專利名稱：作為依賴于rna的rna病毒聚合酶的抑制劑的核苷衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核苷化合物及其某些衍生物、它們的合成、以及它們作為依賴于RNA的RNA病毒聚合酶的抑制劑的用途。本發(fā)明化合物是依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制的抑制劑，可用于治療依賴于RNA的RNA病毒感染。它們作為丙型肝炎病毒(HCV)NS5B聚合酶的抑制劑、作為HCV復(fù)制的抑制劑以及用于治療丙型肝炎感染特別有用。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)感染是導(dǎo)致大量受感染個(gè)體，估計(jì)占世界人口的2-15％的人患上慢性肝病，如肝硬化和肝細(xì)胞癌的主要健康問(wèn)題。據(jù)美國(guó)疾病控制中心的數(shù)據(jù)，估計(jì)僅美國(guó)就有450萬(wàn)受感染人群。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，全世界有超過(guò)2億受感染個(gè)體，每年至少有3-4百萬(wàn)人群被感染。感染后，大約20％的人可以清除病毒，而其余的人此后將終身攜帶HCV。10％到20％慢慢受感染的個(gè)體最后將發(fā)展成毀壞肝的肝硬化或癌癥。病毒性疾病通過(guò)被污染的血液和血液產(chǎn)品、被污染的針頭非腸道傳染或者經(jīng)由性途徑直接從受感染的母體或攜帶病原的母體傳染給其后代。目前對(duì)于HCV感染的治療限制于只用重組體干擾素-α或者與核苷類(lèi)似物利巴韋林結(jié)合進(jìn)行的免疫療法，該療法具有有限的臨床效果。而且，沒(méi)有確定的HCV疫苗。所以，迫切需要可有效對(duì)抗慢性HCV感染的改進(jìn)的治療劑。綜述治療HCV感染的現(xiàn)有技術(shù)水平，參考了下列資料B.Dymock等，″Novel approaches to the treatment of hepatitis C virus infection(治療丙型肝炎病毒感染的新方法)″，Antiviral Chemistry & Chemotherapy，1179-96(2000)；H.Rosen等，″Hepatitis C viruscurrent understandingand prospects for future therapies(丙型肝炎病毒對(duì)現(xiàn)狀的認(rèn)識(shí)和對(duì)將來(lái)治療的展望)″，Molecular Medicine Today，5393 399(1999)；D.Moradpour等，″Current and evolving therapies for hepatitis C(治療丙型肝炎的現(xiàn)狀和進(jìn)展)″，European J.Gastroenterol.Hepatol.，111189-1202(1999)；R.Bartenschlager，″Candidate Targets for Hepatitis C Virus-Specific Antiviral Therapy(丙型肝炎病毒-特異性抗病毒療法的候選目標(biāo))″，Intervirology，40378-393(1997)；G.M.Lauer和B.D.Walker，″Hepatitis C Virus Infection(丙型肝炎病毒感染)″，N.Engl.J.Med.，34541-52(2001)；B.W.Dymock，″Emerging therapies for hepatitisC virus infection(丙型肝炎病毒感染的新興療法)″，Emerging Drugs，613-42(2001)；以及C.Crabb，″Hard-Won Advances Spark Excitementabout Hepatitis C″，Science506-507(2001)；將所有這些文獻(xiàn)的內(nèi)容全文引用結(jié)合進(jìn)本文。
已采取了治療HCV的不同方法，包括抑制病毒的絲氨酸蛋白酶(NS3蛋白酶)、解旋酶和依賴于RNA的RNA聚合酶(NS5B)以及發(fā)展疫苗。
HCV病毒體是具有約9600個(gè)堿基的單一寡核糖核苷酸基因組序列的有包膜正鏈RNA病毒，所述基因組序列編碼約3010個(gè)氨基酸的多蛋白。HCV基因的蛋白產(chǎn)品由結(jié)構(gòu)蛋白C、E1和E2以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS2、NS3、NS4A和NS4B、NS5A和NS5B構(gòu)成。人們相信非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白可以提供病毒復(fù)制的催化機(jī)器。NS3蛋白酶從多蛋白鏈釋放NS5B，這是依賴于RNA的RNA聚合酶。由在HCV復(fù)制循環(huán)中作為模板的單鏈病毒的RNA合成雙鏈RNA需要HCV NS5B聚合酶。因此，NS5B聚合酶被認(rèn)為是HCV復(fù)制復(fù)合體中必不可少的成分[參見(jiàn)K.Ishi等，″Expression of Hepatitis C Virus NS5B ProteinCharacterization of Its RNA Polymerase Activity and RNA Binding(丙型肝炎病毒NS5B蛋白的表達(dá)其RNA聚合酶活性和RNA結(jié)合的特性描述)″，Hepatology，291227-1235(1999)和V.Lohmann等，″Biochemical and Kinetic Analyses of NS5B RNA-Dependent RNAPolymerase of the Hepatitis C Virus(丙型肝炎病毒的NS5B依賴于RNA的RNA聚合酶的生物化學(xué)和動(dòng)力學(xué)分析)″，Virology.249108-118(1998)]。抑制HCV NS5B聚合酶可防止形成雙鏈HCV RNA，由此構(gòu)建一條開(kāi)發(fā)HCV特異性抗病毒療法的頗具吸引力的途徑。
現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的核苷化合物及其某些衍生物是依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制，特別是HCV復(fù)制的有效的抑制劑。這些核苷化合物的5’-三磷酸酯衍生物是依賴于RNA的RNA病毒聚合酶，特別是HCV NS5B聚合酶的抑制劑。因此，本發(fā)明的核苷化合物及其衍生物可用于治療依賴于RNA的RNA病毒感染，特別是HCV感染。
因此，本發(fā)明的目的在于提供核苷化合物及其某些衍生物，它們可用作依賴于RNA的RNA病毒聚合酶的抑制劑，特別是用作HCVNS5B聚合酶的抑制劑。
本發(fā)明的另一目的在于提供核苷化合物及其某些衍生物，它們可用作依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制的抑制劑，特別是用作丙型肝炎病毒復(fù)制的抑制劑。
本發(fā)明的另一目的在于提供核苷化合物及其某些衍生物，它們可用于治療依賴于RNA的RNA病毒感染，特別是用于治療HCV感染。
本發(fā)明的另一目的在于提供包含本發(fā)明的核苷化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
本發(fā)明的另一目的在于提供包含本發(fā)明的核苷化合物及其衍生物的藥物組合物，該組合物可用作依賴于RNA的RNA病毒聚合酶的抑制劑，特別是用作HCV NS5B聚合酶的抑制劑。
本發(fā)明的另一目的在于提供包含本發(fā)明的核苷化合物及其衍生物的藥物組合物，該組合物可用作依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制的抑制劑，特別是用作HCV復(fù)制的抑制劑。
本發(fā)明的另一目的在于提供包含本發(fā)明的核苷化合物及其衍生物的藥物組合物，該組合物可用于治療依賴于RNA的RNA病毒感染，特別是用于治療HCV感染。
本發(fā)明的另一目的在于提供藥物組合物，該組合物包含本發(fā)明的核苷化合物及其衍生物和其它有效對(duì)抗依賴于RNA的RNA病毒，特別是對(duì)抗HCV的試劑。
本發(fā)明的另一目的在于提供抑制依賴于RNA的RNA病毒聚合酶，特別是抑制HCV NS5B聚合酶的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供抑制依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制，特別是抑制HCV復(fù)制的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供治療依賴于RNA的RNA病毒感染，特別是治療HCV感染的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供與其它有效對(duì)抗依賴于RNA的RNA病毒的試劑結(jié)合治療依賴于RNA的RNA病毒感染的方法，特別是與其它有效對(duì)抗HCV的試劑結(jié)合治療HCV感染的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供用作藥物的核苷化合物及其某些衍生物和它們的藥物組合物，所述藥物用于抑制依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制和/或治療依賴于RNA的RNA病毒感染，特別是用于抑制HCV復(fù)制和/或治療HCV感染。
本發(fā)明的另一目的在于提供本發(fā)明的核苷化合物及其某些衍生物和它們的藥物組合物在制造藥物中的用途，所述藥物用于抑制依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制和/或治療依賴于RNA的RNA病毒感染，特別是用于抑制HCV復(fù)制和/或治療HCV感染。
通過(guò)下面的詳細(xì)描述，這些和其它目的將是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明概述本發(fā)明涉及所示立體化學(xué)構(gòu)型的結(jié)構(gòu)式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，
其中R1為C2-4鏈烯基、C2-4炔基或C1-4烷基，其中烷基為未取代的或者被羥基、氨基、C1-4烷氧基、C1-4烷硫基或1-3個(gè)氟原子取代；R2為氫、氟、羥基、巰基、C1-4烷氧基或C1-4烷基；或者R1和R2同與其相連的碳原子一起形成任選含有一個(gè)選自O(shè)、S和NC0-4烷基的雜原子的3-6元飽和單環(huán)系；R3和R4各自獨(dú)立選自氫、氰基、疊氮基、鹵素、羥基、巰基、氨基、C1-4烷氧基、C2-4鏈烯基、C2-4炔基和C1-4烷基，其中烷基為未取代的或者被羥基、氨基、C1-4烷氧基、C1-4烷硫基或1-3個(gè)氟原子取代；R5為氫、C1-10烷基羰基、P3O9H4、P2O6H3或P(O)R13R14；R6和R7各自獨(dú)立為氫、甲基、羥基甲基或氟甲基；R8為氫、C1-4烷基、C2-4炔基、鹵素、氰基、羧基、C1-4烷氧基羰基、疊氮基、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、羥基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6烷基磺酰基、(C1-4烷基)0-2氨基甲基或C4-6環(huán)狀雜烷基，它們是未取代的或者被1-2個(gè)獨(dú)立選自鹵素、羥基、氨基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的基團(tuán)取代；R9為氫、氰基、硝基、C1-3烷基、NHCONH2、CONR12R12、CSNR12R12、COOR12、C(＝NH)NH2、羥基、C1-3烷氧基、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、鹵素、(1，3-噁唑-2-基)、(1，3-噻唑-2-基)或(咪唑-2-基)；其中烷基為未取代的或者被1-3個(gè)獨(dú)立選自鹵素、氨基、羥基、羧基和C1-3烷氧基的基團(tuán)取代；R10和R11各自獨(dú)立為氫、羥基、鹵素、C1-4烷氧基、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C3-6環(huán)烷基氨基、二(C3-6環(huán)烷基)氨基或C4-6環(huán)狀雜烷基，它們是未取代的或者被1-2個(gè)獨(dú)立選自鹵素、羥基、氨基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的基團(tuán)取代；各R12獨(dú)立為氫或C1-6烷基；并且R13和R14各自獨(dú)立為羥基、OCH2CH2SC(＝O)C1-4烷基、OCH2O(C＝O)OC1-4烷基、NHCHMeCO2Me、OCH(C1-4烷基)O(C＝O)C1-4烷基、 或 條件是當(dāng)R1為β-甲基且R4為氫或者R4為β-甲基且R1為氫，R2和R3為α-羥基，R10為氨基，R5、R6、R7、R8和R11為氫時(shí)，R9不為氰基或CONH2。
式I化合物可用作依賴于RNA的RNA病毒聚合酶，特別是HCVNS5B聚合酶的抑制劑。它們也是依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制，特別是HCV復(fù)制的抑制劑，可用于治療依賴于RNA的RNA病毒感染，特別是用于治療HCV感染。
也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的還有只含有所述化合物或者含有所述化合物和其它可有效對(duì)抗依賴于RNA的RNA病毒，特別是對(duì)抗HCV的試劑的藥物組合物，以及抑制依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制的方法和治療依賴于RNA的RNA病毒感染的方法。
本發(fā)明詳述本發(fā)明涉及所示立體化學(xué)構(gòu)型的結(jié)構(gòu)式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，
其中R1為C2-4鏈烯基、C2-4炔基或C1-4烷基，其中烷基為未取代的或者被羥基、氨基、C1-4烷氧基、C1-4烷硫基或1-3個(gè)氟原子取代；R2為氫、氟、羥基、巰基、C1-4烷氧基或C1-4烷基；或者R1和R2同與其相連的碳原子一起形成任選含有一個(gè)選自O(shè)、S和NC0-4烷基的雜原子的3-6元飽和單環(huán)系；R3和R4各自獨(dú)立選自氫、氰基、疊氮基、鹵素、羥基、巰基、氨基、C1-4烷氧基、C2-4鏈烯基、C2-4炔基和C1-4烷基，其中烷基為未取代的或者被羥基、氨基、C1-4烷氧基、C1-4烷硫基或1-3個(gè)氟原子取代；R5為氫、C1-10烷基羰基、P3O9H4、P2O6H3或P(O)R13R14；R6和R7各自獨(dú)立為氫、甲基、羥基甲基或氟甲基；R8為氫、C1-4烷基、C2-4炔基、鹵素、氰基、羧基、C1-4烷氧基羰基、疊氮基、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、羥基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6烷基磺?；?、(C1-4烷基)0-2氨基甲基或C4-6環(huán)狀雜烷基，它們是未取代的或者被1-2個(gè)獨(dú)立選自鹵素、羥基、氨基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的基團(tuán)取代；R9為氫、氰基、硝基、C1-3烷基、NHCONH2、CONR12R12、CSNR12R12、COOR12、C(＝NH)NH2、羥基、C1-3烷氧基、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、鹵素、(1，3-噁唑-2-基)、(1，3-噻唑-2-基)或(咪唑-2-基)；其中烷基為未取代的或者被1-3個(gè)獨(dú)立選自鹵素、氨基、羥基、羧基和C1-3烷氧基的基團(tuán)取代；R10和R11各自獨(dú)立為氫、羥基、鹵素、C1-4烷氧基、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C3-6環(huán)烷基氨基、二(C3-6環(huán)烷基)氨基或C4-6環(huán)狀雜烷基，它們是未取代的或者被1-2個(gè)獨(dú)立選自鹵素、羥基、氨基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的基團(tuán)取代；各R12獨(dú)立為氫或C1-6烷基；并且R13和R14各自獨(dú)立為羥基、OCH2CH2SC(＝O)C1-4烷基、OCH2O(C＝O)OC1-4烷基、NHCHMeCO2Me、OCH(C1-4烷基)O(C＝O)C1-4烷基、 或 條件是當(dāng)R1為β-甲基且R4為氫或者R4為β-甲基且R1為氫，R2和R3為α-羥基，R10為氨基，R5、R6、R7、R8和R11為氫時(shí)，R9不為氰基或CONH2。
式I化合物可用作依賴于RNA的RNA病毒聚合酶的抑制劑。它們也是依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制的抑制劑，可用于治療依賴于RNA的RNA病毒感染。
具有結(jié)構(gòu)式I的化合物的一個(gè)實(shí)施方案是結(jié)構(gòu)式II的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽， 其中R1為C1-3烷基，其中烷基為未取代的或者被羥基、氨基、C1-3烷氧基、C1-3烷硫基或1-3個(gè)氟原子取代；R2為羥基、氟或C1-3烷氧基；
R3為氫、鹵素、羥基、氨基或C1-3烷氧基；R5為氫、P3O9H4、P2O6H3或PO3H2；R8為氫、氨基或C1-4烷基氨基；R9為氫、氰基、甲基、鹵素或CONH2；并且R10和R11各自獨(dú)立為氫、鹵素、羥基、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基或C3-6環(huán)烷基氨基；條件是當(dāng)R1為β-甲基，R2和R3為α-羥基，R10為氨基，R5、R8和R11為氫時(shí)，R9不為氰基或CONH2。
結(jié)構(gòu)式I的化合物的第二個(gè)實(shí)施方案是結(jié)構(gòu)式II的化合物，其中R1為甲基、氟甲基、羥基甲基、二氟甲基、三氟甲基或氨基甲基；R2為羥基、氟或甲氧基；R3為氫、氟、羥基、氨基或甲氧基；R5為氫或P3O9H4；R8為氫或氨基；R9為氫、氰基、甲基、鹵素或CONH2；并且R10和R11各自獨(dú)立為氫、氟、羥基或氨基；條件是當(dāng)R1為β-甲基，R2和R3為α-羥基，R10為氨基，R5、R8和R11為氫時(shí)，R9不為氰基或CONH2。
可用作依賴于RNA的RNA病毒聚合酶的抑制劑的具有結(jié)構(gòu)式I的本發(fā)明化合物的例舉性而非限制性例子如下1.4-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-阿糖呋喃基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，2.4-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，3.4-甲基氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，4.4-二甲基氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，
