顯著性差異。而非轉(zhuǎn)基因植株葉片面積基本不變，由 0. 39士0. 06cm2，生長(zhǎng)至0. 42士0. 07cm2,ρ > 0. 05，二者無(wú)顯著性差異。說(shuō)明，與非轉(zhuǎn)基因植 株相比，轉(zhuǎn)基因植株有較高的冷凍耐受性(見(jiàn)圖2)。以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明CbGRP基因可以 提高轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)煙草植株的冷凍耐受性。
權(quán)利要求
一種編碼冰緣植物高山離子芥冷誘導(dǎo)蛋白基因，其核苷酸序列如下ATGGCGTCCGCAGATGTTGAGTTCAGGTGCTTCGTTGGCGGTCTAGCCTGGGCCACTGATGACAGAGCTCTCGAGACTGCATTCTCCCAGTACGGCGACGTTGTTGATTCCAAGATCATTAACGACCGTGAGACCGGAAGATCAAGGGGATTTGGATTCGTCACATTCAAGGACGAGAAATCCATGAAAGACGCCATTGAGGGAATGAACGGACAAGATCTCGATGGTCGCAGCATCACTGTGAACGAGGCTCAGTCCCGTGGAAGCGGTGGCGGAGGTGGTGGCCGTGGAGGCGGCGGTGGTGGATACCGCAGCGGTGGAGGCGGTGGCTATGGAGGTGGTGGTGGAAGTTACGGAGGCGGTGGAGGTAGACGCGAGGGTGGATACAGCGGCGGTGGTGGAGGCTACCCCTCAAGAGGAGGTGGCGGAGGAGGTTACGGTGGTGGTGGTGGCCGACGTGAGGGTGGATACGGAGGTGGTGAAAGTGGTGGATACGGAGGAAGCGGTGGAGGTGGAGGCGGATGGTAA；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；3)該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第1到第526位堿基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種編碼冰緣植物高山離子芥冷誘導(dǎo)蛋白基因，其特征在于 所述具有序列表中序列1的DNA序列離子芥冷誘導(dǎo)蛋白基因表達(dá)載體為pBI121-GbGRP。
3.一種由序列表中序列1的DNA序列所述的核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)，且具有氨基 酸殘基序列如下MASADVEFRCFVGGLAWATDDRALETAFSQYGDVVDSKIINDRETGRSRGFGFVTFKDEKSMKDAIEGMNGQ DLDGRSITVNEAQSRGSGGGGGGRGGGGGGYRSGGGGGYGGGGGSYGGGGGRREGGYSGGGGGYPSRGGGGGGYGGG GGRREGGYGGGESGGYGGSGGGGGGff。
4.將含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體pBI121-GbGRP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，利用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因煙草在抗寒育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)編碼冰緣植物高山離子芥冷誘導(dǎo)蛋白基因及其在煙草抗凍轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用。CbGRP基因?yàn)橄铝泻塑账嵝蛄兄?)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。由上述基因CbGRP編碼的蛋白質(zhì)，具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。該基因可被冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，并能提高轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)煙草植株的抗凍能力，對(duì)于培育抗凍的作物品種具有重要的理論及實(shí)際意義。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101979577SQ20101023498
公開(kāi)日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者向云, 孫正龍, 安黎哲, 張華 , 白慕群, 盛紅梅, 陳書(shū)燕 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)