5.4-環(huán)丙基氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，6.4-氨基-7-(2-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，7.4-氨基-7-(2-C-羥基甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，8.4-氨基-7-(2-C-氟甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，9.4-氨基-5-甲基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，10.4-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-羧酸，11.4-氨基-5-溴-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，12.4-氨基-5-氯-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，13.4-氨基-5-氟-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，14.2，4-二氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，15.2-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，16.2-氨基-4-環(huán)丙基氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，17.2-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮，18.4-氨基-7-(2-C-乙基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，19.4-氨基-7-(2-C，2-O-二甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，20.7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮，21.2-氨基-5-甲基-7-(2-C，2-O-二甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮，
22.4-氨基-7-(3-脫氧-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，23.4-氨基-7-(3-脫氧-2-C-甲基-β-D-阿糖呋喃基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，24.4-氨基-2-氟-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，25.4-氨基-7-(3-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，26.4-氨基-7-(3-C-甲基-β-D-呋喃木糖基(xylofuranosyl))-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，27.4-氨基-7-(2，4-二-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，和28.4-氨基-7-(3-脫氧-3-氟-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶；以及對(duì)應(yīng)的5’-三磷酸酯；或其藥學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明的進(jìn)一步的例子是選自下列的化合物1.4-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-阿糖呋喃基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，2.4-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，3.4-氨基-7-(2-C-氟甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，4.4-氨基-5-甲基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，5.4-氨基-5-溴-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，6.4-氨基-5-氯-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-咯并[2，3-d]嘧啶，7.4-氨基-5-氟-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，和8.4-氨基-7-(2-C，2-O-二甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，和對(duì)應(yīng)的5’-三磷酸酯；或其藥學(xué)上可接受的鹽。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷化合物可用作依賴于正義單鏈RNA的RNA病毒聚合酶的抑制劑，依賴于正義單鏈RNA的RNA病毒復(fù)制的抑制劑，和/或用于治療依賴于正義單鏈RNA的RNA病毒感染。在一類(lèi)實(shí)施方案中，依賴于正義單鏈RNA的RNA病毒是黃病毒科(Flaviviridae)病毒或小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)病毒。在該類(lèi)的亞類(lèi)中，小核糖核酸病毒科病毒是鼻病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒或甲型肝炎病毒。在該類(lèi)的第二亞類(lèi)中，黃病毒科病毒選自丙型肝炎病毒、黃熱病毒、登革病毒、西尼羅病毒、日本腦炎病毒、班齊病毒和牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)。在該亞類(lèi)的子集中，黃病毒科病毒為丙型肝炎病毒。
本發(fā)明的另一方面涉及一種抑制依賴于RNA的RNA病毒聚合酶的方法，一種抑制依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制的方法，和/或一種治療需要這種治療的哺乳動(dòng)物的依賴于RNA的RNA病毒感染的方法，該方法包括給予哺乳動(dòng)物治療有效量的結(jié)構(gòu)式I的化合物。
在本發(fā)明的這一方面的實(shí)施方案中，依賴于RNA的RNA病毒聚合酶是依賴于正義單鏈RNA的RNA病毒。在一類(lèi)這種實(shí)施方案中，依賴于正義單鏈RNA的RNA病毒聚合酶是黃病毒科病毒聚合酶或小核糖核酸病毒科病毒聚合酶。在該類(lèi)的亞類(lèi)中，小核糖核酸病毒科病毒聚合酶是鼻病毒聚合酶、脊髓灰質(zhì)炎病毒聚合酶或甲型肝炎病毒聚合酶。在該類(lèi)的第二亞類(lèi)中，黃病毒科病毒聚合酶選自丙型肝炎病毒聚合酶、黃熱病毒聚合酶、登革病毒聚合酶、西尼羅病毒聚合酶、日本腦炎病毒聚合酶、班齊病毒聚合酶和牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)聚合酶。在該亞類(lèi)的子集中，黃病毒科病毒聚合酶為丙型肝炎病毒聚合酶。
在本發(fā)明的這一方面的第二實(shí)施方案中，依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制是依賴于正義單鏈RNA的RNA病毒復(fù)制。在一類(lèi)這種實(shí)施方案中，依賴于正義單鏈RNA的RNA病毒復(fù)制是黃病毒科病毒復(fù)制或小核糖核酸病毒科病毒復(fù)制。在該類(lèi)的亞類(lèi)中，小核糖核酸病毒科病毒復(fù)制是鼻病毒復(fù)制、脊髓灰質(zhì)炎病毒復(fù)制或甲型肝炎病毒復(fù)制。在該類(lèi)的第二亞類(lèi)中，黃病毒科病毒復(fù)制選自丙型肝炎病毒復(fù)制、黃熱病毒復(fù)制、登革病毒復(fù)制、西尼羅病毒復(fù)制、日本腦炎病毒復(fù)制、班齊病毒復(fù)制和牛病毒復(fù)制性腹瀉病毒復(fù)制。在該亞類(lèi)的子集中，黃病毒科病毒復(fù)制為丙型肝炎病毒復(fù)制。
在本發(fā)明的這一方面的第三實(shí)施方案中，依賴于RNA的RNA病毒感染是依賴于正義單鏈RNA的病毒感染。在一類(lèi)這種實(shí)施方案中，依賴于正義單鏈RNA的RNA病毒感染是黃病毒科病毒感染或小核糖核酸病毒科病毒感染。在該類(lèi)的亞類(lèi)中，小核糖核酸病毒科病毒感染是鼻病毒感染、脊髓灰質(zhì)炎病毒感染或甲型肝炎病毒感染。在該類(lèi)的第二亞類(lèi)中，黃病毒科病毒感染選自丙型肝炎病毒感染、黃熱病毒感染、登革病毒感染、西尼羅病毒感染、日本腦炎病毒感染、班齊病毒感染和牛病毒性腹瀉病毒感染。在該亞類(lèi)的子集中，黃病毒科病毒感染為丙型肝炎病毒感染。
在本申請(qǐng)中，下列術(shù)語(yǔ)貫穿始終具有指出的含意上述烷基包括直鏈或支鏈構(gòu)型的指定長(zhǎng)度的那些烷基。這樣的烷基的例子有甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基、異己基等。
術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”指總碳原子數(shù)為2-6或該范圍內(nèi)任何數(shù)字的直鏈或支鏈烯烴(例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基等)。
術(shù)語(yǔ)“炔基”指總碳原子數(shù)為2-6或者該范圍內(nèi)任何數(shù)字的直鏈或支鏈炔烴(例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基等)。
術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”指總碳原子數(shù)為3-8或者該范圍內(nèi)任何數(shù)字的環(huán)狀烷烴(例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基或環(huán)辛基)。
術(shù)語(yǔ)“環(huán)狀雜烷基”包括含有1或2個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子的非芳族雜環(huán)。4-6元環(huán)狀雜烷基的例子包括氮雜環(huán)丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、嗎啉基、硫嗎啉基(thiamorpholinyl)、咪唑烷基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、四氫噻吩基、哌嗪基等。
術(shù)語(yǔ)“烷氧基”指碳原子數(shù)為指定數(shù)字(例如C1-4烷氧基)或者該范圍內(nèi)任何數(shù)字的直鏈或支鏈烷基氧(alkoxide)[即甲氧基(MeO-)、乙氧基、異丙氧基等]。
術(shù)語(yǔ)“烷硫基”指碳原子數(shù)為指定數(shù)字(例如C1-4烷硫基)或者該范圍內(nèi)任何數(shù)字的直鏈或支鏈烷基硫[即甲硫基(MeS-)、乙硫基、異丙硫基等]。
術(shù)語(yǔ)“烷基氨基”指碳原子數(shù)為指定數(shù)字(例如C1-4烷基氨基)或者該范圍內(nèi)任何數(shù)字的直鏈或支鏈烷基胺[即甲基氨基、乙基氨基、異丙基氨基、叔丁基氨基等]。
術(shù)語(yǔ)“烷基磺?；敝柑荚訑?shù)為指定數(shù)字(例如C1-6烷基磺?；?或者該范圍內(nèi)任何數(shù)字的直鏈或支鏈烷基砜[即甲基磺?；?MeSO2-)、乙基磺酰基、異丙基磺?；萞。
術(shù)語(yǔ)“烷氧基羰基”指碳原子數(shù)為指定數(shù)字(例如C1-4烷氧基羰基)或該范圍內(nèi)任何數(shù)字的本發(fā)明羧酸衍生物的直鏈或支鏈酯[即甲氧基羰基(MeOCO-)、乙氧基羰基或丁氧基羰基]。
術(shù)語(yǔ)“芳基”包括苯基、萘基和吡啶基。所述芳基任選被1-3個(gè)獨(dú)立選自C1-4烷基、鹵素、氰基、硝基、三氟甲基、C1-4烷氧基和C1-4烷硫基的基團(tuán)取代。
術(shù)語(yǔ)“鹵素”包括鹵素原子氟、氯、溴和碘。
術(shù)語(yǔ)“取代的”應(yīng)被認(rèn)為包括被指名取代基多重取代。當(dāng)多重取代部分被公開(kāi)了或者被要求保護(hù)時(shí)，所述取代化合物可以獨(dú)立被一個(gè)或多個(gè)公開(kāi)的或者被要求保護(hù)的取代基部分單一或者多處取代。
術(shù)語(yǔ)“5’-三磷酸酯”指具有下述通用結(jié)構(gòu)式III的本發(fā)明核苷化合物的5’-羥基的三磷酸酯衍生物
其中R1-R11如上定義。本發(fā)明化合物還包括三磷酸酯的藥學(xué)上可接受的鹽和分別具有結(jié)構(gòu)式IV和V的5’-一磷酸酯和5’-二磷酸酯衍生物的藥學(xué)上可接受的鹽。
術(shù)語(yǔ)“5’-(S-?；?2-硫代乙基)磷酸酯”或“SATE”指分別具有結(jié)構(gòu)式VI和VII的本發(fā)明5’-一磷酸酯核苷衍生物的一酯或二酯衍生物以及一酯的藥學(xué)上可接受的鹽。
“藥物組合物”中的術(shù)語(yǔ)“組合物”包括包含活性成分和形成載體的惰性成分的產(chǎn)物，以及由任何兩種或多種成分混合、復(fù)合或聚集，或者由一種或多種成分離解，或者由一種或多種成分的其它類(lèi)型反應(yīng)或相互作用而直接或間接得到的任何產(chǎn)物。相應(yīng)地，本發(fā)明藥物組合物包括通過(guò)混合本發(fā)明化合物與藥學(xué)上可接受的載體制成的任何組合物。
術(shù)語(yǔ)“給藥”和“給予”化合物應(yīng)理解為是指向有需要的個(gè)體提供本發(fā)明化合物或本發(fā)明化合物的前藥。
本發(fā)明的另一方面涉及一種抑制HCV NS5B聚合酶的方法，一種抑制HCV復(fù)制的方法，或者一種用本發(fā)明化合物與一種或多種可用于治療HCV感染的試劑結(jié)合治療HCV感染的方法。這樣的可有效對(duì)抗HCV的試劑包括但不限于利巴韋林、levovirin、viramidine、胸腺素α-1、干擾素α、pegylated干擾素α(peginterferon-α)、干擾素-α與利巴韋林的組合、peginterferon-α與利巴韋林的組合、干擾素α與levovirin的組合、peginterferon-α與levovirin的組合。干擾素α包括但不限于重組體干擾素α2a(如新澤西州納特利Hoffmann-LaRoche出售的Roferon interferon)、pegylated干擾素α2a(PegasysTM)、干擾素α2b(如新澤西州Kenilworth的Schering Corp.出售的Intron-Ainterferon)、pegylated干擾素α2b(PegIntronTM)、重組體共有干擾素(如干擾素alphacon-1)和純化的干擾素α產(chǎn)品。Amgen的重組體共有干擾素具有商標(biāo)名稱Infergen。Levovirin是利巴韋林的L-對(duì)映異構(gòu)體，其顯示出近似于利巴韋林的免疫調(diào)節(jié)活性。Viramidine表示W(wǎng)O01/60379(轉(zhuǎn)讓給ICN Pharmaceuticals)中所公開(kāi)的利巴韋林類(lèi)似物。根據(jù)本發(fā)明的方法，可將并用藥物的各成分在治療期間內(nèi)的不同時(shí)間分別給藥，或者以分開(kāi)的或單一并用藥物形式同時(shí)給藥。因此，應(yīng)將本發(fā)明理解為包括所有這些同時(shí)或交替治療的療法，術(shù)語(yǔ)“給藥”也作相應(yīng)解釋。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明化合物與其它可用于治療HCV感染的試劑并用的范圍原則上包括與任何用于治療HCV感染的藥物組合物的任何并用。當(dāng)將本發(fā)明化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽與可有效對(duì)抗HCV的第二種治療試劑并用時(shí)，各化合物的劑量可以與單獨(dú)使用化合物時(shí)的劑量相同或不同。
為治療HCV感染，也可將本發(fā)明化合物與HCV NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑的試劑聯(lián)合給藥。HCV NS3絲氨酸蛋白酶是必需的病毒酶，并被描述為是抑制HCV復(fù)制的優(yōu)良目標(biāo)。HCV NS3蛋白酶抑制劑的底物和非底物基抑制劑都公開(kāi)在WO 98/22496、WO98/46630、WO 99/07733、WO 99/07734、WO 99/38888、WO 99/50230、WO 99/64442、WO 00/09543、WO 00/59929和GB2337262中。B.W.Dymock，″Emerging therapies for hepatitis C virus infection，″EmergingDrugs，613-42(2001)中討論了作為開(kāi)發(fā)HCV復(fù)制抑制劑和治療HCV感染的目標(biāo)的HCV NS3蛋白酶。
利巴韋林、levovirin和viramidine可通過(guò)經(jīng)由抑制胞內(nèi)酶肌苷一磷酸脫氫酶(IMPDH)調(diào)節(jié)鳥(niǎo)嘌呤核苷酸細(xì)胞內(nèi)池(pool)發(fā)揮其抗HCV作用。IMPDH是從頭鳥(niǎo)嘌呤核苷酸生物合成中生物合成途徑的限速酶。利巴韋林容易被細(xì)胞內(nèi)磷?；?，一磷酸衍生物是IMPDH的抑制劑。因此，IMPDH的抑制代表發(fā)現(xiàn)HCV復(fù)制抑制劑的另一有效目標(biāo)。從而，本發(fā)明化合物也可與下述物質(zhì)聯(lián)合給藥IMPDH抑制劑，如WO 97/41211和WO 01/00622(轉(zhuǎn)讓給Vertex)中公開(kāi)的VX-497；另一IMPDH抑制劑，如WO 00/25780(轉(zhuǎn)讓給Bristol-Myers Squibb)中所公開(kāi)的物質(zhì)；或者麥考酚酸嗎乙酯[參見(jiàn)A.C.Allison和E.MEugui，Agents Action，44(Suppl.)165(1993)]。
為治療HCV感染，可將本發(fā)明化合物與抗病毒劑金剛烷胺(1-氨基金剛烷)聯(lián)合給藥[該藥劑的綜述參見(jiàn)J.Kirschbaum，Anal.Profiles-Drug Subs.121-36(1983)]。
“藥學(xué)上可接受的”意指載體、稀釋劑或賦形劑必須與其它制劑成分相容，并且對(duì)其接受者無(wú)害。
也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的有包含本發(fā)明核苷化合物及其衍生物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。本發(fā)明的另一個(gè)例子是通過(guò)結(jié)合任何上述化合物和藥學(xué)上可接受的載體而制成的藥物組合物。本發(fā)明的另一例子是一種制備藥物組合物的方法，該方法包括結(jié)合任何上述化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
還包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的有可用于抑制依賴于RNA的RNA病毒聚合酶，特別是HCV NS5B聚合酶的藥物組合物，該組合物包含有效量的本發(fā)明化合物和藥學(xué)上可接受的載體?？捎糜谥委熞蕾囉赗NA的RNA病毒感染，特別是HCV感染的藥物組合物也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，還有抑制依賴于RNA的RNA病毒聚合酶，特別是HCVNS5B聚合酶的方法，以及治療依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制，特別是HCV復(fù)制的方法也都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。此外，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，該組合物包含治療有效量的本發(fā)明化合物和治療有效量的可有效對(duì)抗依賴于RNA的RNA病毒，特別是對(duì)抗HCV的另一藥劑。有效對(duì)抗HCV的藥劑包括但不限于利巴韋林、levovirin、viramidine、胸腺素α-1、HCV NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑、干擾素α、pegylated干擾素α(peginterferon-α)、干擾素-α與利巴韋林的組合、peginterferon-α與利巴韋林的組合、干擾素α與levovirin的組合、peginterferon-α與levovirin的組合。干擾素α包括但不限于重組體干擾素α2a(如新澤西州納特利Hoffmann-LaRoche出售的Roferoninterferon)、干擾素α2b(如新澤西州Kenilworth的Schering Corp.出售的Intron-A interferon)、共有干擾素和純化的干擾素α產(chǎn)品。對(duì)利巴韋林及其對(duì)抗HCV的活性的討論參見(jiàn)J.O.Saunders和S.A.Raybuck，″Inosine Monophosphate DehydrogenaseCohsideration ofStmcture，Kinetics，and Therapeutic Potential，″Ann.Rep.Med.Chem.，35201-210(2000)。
本發(fā)明的另一方面提供所述核苷化合物及其衍生物和它們的藥物組合物在制造藥物中的用途，所述藥物用于抑制依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制，特別是HCV復(fù)制，和/或治療依賴于RNA的RNA病毒感染，特別是HCV感染。本發(fā)明的再一方面提供可用作藥物的核苷化合物及其衍生物和它們的藥物組合物，所述藥物用于抑制依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制，特別是HCV復(fù)制，和/或治療依賴于RNA的RNA病毒感染，特別是HCV感染。
本發(fā)明的藥物組合物包含作為有效成分的結(jié)構(gòu)式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，還可包含藥學(xué)上可接受的載體和任選的其它治療成分。
所述組合物包括適于經(jīng)口、直腸、局部、非腸道(包括皮下、肌內(nèi)和靜脈內(nèi))、經(jīng)眼(眼用)、經(jīng)肺(經(jīng)鼻或口腔吸入)或者經(jīng)鼻給藥的組合物，盡管在任何情況下最合適的給藥途徑將取決于待治療病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重程度以及活性成分的性質(zhì)。它們可方便地以單劑形式存在，通過(guò)藥劑學(xué)領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法制備。
在實(shí)際應(yīng)用中，可將結(jié)構(gòu)式I的化合物作為活性成分與藥用載體通過(guò)常規(guī)制藥混合技術(shù)緊密摻混并用。根據(jù)給藥所需制劑，例如經(jīng)口或非腸道(包括靜脈內(nèi))給藥所需制劑的形式，所述載體可以采用各種形式。制備經(jīng)口劑型用組合物時(shí)，在口服液制劑例如混懸液、酏劑和溶液的情況下，可以使用任何常用制藥介質(zhì)，例如水、乙二醇、油、醇、調(diào)味劑、防腐劑、著色劑等；或者在經(jīng)口固體制劑例如粉末、硬和軟膠囊劑以及片劑的情況下，可以使用載體如淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、?；瘎?rùn)滑劑、粘結(jié)劑、崩解劑等，固體經(jīng)口制劑比液體制劑更優(yōu)選。
由于給藥容易，因而片劑和膠囊是最好的經(jīng)口單元?jiǎng)┬停@時(shí)明顯是采用固體制藥載體。如果需要，可以用標(biāo)準(zhǔn)水性或非水性工藝對(duì)片劑進(jìn)行包衣。這樣的組合物和制劑應(yīng)含有至少0.1％活性化合物。當(dāng)然，這些組合物中活性化合物的百分比可以改變，適宜在該單元的約2％至約60％重量范圍內(nèi)?；钚曰衔镌谶@類(lèi)可用于治療的組合物中的量是可以獲得有效劑量的量。所述活性化合物也可以經(jīng)鼻內(nèi)給藥，例如作為液滴或噴霧給藥。
片劑、丸劑、膠囊等也可包含粘結(jié)劑如西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑如磷酸二鈣；崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂；和甜味劑如蔗糖、乳糖或糖精。當(dāng)單元?jiǎng)┬蜑槟z囊時(shí)，它除了上述類(lèi)型的材料外，還可以包含液體載體如脂肪油。
也可以存在各種其它材料作為包衣劑或用于改變單元?jiǎng)┝康奈锢硇螒B(tài)。例如，可以用蟲(chóng)膠、糖或兩種一起對(duì)片劑進(jìn)行包衣。糖漿劑或酏劑除了活性成分外，還可以包含蔗糖作為甜味劑、包含對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯作為防腐劑、包含染料和調(diào)味劑作為櫻桃味或橙味香料。
結(jié)構(gòu)式I的化合物也可以非腸道給藥。這些活性化合物的溶液或混懸液可以通過(guò)在水中與表面活性劑如羥丙基纖維素適當(dāng)混合來(lái)制備。分散體也可以在乙二醇、液態(tài)聚乙二醇及其油中混合物中制備。在普通的儲(chǔ)存和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物生長(zhǎng)。
適于注射用途的藥用劑型包括滅菌水溶液或分散體以及即時(shí)制備滅菌注射溶液或分散體的滅菌粉末。在各種情況下，所述劑型必須是滅菌的，并且必須是易于注射程度上的液態(tài)。在制造和儲(chǔ)存條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須防止被微生物如細(xì)菌和真菌污染。所述載體可以是溶劑或含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇)、其穩(wěn)定的混合物和植物油的分散介質(zhì)。
可以采用任何適合的給藥途徑，以向哺乳動(dòng)物，特別是人提供有效劑量的本發(fā)明化合物。例如，可以采用經(jīng)口、直腸、局部、非腸道、眼、肺、鼻等。劑型包括片劑、錠劑、分散體、混懸液、溶液、膠囊、乳膏、軟膏、氣霧劑等。優(yōu)選經(jīng)口給予結(jié)構(gòu)式I的化合物。
對(duì)人經(jīng)口給藥時(shí)，分份劑量的劑量范圍為0.01-1000mg/kg體重。在一個(gè)實(shí)施方案中，分份劑量的劑量范圍為0.1-100mg/kg體重。在另一個(gè)實(shí)施方案中，分份劑量的劑量范圍為0.5-20mg/kg體重。對(duì)于經(jīng)口給藥，優(yōu)選將所述組合物以含1.0-1000mg活性成分，特別是1、5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、300、400、500、600、750、800、900和1000mg活性成分的片劑或膠囊的形式給藥，用以調(diào)節(jié)待治療患者的癥狀。
所用活性成分的有效劑量可以隨所采用的具體化合物、給藥方式、待治療病癥和待治療病癥的嚴(yán)重程度而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定這樣的劑量。可以調(diào)節(jié)該劑量方案以提供最佳治療反應(yīng)。
本發(fā)明化合物包含一個(gè)或多個(gè)非對(duì)稱中心，因此可以作為外消旋體和外消旋混合物、單一的對(duì)映體、非對(duì)映體混合物和單獨(dú)的非對(duì)映體存在。本發(fā)明包括具有下述結(jié)構(gòu)式的五元呋喃糖環(huán)為β-D立體化學(xué)構(gòu)型的核苷化合物，即，其中五元呋喃糖環(huán)的C-1和C-4上的取代基具有β-立體化學(xué)構(gòu)型的核苷化合物(以粗線表示的“向上”方向)。
本文所述的一些化合物包含烯屬雙鍵，除非另外指明，否則意指包括E和Z兩種幾何異構(gòu)體。
本文所述的一些化合物可以作為互變異構(gòu)體如酮-烯醇互變異構(gòu)體存在。各種互變異構(gòu)體及其混合物包括在結(jié)構(gòu)式I的化合物中。包括在本發(fā)明化合物范圍內(nèi)的酮-烯醇互變異構(gòu)體的例子如下 可以通過(guò)例如分級(jí)結(jié)晶從適當(dāng)?shù)娜軇├缂状蓟蛞宜嵋阴セ蚱浠旌衔镏谢蛘呓?jīng)由用有旋光力的固定相的手性層析將結(jié)構(gòu)式I的化合物分離為它們的單獨(dú)的非對(duì)映體。
或者，可以通過(guò)用已知構(gòu)型的光學(xué)純?cè)匣蛟噭┻M(jìn)行的立體有擇合成得到結(jié)構(gòu)式I的化合物的任何立體異構(gòu)體。
具有結(jié)構(gòu)式I的本發(fā)明化合物的呋喃糖環(huán)的C-2和C-3位取代基的立體化學(xué)用波形曲線表示，這表示取代基R1、R2、R3和R4可具有彼此獨(dú)立的α(取代基“向下”)或β(取代基“向上”)構(gòu)型。呋喃糖環(huán)的C-1和C-4位粗線的立體化學(xué)符號(hào)表示取代基具有β構(gòu)型(取代基“向上”)。
本發(fā)明化合物可以以藥學(xué)上可接受的鹽的形式給藥。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”指由藥學(xué)上可接受的非毒性堿或酸包括無(wú)機(jī)或有機(jī)堿和無(wú)機(jī)或有機(jī)酸所制成的鹽。包括在術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”范圍內(nèi)的堿性化合物的鹽指本發(fā)明化合物的非毒性鹽，它通常通過(guò)游離堿與適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)或無(wú)機(jī)酸的反應(yīng)制備。本發(fā)明堿性化合物的具有代表性的鹽包括但不限于下列鹽乙酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、硫酸氫鹽、酒石酸氫鹽、硼酸鹽、溴化物、樟磺酸鹽、碳酸鹽、氯化物、克拉維酸鹽、檸檬酸鹽、二鹽酸鹽、依地酸鹽、乙二磺酸鹽、依托酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、谷氨酸鹽、乙醇酰對(duì)氨苯基胂酸鹽、己基間苯二酚鹽(hexylresorcinate)、海巴明、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、羥萘甲酸鹽、碘化物、異硫代硫酸鹽(isothionate)、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、馬來(lái)酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基溴化物、甲基硝酸鹽、硫酸二甲酯、粘酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽、N-甲基葡糖胺銨鹽、油酸鹽、草酸鹽、撲姆酸鹽(恩波酸鹽)、棕櫚酸鹽、泛酸鹽、磷酸鹽/二磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、硫酸鹽、堿式乙酸鹽、琥珀酸鹽、單寧酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽、甲苯磺酸鹽、三乙基碘和戊酸鹽。此外，當(dāng)本發(fā)明化合物帶有酸性部分時(shí)，其適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的鹽包括但不限于衍生自無(wú)機(jī)堿的鹽，包括鋁、銨、鈣、銅、鐵、亞鐵、鋰、鎂、錳、mangamous、鉀、鈉、鋅等。特別優(yōu)選的是銨、鈣、鎂、鉀和鈉鹽。衍生自藥學(xué)上可接受的有機(jī)非毒性堿的鹽包括伯、仲和叔胺、環(huán)胺的鹽以及堿性離子交換樹(shù)脂，如精氨酸、甜菜堿、咖啡堿、膽堿、N，N-二芐基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基嗎啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、殼糖胺、組氨酸、海巴明、異丙基胺、賴氨酸、甲葡糖胺、嗎啉、哌嗪、哌啶、聚胺樹(shù)脂、普魯卡因、嘌呤、可可堿、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等。
還有，在本發(fā)明化合物中存在羧酸(-COOH)或醇基的情況下，可以使用羧酸衍生物的藥學(xué)上可接受的酯，如醇的甲基、乙基或新戊酰氧基甲基或酰基衍生物，如乙酸酯或馬來(lái)酸酯。包括在內(nèi)的有本領(lǐng)域已知用于改進(jìn)用作緩釋或前藥制劑的溶解性或水解特性的那些酯和?；?。
本發(fā)明的核苷化合物和衍生物的制備本發(fā)明的核苷化合物及其衍生物可以按照實(shí)際操作中完善建立起來(lái)的核苷和核苷酸化學(xué)合成工藝進(jìn)行制備。制備本發(fā)明化合物時(shí)，參考下述描述合成方法的文獻(xiàn)“Chemistry of Nucleosides andNucleotides，”L.B.Townsend編輯，卷1-3，Plenum Press，1988，將其全文結(jié)合在此以作參考。
制備本發(fā)明化合物的一個(gè)具有代表性的通用方法如下面方案1所述。該方案例舉了其中呋喃糖環(huán)具有β-D-核糖構(gòu)型的結(jié)構(gòu)式1-7的的本發(fā)明化合物的合成。起始原料為結(jié)構(gòu)式1-1的3，5-二-O-被保護(hù)的烷基呋喃糖苷，如甲基呋喃糖苷。然后用適當(dāng)?shù)难趸瘎┤缛趸t或鉻酸鹽試劑、Dess-Martin periodinane或者通過(guò)Swern氧化作用氧化C-2羥基，得到結(jié)構(gòu)式1-2的C-2酮。加入格利雅試劑如烷基、烯基或炔基鹵化鎂(例如MeMgBr、EtMgBr、乙烯基MgBr、烯丙基MgBr和乙炔基MgBr)或者烷基、烯基或炔基鋰如MeLi，在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑如四氫呋喃、二乙醚等中穿過(guò)(across)1-2的羰基雙鍵，得到結(jié)構(gòu)式1-3的C-2叔醇。然后通過(guò)用在適當(dāng)有機(jī)溶劑中的鹵化氫如溴化氫的乙酸溶液中處理式1-3的呋喃糖苷，在呋喃糖糖衍生物的C-1(端基)位上引進(jìn)良好的離去基團(tuán)(如Cl、Br和I)，得到中間體鹵化呋喃糖1-4。C-1磺酸鹽，如甲磺酸鹽(MeSO2O-)、三氟甲磺酸鹽(CF3SO2O-)或?qū)妆交撬猁}(-OTs)也可以在隨后的反應(yīng)中作為有用的離去基團(tuán)以生成配糖(核苷)鍵。通過(guò)用適當(dāng)取代的1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶1-5，如適當(dāng)取代的4-鹵代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶的金屬鹽(如鋰、鈉或鉀)處理結(jié)構(gòu)式1-4的中間體構(gòu)建核苷鍵，其中所述4-鹵代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶可通過(guò)用堿金屬氫化物(如氫化鈉)、堿金屬氫氧化物(如氫氧化鉀)、堿金屬碳酸鹽(如碳酸鉀)或堿金屬六甲基二硅氮化物(hexamethyldisilazide)(如NaHMDS)在適當(dāng)?shù)臒o(wú)水有機(jī)溶劑如乙腈、四氫呋喃、1-甲基-2-吡咯烷酮或N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中處理而原位生成。置換反應(yīng)可用相轉(zhuǎn)移催化劑如TDA-1或三乙基芐基氯化銨在兩相體系(固-液或液-液)中進(jìn)行催化。然后根據(jù)既定的脫保護(hù)方法，如T.W.Greene和P.G.M.Wuts在″Protective Groups in OrganicSynthesis，″第3版，John Wiley & Sons，1999中所描述的方法脫掉結(jié)構(gòu)式1-6的被保護(hù)的核苷中的任選保護(hù)基。通過(guò)用適當(dāng)?shù)陌啡缇凭被蛞簯B(tài)氨處理4-鹵代中間體1-6，在吡咯并[2，3-d]嘧啶核的4-位上任選引進(jìn)氨基，生成C-4位(-NH2)伯胺，用烷基胺處理生成仲胺(-NHR)，或者用二烷基胺處理生成叔胺(-NRR’)?？梢酝ㄟ^(guò)用含水堿如含水氫氧化鈉水解1-6，得到7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4(3H)酮化合物。醇解(如甲醇分解)1-6可得到C-4醇化物(-OR)，而用烷基硫醇處理則得到C-4烷硫基(-SR)衍生物。隨后需要進(jìn)行有機(jī)/醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員已知的化學(xué)操作，以獲得所需的本發(fā)明化合物。
方案1 下面的實(shí)施例提供對(duì)文獻(xiàn)出版物的引用，這些文獻(xiàn)包含制備反終化合物或在制備本發(fā)明最終化合物時(shí)所用中間體的細(xì)節(jié)。本發(fā)明的核苷化合物按照下述實(shí)施例中的程序制備。實(shí)施例無(wú)意以任何方式限制本發(fā)明的范圍，也不應(yīng)對(duì)其作如是解釋。核苷和核苷酸合成領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地意識(shí)到可對(duì)下述實(shí)施例中的條件和工藝作眾所周知的變更，以制備本發(fā)明的這些和其它化合物。除非另有說(shuō)明，否則所有的溫度都是攝氏度。
實(shí)施例14-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-阿糖呋喃基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 在0℃，向三氧化鉻(1.57g，1.57mmol)的二氯甲烷(DCM)(10mL)溶液中加入乙酸酐(145mg，1.41mmol)，然后加入吡啶(245mg，3.10mmol)。將該混合物攪拌15分鐘，然后加入7-[3，5-O-[1，1，3，3-四(1-甲基乙基)-1，3-二硅氧烷二基]-β-D-呋喃核糖基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-胺[其制備參見(jiàn)J.Am.Chem.Soc.1054059(1983)](508mg，1.00mmol)的DCM(3mL)溶液。將所得溶液攪拌2小時(shí)，然后倒入乙酸乙酯(10mL)中，隨后通過(guò)硅膠過(guò)濾，用乙酸乙酯作洗脫劑。將合并的濾液真空蒸發(fā)，導(dǎo)進(jìn)二乙醚/THF(1∶1)(20mL)中，冷卻至-78℃，然后滴加溴化甲基鎂(3M，THF溶液)(3.30mL，10mmol)。將該混合物在-78℃攪拌10分鐘，然后使其回復(fù)至室溫(rt)，通過(guò)加入飽和氯化銨水溶液(10mL)猝滅，用DCM(20mL)萃取。真空蒸發(fā)有機(jī)相，將粗產(chǎn)品通過(guò)硅膠提純，用5％甲醇的二氯甲烷溶液作洗脫劑。收集含產(chǎn)物的流分，真空蒸發(fā)。將所得油導(dǎo)進(jìn)THF(5mL)中，并加入二氧化硅上的氟化四丁基銨(TBAF)(1.1mmol/g在二氧化硅上)(156mg)。將該混合物在室溫下攪拌30分鐘，過(guò)濾，真空蒸發(fā)。用10％甲醇的二氯甲烷溶液作洗脫劑，經(jīng)硅膠提純所得粗產(chǎn)物。收集含產(chǎn)物的流分，真空蒸發(fā)，得到為無(wú)色固體狀的所需化合物(49mg)。
1H NMR(DMSO-d6)δ1.08(s，3H)，3.67(m，2H)，3.74(m，1H)，3.83(m，1H)，5.19(m，1H)，5.23(m，1H)，5.48(m，1H)，6.08(1H，s)，6.50(m，1H)，6.93(bs，2H)，7.33(m，1H)，8.02(s，1H).
實(shí)施例24-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 步驟A3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-1-O-甲基-α-D-呋喃核糖將2-O-乙?；?3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-1-O-甲基-α-D-呋喃核糖[其制備參見(jiàn)Helv.Chim.Acta78486(1995)](52.4g，0.10mol)的甲醇K2CO3(500mL，在室溫下飽和)溶液在室溫下攪拌45分鐘，然后減壓濃縮。將油狀殘余物懸浮于CH2Cl2(500mL)中，用水(300mL+5×200mL)和鹽水(200mL)洗滌，干燥(Na2SO4)，過(guò)濾，濃縮，得到為無(wú)色油狀物的標(biāo)題化合物(49.0g)，將其直接用于下面的步驟B，無(wú)需進(jìn)一步提純。
1H NMR(DMSO-d6)δ3.28(s，3H，OCH3)，3.53(d，2H，J5，4＝4.5Hz，H-5a，H-5b)，3.72(dd，H，J3，4＝3.6Hz，J3，2＝6.6Hz，H-3)，3.99(ddd，1H，J2，1＝4.5Hz，J2，OH-2＝9.6Hz，H-2)，4.07(m，1H，H-4)，4.50(s，2H，CH2Ph)，4.52，4.60(2d，2H，Jgem＝13.6Hz，CH2Ph)，4.54(d，1H，OH-2)，4.75(d，1H，H-1)，7.32-7.45，7.52-7.57(2m，10H，2Ph).
13C NMR(DMSO-d6)δ55.40，69.05，69.74，71.29，72.02，78.41，81.45，103.44，127.83，127.95，129.05，129.28，131.27，131.30，133.22，133.26，133.55，133.67，135.45，135.92.
步驟B3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-1-O-甲基-α-D-赤蘚-呋喃戊-2-酮糖在氬氣(Ar)下，用0.5小時(shí)向冰冷的Dess-Martin periodinane(50.0g，118mmol)的無(wú)水CH2Cl2(350mL)溶液中滴加步驟A所得化合物(36.2g，75mmol)的無(wú)水CH2Cl2(200mL)溶液。將該反應(yīng)混合物在0℃攪拌0.5小時(shí)，然后在室溫下攪拌3天。用無(wú)水Et2O(600mL)稀釋所得混合物，并倒進(jìn)Na2S2O3·5H2O(180g)在飽和含水NaHCO3(1400mL)中的冰冷混合物中。分離各層，用飽和含水NaHCO3(600mL)、水(800mL)和鹽水(600mL)洗滌有機(jī)層，干燥(MgSO4)，過(guò)濾并蒸發(fā)，得到為無(wú)色油狀物的標(biāo)題化合物(34.2g)，將其用于下面的步驟C，無(wú)需進(jìn)一步提純。
1H NMR(CDCl3)δ3.50(s，3H，OCH3)，3.79(dd，1H，J5a，5b＝11.3Hz，J5a，4＝3.5Hz，H-5a)，3.94(dd，1H，J5b，4＝2.3Hz，H-5b)，4.20(dd，1H，J3，1＝1.3Hz，J3，4＝8.4Hz，H-3)，4.37(ddd，1H，H-4)，4.58，4.69(2d，2H，Jgem＝13.0Hz，CH2Ph)，4.87(d，1H，H-1)，4.78，5.03(2d，2H，Jgem＝12.5Hz，CH2Ph)，7.19-7.26，7.31-7.42(2m，10H，2Ph).
13C NMR(DMSO-d6)δ55.72，69.41，69.81，69.98，77.49，78.00，98.54，127.99，128.06，129.33，129.38，131.36，131.72，133.61，133.63，133.85，133.97，134.72，135.32.208.21.
步驟C3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2-C-甲基-1-O-甲基-α-D-呋喃核糖在-55℃，向MeMgBr的無(wú)水Et2O(0.48M，300mL)溶液中滴加步驟B所得化合物(17.40g，36.2mmol)的無(wú)水Et2O(125mL)溶液。將反應(yīng)混合物升溫至-30℃，并在-30℃至-15℃攪拌7小時(shí)，然后倒進(jìn)冰冷的水(500mL)中，在室溫下劇烈攪拌該混合物0.5小時(shí)。將混合物通過(guò)硅藻土墊(10×5cm)過(guò)濾，并用Et2O充分洗滌。將有機(jī)層干燥(MgSO4)，過(guò)濾并濃縮。將殘余物溶于己烷(～30mL)中，經(jīng)用己烷和己烷/EtOAc(9/1)洗脫的硅膠柱(10×7cm，預(yù)先填充己烷)，得到為無(wú)色糖漿狀的標(biāo)題化合物(16.7g)。
1H NMR(CDCl3)δ1.36(d，3H，JMe，OH＝0.9Hz，2C-Me)，3.33(q，1H，OH)，3.41(d，1H，J3，4＝3.3Hz)，3.46(s，3H，OCH3)，3.66(d，2H，J5，4＝3.7Hz，H-5a，H-5b)，4.18(表觀q，1H，H-4)，4.52(s，1H，H-1)，4.60(s，2H，CH2Ph)，4.63，4.81(2d，2H，Jgem＝13.2Hz，CH2Ph)，7.19-7.26，7.34-7.43(2m，10H，2Ph).
13C NMR(CDCl3)δ24.88，55.45，69.95，70.24，70.88，77.06，82.18，83.01，107.63，127.32，129.36，130.01，130.32，133.68，133.78，134.13，134.18，134.45，134.58.
步驟D4-氯-7-[3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶在0℃，向步驟C所得化合物(9.42g，19mmol)的無(wú)水二氯甲烷(285mL)溶液中滴加HBr(5.7M乙酸溶液，20mL，114mmol)。將所得溶液在0℃攪拌1小時(shí)，然后在室溫下攪拌3小時(shí)，真空蒸發(fā)，并用無(wú)水甲苯(3×40mL)共蒸發(fā)。將油狀殘余物溶于無(wú)水乙腈(50mL)中，將其加入到4-氯-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶的鈉鹽的乙腈溶液[由4-氯-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶[其制備參見(jiàn)J.Chem.Soc.131(1960)](8.76g，57mmol)的無(wú)水乙腈(1000mL)溶液和NaH(60％，在礦物油中，2.28g，57mmol)經(jīng)4小時(shí)在室溫下的劇烈攪拌后原位生成]。將合并的混合物在室溫下攪拌24小時(shí)，然后蒸發(fā)至干燥。將殘余物懸浮于水(250mL)中，用EtOAc(2×500mL)萃取。將合并的萃取物用鹽水(300mL)洗滌，經(jīng)NaSO4干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)。將粗制產(chǎn)品通過(guò)硅膠柱(10cm×10cm)提純，用乙酸乙酯/己烷(1∶3和1∶2)作洗脫劑。合并含產(chǎn)物的流分，真空蒸發(fā)，得到為無(wú)色泡沫狀的所需產(chǎn)物(5.05g)。
1H MR(CDCl3)δ0.93(s，3H，CH3)，3.09(s，1H，OH)，3.78(dd，1H，J5’，5”＝10.9Hz，J5’，4＝2.5Hz，H-5’)，.3.99(dd，1H，J5”，4＝2.2Hz，H-5”)，4.23-4.34(m，2H，H-3’，H-4’)，4.63，4.70(2d，2H，Jgem＝12.7Hz，CH2Ph)，4.71，4.80(2d，2H，Jgem＝12.1Hz，CH2Ph)，6.54(d，1H，，J5，6＝3.8Hz，H-5)，7.23-7.44(m，10H，2Ph).13C NMR(CDCl3)δ 21.31，69.10，70.41，70.77，79.56，80.41，81.05，91.11，100.57，118.21，127.04，127.46，127.57，129.73，129.77，130.57，130.99，133.51，133.99，134.33，134.38，134.74，135.21，151.07，151.15 152.47.
步驟E4-氯-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶在-78℃，向步驟D所得化合物(5.42g，8.8mmol)的二氯甲烷(175mL)溶液中滴加三氯化硼(1M二氯甲烷溶液，88mL，88mmol)。將該混合物在-78℃攪拌2.5小時(shí)，然后在-30℃至-20℃攪拌3小時(shí)。通過(guò)加入甲醇/二氯甲烷(1∶1)(90mL)猝滅反應(yīng)，并將所得混合物在-15℃攪拌30分鐘，然后在0℃用氨水中和，并在室溫下攪拌15分鐘。過(guò)濾固體，用CH2Cl2/MeOH(1/1，250mL)洗滌。將合并的濾液蒸發(fā)，通過(guò)硅膠快速層析提純殘余物，用CH2Cl2和CH2Cl2∶MeOH(99∶1，98∶2，95∶5和90∶10)梯度作洗脫液，得到為無(wú)色泡沫狀的所需化合物(1.73g)，用MeCN處理后將其轉(zhuǎn)化成無(wú)定形固體。
1H NMR(DMSO-d6)δ0.64(s，3H，CH3)，3.61-3.71(m，1H，H-5’)，3.79-3.88(m，1H，H-5”)，3.89-4.01(m，2H，H-3’，H-4’)，5.15-5.23(m，3H，2’-OH，3’-OH，5’-OH)，6.24(s，1H，H-1’)，6.72(d，1H，J5，6＝3.8Hz，H-5)，8.13(d，1H，H-6)，8.65(s，1H，H-2).
13C NMR(DMSO-d6)δ20.20，59.95，72.29，79.37，83.16，91.53，100.17，117.63，128.86，151.13，151.19，151.45.
步驟F4-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶向步驟E所得化合物(1.54g，5.1mmol)中加入甲醇氨(在0℃飽和；150mL)。將該混合物在85℃、不銹鋼高壓釜中加熱14小時(shí)，然后冷卻并真空蒸發(fā)。將粗制混合物通過(guò)硅膠柱提純，用CH2Cl2/MeOH(9/1)作洗脫劑，得到為無(wú)色泡沫的題述化合物(0.8g)，用MeCN處理后將其分離成無(wú)定形固體。從甲醇/乙腈中重結(jié)晶該無(wú)定形固體；m.p.222℃。
1H NMR(DMSO-d6)δ0.62(s，3H，CH3)，3.57-3.67(m，1H，H-5’)，3.75-3.97(m，3H，H-5”，H4’，H-3’)，5.00(s，1H，2’-OH)，5.04(d，1H，J3’OH，3，＝6.8Hz，3’-OH)，5.06(t，1H，J5’OH，5’，5”＝5.1Hz，5’-OH)，6.11(s，1H，H-1’)，6.54(d，1H，J5，6＝3.6Hz，H-5)，6.97(br s，2H，NH2)，7.44(d，1H，H-6)，8.02(s，1H，H-2).
13C NMR(DMSO-d6)δ20.26，60.42，72.72，79.30，82.75，91.20，100.13，103.08，121.96，150.37，152.33，158.15.
LC-MS實(shí)測(cè)值279.10(M-H)+)；計(jì)算值C12H16N4O4+H+279.11.
實(shí)施例34-氨基-7-(2-C-乙基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 步驟A3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2-C-乙基-1-O-甲基-α-D-呋喃核糖在-78℃，向二乙醚(300mL)中緩慢加入EtMgBr(3.0M，16.6mL)，然后滴加實(shí)施例2步驟B所得化合物(4.80g，10.0mmol)的無(wú)水Et2O(100mL)溶液。將該反應(yīng)混合物在-78℃攪拌15分鐘，使其升溫至-15℃，再攪拌2小時(shí)，然后倒進(jìn)經(jīng)攪拌的水(300mL)中Et2O(600mL)的混合物中。分離有機(jī)相，干燥(MgSO4)，真空蒸發(fā)。將粗產(chǎn)物通過(guò)硅膠提純，用乙酸乙酯/己烷(1∶2)作洗脫劑。收集含產(chǎn)物的流分，真空蒸發(fā)，得到為無(wú)色油狀的所需產(chǎn)物(3.87g)。
步驟B4-氯-7-[3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2-C-乙基-β-D-呋喃核糖基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶在0℃向步驟A所得化合物(1.02mg，2.0mmol)的二氯甲烷(40mL)溶液中滴加HBr(5.7M乙酸溶液)(1.75mL，10.0mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌2小時(shí)，真空蒸發(fā)，并與甲苯(10mL)共蒸發(fā)兩次。將油狀殘余物溶于乙腈(10mL)中，并加入到4-氯-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(307mg，2.0mmol)、氫氧化鉀(337mg，6.0mmol)和三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺(130mg，0.4mmol)在乙腈(10mL)中的經(jīng)劇烈攪拌的混合物中。將所得混合物在室溫下攪拌過(guò)夜，然后倒進(jìn)飽和氯化銨(100mL)和乙酸乙酯(100mL)的經(jīng)攪拌的混合物中。分離有機(jī)層，用鹽水(100mL)洗滌，經(jīng)MgSO4干燥，過(guò)濾并真空蒸發(fā)。將粗產(chǎn)物通過(guò)硅膠提純，用乙酸乙酯/己烷(1∶2)作洗脫劑，得到為無(wú)色泡沫狀的所需產(chǎn)物(307mg)。
步驟C4-氯-7-(2-C-乙基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶在-78℃，向步驟B所得化合物(307mg，0.45mmol)的二氯甲烷(8mL)溶液中加入三氯化硼(1M二氯甲烷溶液)(4.50mL，4.50mmol)。將該混合物在-78℃攪拌1小時(shí)，然后在-10℃攪拌3小時(shí)。通過(guò)加入甲醇/二氯甲烷(1∶1)(10mL)猝滅反應(yīng)，并在-15℃攪拌30分鐘，加入氫氧化銨水溶液中和。減壓蒸發(fā)該混合物，將所得油通過(guò)用甲醇/二氯甲烷(1∶9)作洗脫劑的硅膠提純。收集含產(chǎn)物的流分，真空蒸發(fā)，得到為無(wú)色泡沫狀的所需產(chǎn)物(112mg)。
步驟D4-氨基-7-(2-C-乙基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶向步驟C所得化合物(50mg，0.16mmol)中加入飽和氨的甲醇(4mL)。將該混合物在75℃、封閉容器中攪拌72小時(shí)，冷卻并真空蒸發(fā)。將粗制混合物通過(guò)用甲醇/二氯甲烷(1∶9)作洗脫劑的硅膠提純。收集含產(chǎn)物的流分，真空蒸發(fā)，得到為無(wú)色粉末的所需產(chǎn)物(29mg)。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ0.52(t，3H)，1.02(m，2H)，4.01-3.24(m，6H)，5.06(m，1H)，6.01(s，1H)，6.51(d，1H)，6.95(s br，2H)，6.70(d，1H)，7.99(s，1H).
LC-MS實(shí)測(cè)值295.2(M+H+)；計(jì)算值C13H18N4O4+H+295.14.
實(shí)施例42-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮 步驟A2-氨基-4-氯-7-[3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶向?qū)嵤├?步驟C所得產(chǎn)物(1.27g，2.57mmo)的CH2Cl2(30mL)冰冷溶液中滴加HBr(5.7M乙酸溶液；3mL)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時(shí)，減壓濃縮，與甲苯(2×15mL)共蒸發(fā)。將所得油溶于乙腈(MeCN)(15mL)中，并滴加到充分?jǐn)嚢璧?-氨基-4-氯-7H-吡咯并[2，3-d)嘧啶[其制備參見(jiàn)Heterocycles35825(1993)](433mg，2.57mmol)、KOH(85％，粉碎成粉末)(0.51g，7.7mmol)、三[2-(2-甲氧基乙氧基)乙基]胺(165μL，0.51mmol)在乙腈(30mL)的混合物中。將所得混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，過(guò)濾并蒸發(fā)。將殘余物通過(guò)用己烷/EtOAc，5/1，3/1和2/1作洗脫劑的硅膠柱提純，得到為無(wú)色泡沫狀的標(biāo)題化合物(0.65g)。
步驟B2-氨基-4-氯-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶在-78℃，向步驟A所得產(chǎn)物(630mg，1.0mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液中加入三氯化硼(1M二氯甲烷溶液)(10mL，10mmol)。將該混合物在-78℃攪拌2小時(shí)，然后在-20℃攪拌2.5小時(shí)。用CH2Cl2/MeOH(1∶1)(10mL)猝滅反應(yīng)，并在-20℃攪拌0.5小時(shí)，在0℃用氨水中和。過(guò)濾固體，用CH2Cl2/MeOH(1∶1)洗滌，將合并的濾液真空蒸發(fā)。將殘余物通過(guò)硅膠柱提純，用CH2Cl2/MeOH，50/1和20/1作洗脫劑，得到為無(wú)色泡沫狀的標(biāo)題化合物(250mg)。
步驟C2-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮將步驟B所得產(chǎn)物(90mg，0.3mmol)在含水NaOH(2N，9mL)中的混合物在回流溫度下加熱5小時(shí)，然后在0℃用2N含水HCl中和，蒸發(fā)至干燥。通過(guò)用CH2Cl2/MeOH，5/1作洗脫劑的硅膠柱提純，得到為白色固體狀的標(biāo)題化合物(70mg)。
1H NMR(200MHz，CD3OD)δ0.86(s，3H)，3.79(m 1H)，3.90-4.05(m，3H)，6.06(s，1H)，6.42(d，J＝3.7Hz，1H)，7.05(d，J＝3.7Hz，1H).
實(shí)施例52-氨基-4-環(huán)丙基氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 將2-氨基-4-氯-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(實(shí)施例4，步驟B)(21mg，0.07mmol)的環(huán)丙胺(0.5mL)溶液在70℃加熱2天，然后將其蒸發(fā)至成為油狀殘余物，通過(guò)硅膠柱提純，用CH2Cl2/MeOH，20/1作洗脫劑，得到為白色固體狀的標(biāo)題化合物(17mg)。
1H NMR(200MHz，CD3CN)δ0.61(m，2H)，0.81(m，2H)，0.85(s，3H)，2.83(m，1H)，3.74-3.86(m，1H)，3.93-4.03(m，2H)，4.11(d，J＝8.9Hz，1H)，6.02(s，1H)，6.49(d，J＝3.7Hz，1H)，7.00(d，J＝3.7Hz，1H).
實(shí)施例64-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-腈 按照Y.Murai等人在Heterocycles33391-404(1992)中所述的方法制備該化合物。
實(shí)施例74-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-酰胺 按照Y.Murai等人在Heterocycles33391-404(1992)中所述的方法制備該化合物。
實(shí)施例8制備SATE前藥部分的通用工序C.R.Wagner，V.V.Iyer，和E.J.McIntee，″PronucleotidesTowardthe In Vivo Delivery of Antiviral and Anticancer Nucleotides，″Med.Res.Rev.，201-35(2000)中討論了S-酰基-2-硫代乙基(SATE)原核苷酸(pronucleotide)，將其全文結(jié)合進(jìn)本文以作參考。美國(guó)專利號(hào)5,770,725、5,849,905和6,020,482中也公開(kāi)了核苷的SATE衍生物，將其全文結(jié)合進(jìn)本文以作參考。
二(S-乙?；?2-硫代乙基)-N，N-二異丙基亞磷酰胺將2-巰基乙醇(5g，64mmol)溶于CH2Cl2(50mL)中。向該溶液中加入三乙胺(7.67mL，57.6mmol)，并將該反應(yīng)混合物在冰浴中冷卻至0℃。在10分鐘內(nèi)滴加乙酸酐(4.54mL，48mmol)，將該反應(yīng)混合物在0℃攪拌1小時(shí)。然后使反應(yīng)混合物在2小時(shí)內(nèi)回復(fù)至室溫。將該反應(yīng)混合物用CH2Cl2(50mL)稀釋，用水(75mL)、5％含水NaHCO3(75mL)和鹽水(75mL)洗滌。將有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥并真空濃縮，得到油。然后將油溶于無(wú)水THF(40mL)中，并加入無(wú)水三乙胺(7.76mL)。向該混合物中加入活化分子篩(4)，并在室溫下保持10分鐘。將反應(yīng)混合物在冰浴中冷卻至0℃，并加入二氯-N，N-二異丙基亞磷酰胺(diisopropylphosphoramidous dichloride)(6.47g，32.03mmol)。將反應(yīng)混合物在0℃、惰性氣氛下攪拌2小時(shí)。將己烷(40mL)加入到反應(yīng)混合物中，過(guò)濾形成的沉淀。將濾液濃縮至原體積的1/4，通過(guò)硅膠填充柱層析提純，用含3％三乙胺和增量的乙酸乙酯(0-7％)的己烷洗脫，得到為油狀的標(biāo)題化合物(2.36g)。
1H NMR(CDCl3)δ1.17(s，6H)，1.21(s，6H)，2.36(s，6H)，3.14(t，J＝6.44Hz)，3.51-3.84(m，6H)；13C NMR(CDCl3)δ24.47，24.61，30.48，42.85，43.1，61.88，62.23，195.26；13P NMR(CDCl3)δ146.96.
實(shí)施例95′-三磷酸酯衍生物按照Chem.Rev.1002047(2000)中所述的通用步驟制備本發(fā)明的核苷5′-三磷酸酯。
實(shí)施例105′-三磷酸酯衍生物的純化和純度分析將所得三磷酸酯衍生物通過(guò)用具有pH8的50mM Tris緩沖體系的30×100mm Mono Q柱(Pharmacia)進(jìn)行陰離子交換(AX)層析提純。洗脫梯度通常在兩柱體積內(nèi)為40mM NaCl至0.8M NaCl，6.5mL/分鐘。收集陰離子交換層析得到的適當(dāng)?shù)牧鞣?，通過(guò)使用Luna C18 250×21mm柱(Phenomenex)，流速10mL/分鐘的反相(RP)層析除去鹽分。洗脫梯度通常為1％-95％甲醇，14分鐘，5mM乙酸三乙銨(TEAA)的恒定濃度。
在Hewlett-Packard(Palo Alto，CA)MSD 1100上用聯(lián)機(jī)HPLC質(zhì)譜法測(cè)定純化后的三磷酸酯的質(zhì)譜。RP HPLC用Phenomenex Luna(C18(2))，150×2mm，加30×2mm保護(hù)柱，3-μm粒度。在負(fù)離子化模型中實(shí)施乙腈的20mM TEAA(乙酸三乙銨)pH7溶液的0-50％線性梯度(15分鐘)。用氮?dú)夂统錃馐絿婌F器產(chǎn)生電霧化。以150-900的分子量范圍為樣本。用HP Chemstation分析程序包測(cè)定分子量。
純化后的三磷酸酯的純度通過(guò)分析用RP和AX HPLC測(cè)定。具有Phenomonex Luna或Jupiter柱(250×4.6mm)，5μm粒度的RP HPLC通常用在100mM TEAA，pH7中的15分鐘內(nèi)2-70％乙腈梯度運(yùn)轉(zhuǎn)。AX HPLC在1.6×5mm Mono Q柱(Pharmacia)上進(jìn)行。以50mM Tris的恒定濃度，pH8，0-0.4M NaCl梯度洗脫三磷酸酯。三磷酸酯的純度一般＞80％。
實(shí)施例115′-一磷酸衍生物按照Tetrahedron Lett.505065(1967)中所述的通用程序制備本發(fā)明的5’-一磷酸核苷。
實(shí)施例125′-三磷酸酯衍生物的質(zhì)譜特征如實(shí)施例10中所述，測(cè)定本發(fā)明化合物的5’-三磷酸酯的質(zhì)譜。列在下表中的是按照實(shí)施例9制備的具有代表性的5’-三磷酸酯的計(jì)算值和實(shí)驗(yàn)值。實(shí)施例編號(hào)對(duì)應(yīng)于5’-三磷酸酯的母體化合物。
實(shí)施例13[4-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]-嘧啶]-5′-一磷酸酯
向?qū)嵤├?步驟F所得化合物(14mg，0.05mmol)(通過(guò)與吡啶共蒸發(fā)，并與甲苯共蒸發(fā)幾次被干燥)中加入磷酸三甲酯(0.5mL)。將該混合物在密閉容器中攪拌過(guò)夜。然后冷卻至0℃，并經(jīng)注射器加入磷酰氯(0.0070mL，0.075mmol)。將該混合物在0℃攪拌3小時(shí)，然后加入碳酸氫四乙銨(TEAB)(1M)(0.5mL)和水(5mL)使反應(yīng)猝滅。按照實(shí)施例10中所述程序純化并分析該反應(yīng)混合物。
電噴霧質(zhì)譜(ES-MS)實(shí)測(cè)值359.2(M-H+)，對(duì)C12H17N4O7P-H+的計(jì)算值359.1。
實(shí)施例14[4-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]-嘧啶]-5′-二磷酸酯 向?qū)嵤├?步驟F所得化合物(56mg，0.20mmol)(通過(guò)與吡啶共蒸發(fā)，并與甲苯共蒸發(fā)幾次被干燥)中加入磷酸三甲酯(儲(chǔ)存于篩上)(1.0mL)。將該混合物在密閉容器中攪拌過(guò)夜。然后冷卻至0℃，并經(jīng)注射器加入磷酰氯(0.023mL，0.25mmol)。將該混合物在0℃攪拌2小時(shí)，然后加入三丁胺(0.238mL，1.00mmol)和磷酸三丁銨(通過(guò)磷酸與三丁胺在吡啶中反應(yīng)，并與吡啶和乙腈共沸蒸發(fā)而獲得)(1.0mmol，在3.30mL乙腈中)。將該混合物在0℃再攪拌30分鐘，然后打開(kāi)密閉管，加入TEAB(1M)(1.0mL)和水(5mL)使反應(yīng)猝滅。按照實(shí)施例10中所述程序純化并分析該反應(yīng)混合物。
ES-MS實(shí)測(cè)值439.0(M-H+)，對(duì)C12H18N4O10P2-H+的計(jì)算值439.04。
實(shí)施例15[4-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]-嘧啶]-5′-三磷酸酯
向?qū)嵤├?步驟F所得化合物(20mg，0.07mmol)(通過(guò)與吡啶共蒸發(fā)，并與甲苯共蒸發(fā)幾次被干燥)中加入磷酸三甲酯(儲(chǔ)存于篩上)(0.4mL)。將該混合物在密閉容器中攪拌過(guò)夜。然后冷卻至0℃，并經(jīng)注射器加入磷酰氯(0.0070mL，0.075mmol)。將該混合物在0℃攪拌3小時(shí)，然后加入三丁胺(0.083mL，0.35mmol)和焦磷酸三丁銨(127mg，0.35mmol)和乙腈(儲(chǔ)存于篩上)(0.25mL)。將該混合物在0℃再攪拌30分鐘，然后打開(kāi)密閉管，加入TEAB(1M)(0.5mL)和水(5mL)使反應(yīng)猝滅。按照實(shí)施例10中所述程序純化并分析該反應(yīng)混合物。
ES-MS實(shí)測(cè)值519.0(M-H+)，對(duì)C12H19N4O13P3-H+的計(jì)算值519.01。
實(shí)施例167-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮 向?qū)嵤├?步驟E所得化合物(59mg，0.18mmol)中加入氫氧化鈉水溶液(1M)。將該混合物加熱回流1小時(shí)，冷卻，用含水HCl(2M)中和，并真空蒸發(fā)。將殘余物用二氯甲烷/甲醇(4∶1)作洗脫劑在硅膠上純化。收集含產(chǎn)物的流分，真空蒸發(fā)，得到為無(wú)色油狀的所需產(chǎn)物(53mg)。
1H NMR(CD3CN)δ0.70(s，3H)，3.34-4.15(重疊m，7H)，6.16(s，1H)，6.57(d，3.6Hz，1H)，7.37(d，3.6Hz，1H)，8.83(s，1H)。
實(shí)施例174-氨基-5-氯-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 向?qū)嵤├?步驟F所得化合物(140mg，0.50mmol)的DMF(2.5mL)預(yù)冷卻溶液(0℃)中滴加N-氯代丁二酰亞胺(0.075g，0.55mmol)的DMF(0.5mL)溶液。將該溶液在室溫下攪拌1小時(shí)，加入甲醇(4mL)猝滅反應(yīng)，并真空蒸發(fā)。將粗產(chǎn)物用甲醇/二氯甲烷(1∶9)作洗脫劑在硅膠上純化。收集含產(chǎn)物的流分，真空蒸發(fā)，得到為無(wú)色固體狀的所需產(chǎn)物(55mg)。
1H NMR(CD3CN)δ0.80(s，3H)，3.65-4.14(重疊m，7H)，5.97(s br，2H)，6.17(s，1H)，7.51(s，1H)，8.16(s，1H)。
ES-MS實(shí)測(cè)值315.0(M+H+)，對(duì)C12H15ClN4O4+H+的計(jì)算值315.09。
實(shí)施例184-氨基-5-溴-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 向?qū)嵤├?步驟F所得化合物(28mg，0.10mmol)的DMF(0.5mL)預(yù)冷卻溶液(0℃)中滴加N-氯代丁二酰亞胺(0.018g，0.10mmol)的DMF(0.5mL)溶液。將該溶液在0℃攪拌20分鐘，然后在室溫下攪拌10分鐘。加入甲醇(4mL)猝滅反應(yīng)，并真空蒸發(fā)。將粗產(chǎn)物在硅膠上用甲醇/二氯甲烷(1∶9)作洗脫劑純化。收集含產(chǎn)物的流分，真空蒸發(fā)，得到為無(wú)色固體狀的所需產(chǎn)物(13.0mg)。
1H NMR(CD3CN)δ0.69(s，3H)，3.46-4.00(重疊m，7H)，5.83(s br，2H)，6.06(s，1H)，7.45(s，1H)，8.05(s，1H)。
ES-MS實(shí)測(cè)值359.1(M+H+)，對(duì)C12H15BrN4O4+H+的計(jì)算值359.04。
實(shí)施例192-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 將2-氨基-4-氯-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(實(shí)施例4，步驟B)(20mg，0.07mmol)在EtOH(1.0mL)、吡啶(0.1mL)和10％Pd/C(6mg)中的混合物在H2氣氛(大氣壓)、室溫下攪拌過(guò)夜。將該混合物用經(jīng)EtOH徹底洗滌過(guò)的硅藻土墊過(guò)濾。蒸發(fā)合并的濾液，并在硅膠柱上用CH2Cl2/MeOH，20/1和10/1作洗脫劑進(jìn)行純化，得到為白色固體狀的標(biāo)題化合物(16mg)。
1H NMR(200MHz，CD3OD)δ0.86(s，3H，2’C-Me)，3.82(dd，J5’4’＝3.6Hz，J5’，5”＝12.7Hz，1H，H-5’)，3.94-4.03(m，2H，H-5’，H-4’)，4.10(d，J3’4’＝8.8Hz，1H，H-3’)，6.02(s，1H，H-1’)，6.41(d，J5，6＝3.8Hz，1H，H-5)，7.39(d，1H，H-6)，8.43(8，1H，H-4).ES MS281.4(MH+).
實(shí)施例202-氨基-5-甲基-7-(2-C，2-O-二甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮 步驟A2-氨基-4-氯-7-[3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基]-5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶向?qū)嵤├?步驟C所得產(chǎn)物(1.57g，3.16mmol)的CH2Cl2(50mL)冰冷溶液中滴加HBr(5.7M乙酸溶液；3.3mL)。將該反應(yīng)混合物在0℃攪拌1小時(shí)，然后在室溫下攪拌2小時(shí)，真空濃縮，并與甲苯(2×20mL)共蒸發(fā)。將殘余的油溶于MeCN(20mL)中，并滴加到2-氨基-4-氯-5-甲基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶鈉鹽的乙腈溶液[由2-氨基-4-氯-5-甲基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶[其制備參見(jiàn)Liebigs Ann.Chem.1984708-721](1.13g，6.2mmol)在無(wú)水乙腈(150mL)和NaH(60％，在礦物油中，248mg，6.2mmol)中的溶液經(jīng)過(guò)在室溫下2小時(shí)的劇烈攪拌而原位生成]中。將合并的混合物在室溫下攪拌24小時(shí)，然后蒸發(fā)至干燥。將殘余物懸浮于水(100mL)中，并用EtOAc(300+150mL)萃取。將合并的萃取液用鹽水(100mL)洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)。將粗產(chǎn)物在硅膠柱(5×7cm)上用乙酸乙酯/己烷(0-30％EtOAc，5％步驟梯度)作洗脫劑進(jìn)行純化。將含有產(chǎn)物的流分合并，真空蒸發(fā)，得到為無(wú)色泡沫狀的所需產(chǎn)物(0.96g)。
步驟B2-氨基-4-氯-7-[3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2-C，2-O-二甲基-β-D-呋喃核糖基]-5-甲基-7-吡咯并[2，3-d]嘧啶向步驟A所得產(chǎn)物(475mg，0.7mmol)的THF(7mL)冰冷混合物中加入NaH(60％，在礦物油中，29mg)，并在0℃攪拌0.5小時(shí)。然后加入MeI(48μL)，將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。用MeOH猝滅反應(yīng)，然后蒸發(fā)混合物。將粗產(chǎn)物在硅膠柱(5×3.5cm)上用己烷/乙酸乙酯(9/1，7/1，5/1和3/1)作洗脫劑進(jìn)行純化。將含有產(chǎn)物的流分合并，真空蒸發(fā)，得到為無(wú)色泡沫狀的所需產(chǎn)物(200mg)。
步驟C2-氨基-7-[3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2-C，2-O-二甲基-β-D-呋喃核糖基]-5-甲基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮將步驟B所得產(chǎn)物(200mg，0.3mmol)在1，4-二噁烷(15mL)和NaOH水溶液(2N，15mL)在耐壓瓶中于135℃加熱過(guò)夜。然后將該混合物冷卻至0℃，用2N含水HCl中和，蒸發(fā)至干燥。將粗產(chǎn)物懸浮于MeOH中，過(guò)濾，并用MeOH充分洗滌該固體。將合并后的濾液濃縮，將殘余物在硅膠柱(5×5cm)上用CH2Cl2/MeOH(40/1，30/1和20/1)作洗脫劑進(jìn)行純化，得到為無(wú)色泡沫狀的所需化合物(150mg)。
步驟D2-氨基-5-甲基-7-(2-C，2-O-二甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮將步驟C所得產(chǎn)物(64mg，0.1mmol)在MeOH(5mL)和Et3N(0.2mL)以及10％Pd/C(24mg)中的混合物在Parr氫化器上50psi、室溫下氫化1.5天，然后通過(guò)經(jīng)MeOH充分洗滌的硅藻土墊過(guò)濾。蒸發(fā)合并后的濾液，并將殘余物在硅膠柱(3×4cm)上用CH2Cl2/MeOH(30/1，20/1)作洗脫劑進(jìn)行純化，得到2-氨基-5-甲基-7-(5-O-芐基-2-C，2-O-二甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮。將該化合物(37mg)在EtOH(2mL)中、大氣壓的氫氣氣氛下用10％ Pd/C進(jìn)一步氫化。在室溫下攪拌2天后，將反應(yīng)混合物通過(guò)硅藻土過(guò)濾，蒸發(fā)濾液，并將粗產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱(1×7cm)用CH2Cl2/MeOH(30/1，20/1和10/1)作洗脫劑進(jìn)行純化，冷凍干燥后得到標(biāo)題化合物(12mg)。1H NMR(200MHz，CD3OD)δ0.81(s，3H，2’C-Me)，2.16(d，JH-6，C5-Me＝1.3Hz，3H，C5-Me)，3.41(8，3H，2’-OMe)，3.67(dd，J5’4’＝3.4Hz，J5’，5”＝12.6Hz，1H，H-5’)，3.81-3.91(m，3H，H-5”，H-4’，H-3’)，6.10(s，1H，H-1’)，6.66(d，1H，H-6).
ES MS323.3(M-H)+.
實(shí)施例214-氨基-5-甲基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 步驟A4-氯-7-[3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-3-C-甲基-β-D-呋喃核糖基]-5-甲基-7H吡咯并[2，3-d]嘧啶向?qū)嵤├?步驟C所得產(chǎn)物(1.06g，2.1mmol)的CH2Cl2(30mL)冰冷溶液中滴加HBr(5.7M乙酸溶液；2.2mL)。將該反應(yīng)混合物在0℃攪拌1小時(shí)，然后在室溫下攪拌2小時(shí)，真空濃縮，并與甲苯(2×15mL)共蒸發(fā)。將所得的油溶于MeCN(10mL)中，并滴加到4-氯-5-甲基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶鈉鹽的乙腈溶液[由4-氯-5-甲基-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶[其制備參見(jiàn)J.Med.Chem.331984(1990)](0.62g，3.7mmol)在無(wú)水乙腈(70mL)和NaH(60％，在礦物油中，148mg，3.7mmol)中的溶液經(jīng)過(guò)在室溫下2小時(shí)的劇烈攪拌而原位生成]中。將合并的混合物在室溫下攪拌24小時(shí)，然后蒸發(fā)至干燥。將殘余物懸浮于水(100mL)中，并用EtOAc(250+100mL)萃取。將合并后的萃取液用鹽水(50mL)洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)。將粗產(chǎn)物在硅膠柱(5×5cm)上用己烷/乙酸乙酯(9/1，5/1，3/1)作洗脫劑進(jìn)行純化。將含有產(chǎn)物的流分合并，真空蒸發(fā)，得到為無(wú)色泡沫狀的所需產(chǎn)物(0.87g)。
步驟B4-氯-5-甲基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶在-78℃，向步驟A所得化合物(0.87g，0.9mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液中滴加三氯化硼(1M二氯甲烷溶液，9.0mL，9.0mmol)。將該混合物在-78℃攪拌2.5小時(shí)，然后在-30℃至-20℃攪拌3小時(shí)。加入甲醇/二氯甲烷(1∶1)(9mL)猝滅反應(yīng)，然后將所得混合物在-15℃攪拌30分鐘，再在0℃用氨水中和，并在室溫下攪拌15分鐘。過(guò)濾固體，用CH2Cl2/MeOH(1/1，50mL)洗滌。蒸發(fā)合并后的濾液，將殘余物在硅膠柱(5×5cm)上用CH2Cl2和CH2Cl2/MeOH(40/1和30/1)梯度作洗脫劑進(jìn)行純化，得到為無(wú)色泡沫狀的所需化合物(0.22g)。
步驟C4-氨基-5-甲基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶向步驟B所得化合物(0.2g，0.64mmol)中加入甲醇氨(在0℃飽和；40mL)。將該混合物在不銹鋼高壓釜中、100℃加熱14小時(shí)，然后冷卻并真空蒸發(fā)。將粗混合物在硅膠柱(5×5cm)上用CH2Cl2/MeOH(50/1，30/1，20/1)梯度作洗脫劑進(jìn)行純化，得到為白色固體狀的標(biāo)題化合物(0.12g)。
1H NMR(DMSO-d6)δ0.60(s，3H，2’C-Me)，2.26(s，3H，5C-Me)，3.52-3.61(m，1H，H-5’)，3.70-3.88(m，3H，H-5”，H-4’，H-3’)，5.00(s，1H，2’-OH)，4.91-4.99(m，3H，2’-OH，3’-OH，5’-OH)，6.04(s，1H，H-1’)，6.48(br s，2H，NH2)，7.12(s，1H，H-6)，7.94(s，1H，H-2).ES MS295.2(MH+).
實(shí)施例224-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-羧酸 將實(shí)施例6的化合物(0.035g，0.11mmol)溶解于氨水(4mL，30wt％)和飽和甲醇氨(2mL)的混合物中，加入H2O2的水溶液(2mL，35wt％)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。減壓除去溶劑，將所得殘余物通過(guò)HPLC在反相柱(Altech Altima C-18，10×299mm，A＝水，B＝乙腈，10-60％B，50分鐘，流速2mL/分鐘)上提純，得到為白色固體狀的標(biāo)題化合物(0.015g，41％)。
1H NMR(CD3OD)δ0.85(s，3H，Me)，3.61(m，1H)，3.82(m，1H)3.99-4.86(m，2H)，6.26(s，1H)，8.10(s，2H)8.22(s，1H)；13C NMR(CD3OD)20.13，61.37，73.79，80.42，84.01，93.00，102.66，112.07，130.07，151.40，152.74，159.12，169.30.HRMS(FAB)對(duì)C13H17N4O6+的計(jì)算值325.1148，實(shí)測(cè)值325.1143。
實(shí)施例234-氨基-7-(2-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶
步驟A3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2-C-乙烯基-1-O-甲基-α-D-呋喃核糖氯化鈰七水合物(50g，134.2mmol)在經(jīng)過(guò)預(yù)熱的研缽中仔細(xì)碾碎，并移至裝備有機(jī)械攪拌器的圓底燒瓶中。將該燒瓶在高真空下、160℃加熱過(guò)夜。在氬氣下釋放真空，并將燒瓶冷卻至室溫。將無(wú)水THF(300mL)插套管加入燒瓶中。將所得懸浮液在室溫下攪拌4小時(shí)，然后冷卻至-78℃。加入溴化乙烯鎂(1M在THF中的溶液，120mL，120mmol)，并在-78℃繼續(xù)攪拌2小時(shí)。向該懸浮液中加入3，5-二-O-(2，4二氯苯基甲基)-1-O-甲基-α-D-赤蘚-呋喃戊-2-酮糖(14g，30mmol)[由實(shí)施例2，步驟B獲得]在無(wú)水THF(100mL)中的溶液，在恒定攪拌下滴加。將該反應(yīng)物在-78℃攪拌4小時(shí)。用飽和氯化銨溶液猝滅反應(yīng)，并使其回復(fù)至室溫。將該混合物通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾，并將殘余物用Et2O(2×500mL)洗滌。分離有機(jī)層，并用Et2O(2×200mL)萃取水層。將合并后的有機(jī)層經(jīng)無(wú)水Na2SO4干燥，濃縮為粘稠的黃色油。將該油通過(guò)快速層析(SiO2，10％EtOAc的己烷溶液)純化。得到為淡黃色油狀的標(biāo)題化合物(6.7g，13.2mmol)。
步驟B4-氯-7-[3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶在-20℃，向步驟A所得化合物(6.4g，12.6mmol)的無(wú)水二氯甲烷(150mL)溶液中滴加HBr(30％AcOH溶液，20mL，75.6mmol)。將所得溶液在-10℃至0℃攪拌4小時(shí)，真空蒸發(fā)，并與無(wú)水甲苯(3×40mL)共蒸發(fā)。在-20℃，將油狀殘余物溶解于無(wú)水乙腈(100mL)中，并加入到4-氯-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶鈉鹽(5.8g，37.8mmol)的乙腈溶液[如實(shí)施例2中所述原位生成]中。使所得混合物回復(fù)至室溫，并在室溫下攪拌24小時(shí)。然后將混合物蒸發(fā)至干燥，溶于水中，用EtOAc(2×300mL)萃取。將合并后的萃取液用Na2SO4干燥，過(guò)濾并蒸發(fā)。將粗混合物通過(guò)快速層析(SiO2，10％EtOAc己烷溶液)提純，分離得到為白色泡沫狀的標(biāo)題化合物(1.75g)。
步驟C4-氨基-7-[3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶將步驟B的化合物(80，mg)溶于最小量的1，4-二噁烷中，并放置在不銹鋼高壓氣體貯罐中。將該罐冷卻至-78℃，并加入液態(tài)氨。將該罐密封，并在90℃加熱24小時(shí)。使氨蒸發(fā)，并將殘余物濃縮成白色固體，將其直接用于后續(xù)步驟，無(wú)需進(jìn)一步提純。
步驟D4-氨基-7-(2-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶在-78℃，向步驟C所得化合物(60mg)的二氯甲烷溶液中滴加三氯化硼(1M二氯甲烷溶液)。將該混合物在-78℃攪拌2.5小時(shí)，然后在-30℃至-20℃攪拌3小時(shí)。通過(guò)加入甲醇/二氯甲烷(1∶1)猝滅反應(yīng)，并將所得混合物在-15℃攪拌0.5小時(shí)，然后在0℃用氨水中和，并在室溫下攪拌15分鐘。過(guò)濾固體，用甲醇/二氯甲烷(1∶1)洗滌。將合并的濾液蒸發(fā)，通過(guò)快速層析(SiO2，10％甲醇的EtOAc溶液，含有0.1％三乙胺)提純殘余物。將含有產(chǎn)物的流分蒸發(fā)，得到為白色固體狀的標(biāo)題化合物(10mg)。
1H NMR(DMSO-d6)δ3.6(m，1H，H-5’)，3.8(m，1H，H-5”)，3.9(m d，1-H，H-4’)，4.3(t，1H，H-3’)，4.8-5.3(m，6H，CH＝CH2，2’-OH，3’-OH，5’-OH)6.12(s，1H，H-1’)，6.59(d，1H，H-5)，7.1(br s，1H，NH2)，7.43(d，1H，H-6)，8.01(s，1H，H-2).
ES-MS實(shí)測(cè)值291.1(M-H-)；計(jì)算值C13H16N4O4-H-291.2.
實(shí)施例244-氨基-7-(2-C-羥基甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 步驟A4-氯-7[3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2-C-羥基甲基-β-D-呋喃核糖基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶向?qū)嵤├?3步驟B所得化合物(300mg，0.48mmo1)的1，4-二噁烷(5mL)溶液中加入N-甲基嗎啉-N-氧化物(300mg，2.56mmol)和四氧化鋨(4％水溶液，0.3mL)。將該混合物遮光攪拌14小時(shí)。通過(guò)硅藻土填料過(guò)濾移出沉淀，用水(3×)稀釋，并用EtOAc萃取。將EtOAc層Na2SO4干燥，真空濃縮。將油狀殘余物溶于二氯甲烷(5mL)中，并在硅膠上經(jīng)NaIO4(3g，10％NaIO4)攪拌12小時(shí)。過(guò)濾除去硅膠，蒸發(fā)殘余物，收集進(jìn)無(wú)水乙醇(5mL)中。將溶液在冰浴中冷卻，并以小份加入硼氫化鈉(300mg，8mmol)。將所得混合物在室溫下攪拌4小時(shí)，然后用EtOAc稀釋。將有機(jī)層用水(2×20mL)、鹽水(20mL)洗滌，經(jīng)Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑，將殘余物通過(guò)快速層析(SiO2，2∶1己烷/EtOAc)提純，得到為白色小薄片狀的標(biāo)題化合物(160mg，0.25mmol)。
步驟B4-氨基-7[3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2-C-羥基甲基-β-D-呋喃核糖基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶將步驟A的化合物(150mg，0.23mmol)溶于最小量的1，4-二噁烷(10mL)中，并放置在不銹鋼高壓氣體貯罐中。將該罐冷卻至-78℃，并加入液態(tài)氨。將該罐密封，并在90℃加熱24小時(shí)。使氨蒸發(fā)，并將殘余物濃縮成白色固體，將其直接用于后續(xù)步驟，無(wú)需進(jìn)一步提純。
步驟C4-氨基-7-(2-C-羥基甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶將步驟B所得化合物(120mg，0.2mmol)溶于1∶1甲醇/二氯甲烷中，加入10％Pd-C，并將該懸浮液在H2氣氛下攪拌12小時(shí)。通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾除去催化劑，用大量甲醇洗滌。真空蒸發(fā)合并后的濾液，將殘余物通過(guò)快速層析(SiO2，10％甲醇的EtOAc溶液，含有0.1％三乙胺)提純，得到為白色粉末狀的標(biāo)題化合物(50mg)。
1H NMR(CD3OD)δ3.12(d，1H，CH2’)，3.33(d，1H，CH2”)，3.82(m，1H，H5’)，3.99-4.1(m，2H，H4’，H-5”)，4.3(d，1H，H-3’)，6.2(s，1H，H-1’)，6.58(d，1H，H-5)，7.45(d，1H，H-6)，8.05(s，1H，H-2).
LC-MS實(shí)測(cè)值297.2(M+H+)；對(duì)C12H16N4O5+H+的計(jì)算值297.3。
實(shí)施例254-氨基-7-(2-C-氟甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 步驟A4-氯-7-[3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2-C-氟甲基-β-D-呋喃核糖基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶在氬氣氣氛下，向?qū)嵤├?4步驟A所得化合物(63mg，0.1mmol)的無(wú)水二氯甲烷(5mL)溶液中加入4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(2mg，0.015mmol)和三乙胺(62μL，0.45mmol)。將該溶液在冰浴中冷卻，并加入對(duì)甲苯磺酰氯(30mg，0.15mmol)。將反應(yīng)物在室溫下攪拌過(guò)夜，用NaHCO3(2×10mL)、水(10mL)、鹽水(10mL)洗滌，并經(jīng)Na2SO4干燥，真空濃縮成粉紅色固體。將該固體溶于無(wú)水THF(5mL)中，并在冰浴中冷卻。加入氟化四丁銨(1M THF溶液，1mL，1mmol)，將該混合物在室溫下攪拌4小時(shí)。真空除去溶劑，將殘余物收集進(jìn)二氯甲烷中，并用NaHCO3(2×10mL)、水(10mL)和鹽水(10mL)洗滌。將二氯甲烷層經(jīng)無(wú)水Na2SO4干燥，真空濃縮，并經(jīng)快速層析(SiO2，2∶1己烷/EtOAc)提純，得到為白色固體狀的標(biāo)題化合物(20mg)。
步驟B4-氨基-7-[3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2-C-氟甲基-β-D-呋喃核糖基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶將步驟A所得化合物(18mg，0.03mmol)溶于最小量的1，4-二噁烷中，并放置在不銹鋼高壓氣體貯罐中。將該罐冷卻至-78℃，并加入液態(tài)氨。將該罐密封，并在90℃加熱24小時(shí)。使氨蒸發(fā)，并將殘余物濃縮成白色固體，將其直接用于后續(xù)步驟，無(wú)需進(jìn)一步提純。
步驟C4-氨基-7-(2-C-氟甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶將步驟B所得化合物(16mg)溶于1∶1甲醇/二氯甲烷中，加入10％Pd-C，并將該懸浮液在H2氣氛下攪拌12小時(shí)。通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾除去催化劑，用大量甲醇洗滌。真空蒸發(fā)合并后的濾液，將殘余物通過(guò)快速層析(SiO2，10％甲醇的EtOAc溶液，含有0.1％三乙胺)提純，得到為白色粉末狀的標(biāo)題化合物(8mg)。
1H NMR(DMSO-d6)δ3.6-3.7(m，1H，H-5’)，3.8-4.3(m，5H，H-5”，H-4’，H-3’，CH2)5.12(t，1H，5’-OH)，5.35(d，1H，3’-OH)，5.48(s，1H，2’-OH)，6.21(s，1H，H-1’)，6.52(d，1H，H-5)，6.98(br s，2H，NH2)，7.44(d，1H，H-6)，8.02(s，1H，H-2).19F NMR(DMSO-d6)δ-230.2(t).
ES-MS實(shí)測(cè)值299.1(M+H+)，計(jì)算值C12H15FN4O4+H+299.27.
實(shí)施例26和274-氨基-7-(3-脫氧-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶和4-氨基-7-(3-脫氧-2-C-甲基-β-D-阿糖呋喃基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 步驟A7-[2，5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-β-D-呋喃核糖基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶和7-[3，5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-β-D-呋喃核糖基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶向殺結(jié)核菌素(5.0g，18.7mmol)在吡啶(7.5mL)和DMF(18.5mL)混合物中的經(jīng)過(guò)攪拌的溶液中加入硝酸銀(6.36g，38.8mmol)。將該混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。將其在冰浴中冷卻，加入THF(37.4mL)和氯化叔丁基二甲基甲硅烷(5.6g，37mmol)，并將該混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。然后通過(guò)硅藻土墊過(guò)濾該混合物，并用THF洗滌。用含少量氯仿的醚稀釋濾液和洗滌液。用碳酸氫鈉和水(3×50mL)連續(xù)洗滌有機(jī)層，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮。通過(guò)與甲苯共蒸發(fā)除去吡啶，將殘余物通過(guò)用5-7％MeOH的CH2Cl2溶液作洗脫劑的硅膠快速層析提純，得到3.0g。
步驟B7-[2，5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-β-D-呋喃核糖基)]-4-[二-(4-甲氧基苯基)苯基甲基]氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶和7-[3，5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-β-D-呋喃核糖基]-4-[二-(4-甲氧基苯基)苯基甲基]氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶向步驟A所得化合物混合物(3.0g，6.0mmol)的無(wú)水吡啶(30mL)溶液中加入4，4’-二甲氧基三苯甲基氯(2.8g，8.2mmol)，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。然后用含水吡啶研磨該混合物，用乙醚萃取。用水洗滌有機(jī)層，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，并濃縮成黃色泡沫(5.6g)。將殘余物通過(guò)用20-25％EtOAc的己烷溶液作洗脫劑的硅膠快速層析提純。收集適當(dāng)?shù)牧鞣?，并濃縮得到為無(wú)色泡沫狀的2’，5’-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-和3’，5’-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)保護(hù)的核苷(分別為2.2g和1.0g)。
步驟C7-[2，5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-O-甲苯磺?；?β-D-呋喃核糖基)]-4-[二-(4-甲氧基苯基)苯基甲基]氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶向步驟B所得2’，5’-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)保護(hù)的核苷(2.0g，2.5mmol)的吡啶(22mL)冰冷卻溶液中加入對(duì)甲苯磺酰氯(1.9g，9.8mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌4天。然后用含水吡啶(50％，10mL)研磨，用含少量CH2Cl2(10mL)的乙醚(3×50mL)萃取。用碳酸氫鈉和水(3×30mL)洗滌有機(jī)層。將有機(jī)層用無(wú)水Na2SO4干燥并濃縮。通過(guò)與甲苯(3×25mL)共蒸發(fā)除去吡啶。將殘余的油通過(guò)硅膠墊過(guò)濾，用己烷∶乙酸乙酯(70∶30)作洗脫劑，得到1.4g。
步驟D4-[二-(4-甲氧基苯基)苯基甲基]氨基-7-[3-O-甲苯磺?；?β-D-呋喃核糖基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶將步驟C所得化合物(1.0g，1.1mmol)和THF(10mL)的溶液用氟化四丁銨(1M THF溶液，2.5mL)攪拌0.5小時(shí)。將該混合物冷卻，并用乙醚(50mL)稀釋。用水(3×50mL)洗滌溶液，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮成油。使該殘余物通過(guò)用己烷∶乙酸乙酯(1∶1)作洗脫劑的硅膠墊進(jìn)行提純，得到780mg。
步驟E4-氨基-7-(3-脫氧-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶和4-氨基-7-(3-脫氧-2-C-甲基-β-D-阿糖呋喃基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶將CH3MgI(3.0M乙醚溶液，3.0mL)的無(wú)水甲苯(3.75mL)溶液在冰浴中冷卻。向其中加入步驟D所得化合物(500mg，0.8mmol)的無(wú)水甲苯(3.7mL)溶液。將所得混合物在室溫下攪拌3.5小時(shí)。將其冷卻，并用含水NH4Cl溶液處理，用乙醚(50mL，含10mLCH2Cl2)萃取。分離有機(jī)層，用鹽水(2×30mL)和水(2×25mL)洗滌，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥，并濃縮成油，將該油通過(guò)用4％MeOH的Ch2Cl2溶液作洗脫劑的硅膠快速層析提純，得到2-C-α-甲基化合物(149mg)和2-C-β-甲基化合物(34mg)。將這些衍生物分別用80％乙酸處理，并將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2.5小時(shí)。通過(guò)反復(fù)與乙醇和甲苯共蒸發(fā)除去乙酸。將殘余物在氯仿和水之間分配。將水層用氯仿洗滌并濃縮。將蒸發(fā)后的殘余物通過(guò)用5-10％MeOH的CH2Cl2溶液作洗脫劑的硅膠提純，得到為白色固體狀的所需化合物。
4-氨基-7-(3-脫氧-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(9.0mg)1H NMR(DMSO-d6)δ0.74(s，3H，CH3)，1.77(dd，1H，H-3’)，2.08(t，1H，H-3”)，3.59(m，1H，H-5’)，3.73(m，1H，H-5”)，4.15(m，1H，H-4’)，5.02(t，1H，OH-5’)，5.33(s，1H，OH-2’)，6.00(s，1H，H-1’)，6.54(d，1H，H-7)，6.95(br s，2H，NH2)，7.47(d，1H，H-8)，8.00(s，1H，H-2)；ES-MS263.1[M-H].
4-氨基-7-(3-脫氧-2-C-甲基-β-D-阿糖呋喃基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(15mg)1H NMR(DMSO-d6)δ1.23(s，3H，CH3)，2.08(ddd，2H，H-3’和3”)，3.57(m，2H，H-5’和5”)，4.06(m，1H，H-4)，5.10(s，1H，OH-2’)，5.24(t，1H，OH-5’)，6.01(s，1H，H-1’)，649(d，1H，H-7)，6.89(br s，2H，NH2)，7.35(d，1H，H-8)，8.01(s，1H，H-2).ES-MS265.2[M+H].
實(shí)施例284-氨基-7-(2，4-C-二甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 步驟A5-脫氧-1，2-O-異亞丙基-D-呋喃木糖(xylofuranose)將1，2-O-異亞丙基-D-呋喃木糖(38.4g，0.2mol)、4-二甲基氨基吡啶(5g)、三乙胺(55.7mL，0.4mol)溶于二氯甲烷(300mL)中。加入對(duì)甲苯磺酰氯(38.13g，0.2mol)，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物倒進(jìn)飽和碳酸氫鈉水溶液(500mL)中，分離為兩層。用檸檬酸水溶液(20％，200mL)洗滌有機(jī)層，干燥(Na2SO4)，蒸發(fā)得到固體(70.0g)。將該固體溶于無(wú)水THF(300mL)中，在30分鐘內(nèi)分次加入LiAlH4(16.0g，0.42mol)。將該混合物在室溫下攪拌15。在30分鐘內(nèi)滴加乙酸乙酯(100mL)，將混合物通過(guò)硅膠床過(guò)濾。濃縮濾液，將所得油通過(guò)硅膠(EtOAc/己烷1/4)層析，得到為固體狀的產(chǎn)物(32.5g)。
步驟B3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-1-O-甲基-4-甲基-α-D-呋喃核糖在冰-水浴中，將氧化鉻(50g，0.5mol)、乙酸酐(50mL，0.53mol)和吡啶(100mL，1.24mol)加入到二氯甲烷(1L)中，將該混合物攪拌15分鐘。加入5-脫氧-1，2-O-異亞丙基-D-呋喃木糖(32g，0.18mol)的二氯甲烷(200mL)溶液，將該混合物在相同溫度下攪拌30分鐘。用乙酸乙酯(1L)稀釋反應(yīng)溶液，通過(guò)硅膠床過(guò)濾。濃縮濾液得到黃色油。將該油溶于1，4-二噁烷(1L)和甲醛(37％，200mL)中。將溶液冷卻至0℃，加入固體KOH(50g)。將該混合物在室溫下攪拌過(guò)夜，然后用乙酸乙酯(6×200mL)萃取。濃縮后，將殘余物經(jīng)硅膠(EtOAc)層析，得到為油狀物的產(chǎn)物(1.5g)。將該油溶于1-甲基-2-吡咯烷酮(20mL)中，加入2，4-二氯苯基甲基氯(4g，20.5mmol)和NaH(60％，0.8g)。將該混合物攪拌過(guò)夜，并用甲苯(100mL)稀釋。然后將混合物用飽和碳酸氫鈉水溶液(3×50mL)洗滌，干燥(Na2SO4)，并蒸發(fā)。將殘余物溶于甲醇(50mL)中，加入HCl的二噁烷(4M，2mL)溶液。將溶液攪拌過(guò)夜并蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)硅膠(EtOAc/己烷1/4)層析，得到為油狀物的產(chǎn)物(2.01g)。
步驟C3，5-二-O-(2，4-氯苯基甲基)-2，4-二-C-甲基-1-O-甲基-α-D-呋喃核糖將步驟B所得產(chǎn)物(2.0g，4.0mmol)和Dess-Martin periodinane(2.0g)的二氯甲烷(30mL)溶液在室溫下攪拌過(guò)夜，然后減壓濃縮。將殘余物用乙醚(50mL)研磨并過(guò)濾。用Na2S2O3·5H2O(2.5g)在飽和碳酸氫鈉水溶液(50mL)中的溶液洗滌濾液，干燥(MgSO4)，過(guò)濾并蒸發(fā)。在-78℃，將殘余物溶于無(wú)水Et2O(20mL)中，并滴加到MeMgBr的Et2O溶液(3M，10mL)中。將反應(yīng)混合物加熱至-30℃，并在-30℃至-15℃攪拌5小時(shí)，然后倒進(jìn)飽和氯化銨水溶液(50mL)中。分離成兩層，干燥(MgSO4)有機(jī)層，過(guò)濾并濃縮。將殘余物經(jīng)硅膠層析(EtOAc/己烷1/9)，得到為糖漿狀的標(biāo)題化合物(1.40g)。
步驟D4-氯-7-[3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2，4-二-C-甲基-β-D-呋喃核糖基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶向步驟C所得化合物(0.70g，1.3mmol)中加入HBr(5.7M乙酸溶液，2mL)。將所得溶液在室溫下攪拌1小時(shí)，真空蒸發(fā)，并與無(wú)水甲苯(3×10mL)共蒸發(fā)。將4-氯-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(0.5g，3.3mmol)和粉末狀的KOH(85％，150mg，2.3mmol)在1-甲基-2-吡咯烷酮(5mL)中攪拌30分鐘，并將該混合物與甲苯(10mL)共蒸發(fā)。將所得溶液倒進(jìn)上面的溴糖殘余物中，并將該混合物攪拌過(guò)夜。用甲苯(50mL)稀釋該混合物，用水(3×50mL)洗滌，減壓濃縮。將殘余物通過(guò)用EtOAc/己烷(15/85)洗脫的硅膠層析，得到固體(270mg)。
步驟E4-氨基-7-(2，4-C-二甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶在不銹鋼高壓釜中，將步驟D所得化合物(270mg)溶于二噁烷(2mL)中，加入液態(tài)氨(20g)。將該混合物在100℃加熱15，然后冷卻并蒸發(fā)。將殘余物通過(guò)硅膠層析(EtOAc)，得到固體(200mg)。將固體(150mg)和Pd/C(10％150mg)在甲醇(20mL)中、H2(30psi)氣氛下振蕩3小時(shí)，過(guò)濾并蒸發(fā)。將殘余物通過(guò)硅膠層析(MeOH/CH2Cl21/9)，得到為固體狀的所需產(chǎn)物(35mg)。
1H NMR(DMSO-d6)δ0.65(s，3H)，1.18(s，3H)，3.43(m，2H)，4.06(d，1H，J6.3Hz)，4.87(s，1H)，5.26(br，1H)，5.08(d，1H，J 6.3Hz)，5.25(t，1H，J 3.0Hz)，6.17(s，1H)，6.54(d，1H，J 3.5Hz)，6.97(8，br，2H)，7.54(d，1H，J 3.4Hz)，8.02(s，1H).13C NMR(DMSO-d6)δ18.19，21.32，65.38，73.00，79.33，84.80，90.66，99.09，102.41，121.90，149.58，151.48，157.38.
LC-MS實(shí)測(cè)值295.1(M+H+)；計(jì)算值C13H18N4O4+H+295.1.
實(shí)施例294-氨基-7-(3-脫氧-3-氟-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶
步驟A3-脫氧-3-氟-1-O-甲基-5-O-甲苯?；?α-D-呋喃核糖1，2-O-異亞丙基-D-呋喃木糖(9.0g，50mmol)和對(duì)甲苯酰氯(7.0mL，50mmol)的吡啶(50mL)溶液攪拌30分鐘。加入水(10mL)，減壓濃縮混合物。將殘余物溶于甲苯(500mL)中，并用水(200mL)和飽和碳酸氫鈉水溶液(200mL)洗滌該溶液。兩層分離，蒸發(fā)有機(jī)層。將殘余物溶于甲醇(100mL)中，加入HCl的二噁烷溶液(4M，10mL)。將該混合物在室溫下攪拌過(guò)夜，然后減壓蒸發(fā)。將所得油通過(guò)硅膠層析(EtOAc/己烷1/1)，得到油(10.1g)。將該油溶于二氯甲烷(100mL)中，加入三氟化二乙基氨基硫(DAST)(5.7mL)。將該混合物攪拌過(guò)夜，然后倒進(jìn)飽和碳酸氫鈉水溶液(100mL)中。用甲苯(2×50mL)萃取該混合物，濃縮合并后的有機(jī)層。將殘余物通過(guò)硅膠層析(EtOAc/己烷15/85)，得到為油狀物的標(biāo)題化合物(1.50g)。
步驟B3-脫氧-3-氟-2-C-甲基-1-O-甲基-5-O-甲苯酰基-α-D-呋喃核糖將步驟A所得產(chǎn)物(1.0g，3.5mmol)和Dess-Martin periodinane(2.5g)的二氯甲烷(20mL)溶液在室溫下攪拌過(guò)夜，然后減壓濃縮。將殘余物用乙醚(50mL)研磨并過(guò)濾。用Na2S2O3·5H2O(12.5g)在飽和碳酸氫鈉水溶液(100mL)中的溶液洗滌濾液，干燥(MgSO4)，過(guò)濾并蒸發(fā)。將殘余物溶于無(wú)水THF(50mL)中，在-78℃加入TiCl4(3mL)和溴化甲基鎂的乙醚溶液(3M，10mL)，并將混合物在-50℃至-30℃攪拌2小時(shí)。將混合物倒進(jìn)飽和碳酸氫鈉水溶液(100mL)中并經(jīng)硅藻土過(guò)濾。用甲苯(100mL)萃取該濾液，蒸發(fā)。將殘余物通過(guò)硅膠層析(EtOAc/己烷15/85)，得到為油狀物的標(biāo)題化合物(150mg)。
步驟C4-氨基-7-(3-脫氧-3-氟-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶將步驟B所得產(chǎn)物(150mg，0.5mmol)溶于HBr(30％)的乙酸(2mL)溶液中。1小時(shí)后，減壓蒸發(fā)該混合物，并與甲苯(10mL)共蒸發(fā)。將4-氯-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶(0.5g，3.3mmol)和粉末狀的KOH(85％，150mg，2.3mmol)在DMF(3mL)中攪拌30分鐘，并將該混合物與甲苯(2mL)共蒸發(fā)。將所得溶液倒進(jìn)上面的溴糖中，并將該混合物攪拌過(guò)夜。用甲苯(50mL)稀釋該混合物，用水(3×50mL)洗滌，減壓濃縮。將殘余物通過(guò)硅膠層析(EtOAc/己烷15/85)，得到油(60mg)。在不銹鋼高壓釜中，將該油溶于二噁烷(2mL)中，并加入液態(tài)氨(20g)。將該混合物在85℃加熱18小時(shí)，然后冷卻并蒸發(fā)。將殘余物通過(guò)硅膠層析(甲醇/二氯甲烷1/9)，得到為固體狀的標(biāo)題化合物(29mg)。
1H NMR(DMSO-d6)δ0.81(s，3H)，3.75(m，2H)，4.16(m，1H)，5.09(dd，1H，J53.2，7.8Hz)，5.26 (br，1H)，5.77(s，1H)，6.15(d，1H，J 2.9Hz)，6.59(d，1H，J 3.4Hz)，7.02(s br，2H)，7.39(d，1H，J3.4Hz)，8.06(s，1H).
13C NMR(DMSO-d6)19.40，59.56，77.24，79.29，90.15，91.92，99.88，102.39，121.17，149.80，151.77，157.47.
19F NMR(DMSO-d6)δ14.66(m).
ES-MS實(shí)測(cè)值283.1(M+H+)；對(duì)C12H15FN4O3+H+的計(jì)算值283.1。
實(shí)施例304-氨基-7-(2-C，2-O-二甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 步驟A4-氯-7-[3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2-C，2-O-二甲基-β-D-呋喃核糖基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶向?qū)嵤├?步驟D所得化合物(618mg，1.0mmol)的THF(8mL)預(yù)冷(0℃)溶液中加入甲基碘(709mg，5.0mmol)和NaH(60％，在礦物油中)(44mg，1.1mmol)。將所得混合物在室溫下攪拌過(guò)夜，然后倒進(jìn)飽和氯化銨(50mL)與二氯甲烷(50mL)的經(jīng)攪拌的混合物中。用水(50mL)洗滌有機(jī)層，干燥(MgSO4)，真空蒸發(fā)。將所得粗產(chǎn)物通過(guò)用乙酸乙酯/己烷作洗脫劑的硅膠提純。收集含有產(chǎn)物的流分，真空蒸發(fā)，得到為無(wú)色泡沫狀的所需產(chǎn)物(735mg)。
步驟B4-氨基-7-[3，5-二-O-(2，4-二氯苯基甲基)-2-C，2-O-二甲基-β-D-呋喃核糖基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶向步驟A所得化合物(735mg，1.16mmol)中加入甲醇氨(在0℃飽和)(20mL)。將該混合物在不銹鋼高壓釜中、80℃加熱過(guò)夜，然后冷卻，并真空蒸發(fā)所得高壓釜內(nèi)物質(zhì)。將粗混合物通過(guò)用乙酸乙酯/己烷作洗脫劑的硅膠提純。收集含產(chǎn)物的流分，真空蒸發(fā)，得到為無(wú)色泡沫狀的所需產(chǎn)物(504mg)。
步驟C4-氨基-7-(2-C，2-O-二甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶將步驟C所得產(chǎn)物(64mg，0.1mmol)、MeOH(5mL)和Et3N(0.2mL)以及10％Pd/C(61mg)的混合物在Parr氫化器上50psi、室溫下氫化過(guò)夜。將該混合物通過(guò)硅藻土過(guò)濾，真空蒸發(fā)，并通過(guò)硅膠墊過(guò)濾，用2％甲醇的二氯甲烷溶液作洗脫劑。收集所需產(chǎn)物，并真空蒸發(fā)。將該化合物再溶于甲醇(10mL)中，加入10％Pd/C(61mg)。將該混合物在Parr氫化器上55psi、室溫下氫化兩周。將該混合物通過(guò)硅藻土過(guò)濾，真空蒸發(fā)，并通過(guò)用10％甲醇的二氯甲烷溶液作洗脫劑的硅膠提純。收集含產(chǎn)物的流分，真空蒸發(fā)，得到為無(wú)色泡沫狀的所需產(chǎn)物(110mg)。
1H NMR(DMSO-d6)δ0.68(s，3H，)，3.40(s，3H)，3.52-3.99(重復(fù)m，4H)，4.92(d，1H)，5.07(t，1H)，6.26(s，1H)，6.55(d，1H)，7.00s br，2H)，7.46(d，1H)，8.05(s，1H).
LC-MS實(shí)測(cè)值293.1(M-H+)；對(duì)C12H16N4O4-H+的計(jì)算值293.12。
實(shí)施例314-甲基氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 將實(shí)施例2步驟E所得化合物(200mg，0.67mmol)加入到甲胺(5mL，在小不銹鋼高壓釜中濃縮)中，并在85℃加熱48小時(shí)，然后冷卻，真空蒸發(fā)。將粗混合物通過(guò)用乙醇作洗脫劑的硅膠提純，在用MeCN處理后，分離出的無(wú)定形固體即為標(biāo)題化合物。將該無(wú)定形固體溶于水中，冷凍干燥，得到無(wú)色粉末(144mg)。
1H NMR(DMSO-d6)δ0.63(s，3H，CH3)，3.32(s，3H，N CH3)，3.58-3.67(m，1H，H-5’)，3.79-3.39(m，3H，H-5”，H-4’，H-3’)，5.03(s，1H，2’-OH)，5.04-5.11(1H，3’-OH，1H，5’-OH)，6.14(s，1H，H-1’)，6.58(d，1H，J5，6＝3.6Hz，H-5)，7.46(d，1H，H-6)，7.70(br s，1H，NH)，8.14(s，1H，H-2).
LC-MS實(shí)測(cè)值295.1(M-H+)；對(duì)C13H18N4O4+H+的計(jì)算值294.3。
實(shí)施例324-二甲基氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 將實(shí)施例2步驟E所得化合物(200mg，0.67mmol)加入到二甲胺(5mL在小不銹鋼高壓釜中濃縮)中，并在85℃加熱48小時(shí)，然后冷卻，真空蒸發(fā)。將粗混合物通過(guò)用乙醇作洗脫劑的硅膠提純，在用MeCN處理后，分離出的無(wú)定形固體即為標(biāo)題化合物。將該無(wú)定形固體溶于水中，冷凍干燥，得到無(wú)色粉末(164mg)。
1H NMR(DMSO-d6)δ0.64(s，3H，CH3)，3.29(s，3H，N CH3)，3.32(s，3H，N CH3)，3.60-3.66(m，1H，H-5’)，3.77-3.97(m，3H，H-5”，H-4’，H-3’)，5.04(s，1H，2’-OH)，5.06-5.11(1H，3’-OH，1H，5’-OH)，6.21(s，1H，H-1’)，6.69(d，1H，J5，6＝3.6Hz，H-5)，7.55(d，1H，H-6)，8.13(s，1H，H-2).
LC-MS實(shí)測(cè)值309.3(M-H+)；對(duì)C14H20N4O4+H+的計(jì)算值308.33。
實(shí)施例334-環(huán)丙基氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 將實(shí)施例2步驟E所得化合物(200mg，0.67mmol)加入到環(huán)丙胺(5mL在小不銹鋼高壓釜中濃縮)中，并在85℃加熱48小時(shí)，然后冷卻，真空蒸發(fā)。將粗混合物通過(guò)用乙醇作洗脫劑的硅膠提純，在用MeCN處理后，分離出的無(wú)定形固體即為標(biāo)題化合物。將該無(wú)定形固體溶于水中，冷凍干燥，得到無(wú)色粉末(148mg)。
1H NMR(DMSO-d6)δ0.51-0.58(m，2H)，0.64(s，3H，CH3)，0.74-0.076(m，2H)，3.62-3.67(m，1H，H-5’)，3.79-3.82(m，3H，H-5”)，3.92-3.96(m，H4’，H-3’)，5.03(s，1H，2’-OH)，5.05-5.10(1H，3’-OH，1H，5’-OH)，6.15(s，1H，H-1’)，7.48(d，1H，J5，6＝3.6Hz，H-5)，7.59(d，1H，H-6)，8.13(s，1H，H-2).
LC-MS實(shí)測(cè)值321.1(M-H+)；對(duì)C15H20N4O4+H+的計(jì)算值320.3。
實(shí)施例344-氨基-7-(3-C-甲基-β-D-呋喃木糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 步驟A7-[2，5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-β-D-呋喃核糖基)]-4-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶和7-[3，5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-β-D-呋喃核糖基]-4-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶向?qū)嵤├?6和27步驟A所得化合物的混合物(0.32g，0.65mmol)在無(wú)水吡啶(6mL)的溶液中加入一甲氧基三苯甲基氯(0.30g，0.98mmol)，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。然后濃縮該混合物，并將殘余物在CH2Cl2(70mL)和水(20mL)之間分配。用水和鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2SO4)并濃縮。將殘余物通過(guò)用5-13％EtOAc的己烷溶液作洗脫劑的硅膠柱提純。收集適當(dāng)?shù)牧鞣?，濃縮，得到為無(wú)色泡沫狀的2’，5’-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-和3’，5’-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)保護(hù)的核苷(分別為343mg和84mg)。
步驟B7-[2，5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-β-D-赤蘚-呋喃戊-3-酮糖基]-4-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶在0℃，向三氧化鉻(91mg，0.91mmol)在CH2Cl2(4mL)中的經(jīng)充分?jǐn)嚢璧膽腋∫褐屑尤脒拎?147μL，1.82mmol)，然后加入乙酸酐(86μL，0.91mmol)。將該混合物在室溫下攪拌0.5小時(shí)。然后加入步驟A所得2’，5’-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)保護(hù)的核苷(343mg0.45mmol)的CH2Cl2(2.5mL)溶液，將該混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。然后將混合物倒進(jìn)冰冷的EtOAc(10mL)中，并通過(guò)用EtOAc作洗脫劑的短硅膠柱過(guò)濾。蒸發(fā)濾液，將殘余物通過(guò)用己烷和己烷/EtOAc(7/1)作洗脫劑的硅膠柱提純，得到標(biāo)題化合物(180mg)。
步驟C7-[2，5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶和7-[2，5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-3-C-甲基-β-D-呋喃木糖基)-4-[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基]氨基-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶在室溫下，向MeMgBr(3.0M的乙醚溶液；0.17mL，0.5mmol)在無(wú)水己烷(1.5mL)的混合物中滴加步驟B所得化合物(78mg，0.1mmol)的無(wú)水己烷(0.5mL)溶液。在室溫下攪拌2小時(shí)后，將該反應(yīng)混合物倒進(jìn)冰冷卻的水(10mL)中，用EtOAc(20mL)稀釋，然后通過(guò)硅藻土過(guò)濾，再將其用EtOAc充分洗滌。分離各層，用鹽水洗滌有機(jī)層，干燥(Na2SO4)并濃縮。將殘余物通過(guò)用8-25％EtOAc的己烷溶液作洗脫劑的硅膠柱提純，得到3-C-甲基木(xylo)-(60mg)和3-C-甲基核(ribo)-異構(gòu)體(20mg)。
步驟D4-氨基-7-(3-C-甲基-β-D-呋喃木糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶向步驟C所得3-C-甲基-木異構(gòu)體(60mg，0.08mmol)的THF(2mL)冰冷溶液中加入TBAF(1M的THF溶液；0.32mL，0.32mmol)。將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌5小時(shí)，然后用CH2Cl2(50mL)稀釋，并用水(3×15mL)洗滌，干燥，蒸發(fā)。將殘余物溶于二噁烷(0.3mL)，加入80％乙酸(3mL)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1天，然后蒸發(fā)。將殘余物與二噁烷共蒸發(fā)，收集進(jìn)水(50mL)中，并用CH2Cl2(2×10mL)洗滌。濃縮水層，然后冷凍干燥。將殘余物通過(guò)用CH2Cl2/MeOH(20/1和10/1)作洗脫劑的硅膠柱提純，冷凍干燥后得到為白色絨毛狀化合物的標(biāo)題化合物(10mg)。
1H NMR(CD3CN)δ1.28(s，3H，CH3)，3.56(br s，1H，OH)，3.78(m，3H，H-4’，H-5’，H-5”)，4.10(br s，1H，OH)，4.44(d，1H，J2’1’＝3.9Hz，H-2’)，5.58(d，1H，H-1’)，5.85(br s，2H，NH2)，6.15(br s，1H，OH)，6.48(d，1H，J5，6＝3.7Hz，H-5)，7.23(d，1H，H-6)，8.11(s，1H，H-2).ES-MS281[MH]+.
實(shí)施例354-氨基-7-(3-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 用實(shí)施例32步驟D中所述程序?qū)?shí)施例32步驟C中所得核-異構(gòu)體(20mg)脫保護(hù)，得到標(biāo)題化合物(4mg)。
1H NMR(CD3CN)δ1.43(s，3H，CH3)，3.28(br s，1H，OH)，3.58(m，2H，H-5’，H-5”)，3.99(m，1H，H-4’)，4.10(br s，1H，OH)，4.62(d，1H，J2’1’＝8.1Hz，H-2’)，5.69(d，1H，H-1’)，5.88(br s，3H，OH，NH2)，6.45(br s，1H，OH)，6.51(d，1H，J5，6＝3.7Hz，H-5)，7.19(d，1H，H-6)，8.12(s，1H，H-2).ES-MS281[MH]+.
實(shí)施例362，4-二氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 將實(shí)施例4步驟B中所得產(chǎn)物(24mg)在氨水(30％，10mL)的混合物在不銹鋼高壓釜中、100℃加熱過(guò)夜，然后冷卻并蒸發(fā)。將殘余物通過(guò)用CH2Cl2/MeOH(10/1和5/1)作洗脫劑的硅膠柱提純，得到標(biāo)題化合物(15mg)。
1H NMR(DMSO-d6δ0.68(s，3H，CH3)，3.48-3.58(m 1H，H-5’)，3.68-3.73(m，2H，H-5”，H-4’)，3.84(m，1H，H-3’)，4.72(s，1H，2’-OH)，4.97-5.03(m，2H，3’-OH，5’-OH)，5.45(br s，2H，NH2)，6.00(s，1H，H-1’)，6.28(d，1H，J＝3.7Hz，H-5)，6.44(brs，2H，NH2)6.92(d，1H J＝3.7Hz，H-6).ES MS294.1(M-H+).
實(shí)施例374-氨基-2-氟-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶 在-30℃，向用吡啶(1mL)稀釋后HF/吡啶(70％，2mL)中加入實(shí)施例36所得化合物(60mg，0.2mmol)的0.5mL吡啶溶液，隨后加入亞硝酸叔丁酯(36μL，0.3mmol)。在-25℃繼續(xù)攪拌5分鐘。然后將該溶液倒進(jìn)冰-水(5mL)中，用2N含水NaOH中和，蒸發(fā)至干燥。將殘余物通過(guò)用CH2Cl2/MeOH(20/1和10/1)作洗脫劑的硅膠柱提純，得到標(biāo)題化合物。
實(shí)施例384-氨基-5-氟-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶
步驟A4-乙?；被?7-(2，3，5-三-O-乙?；?2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶向?qū)嵤├?步驟F所得化合物(280mg，1.00mmol)的吡啶溶液中加入乙酸酐(613mg，6.0mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌過(guò)夜，真空蒸發(fā)，將所得粗混合物通過(guò)用乙酸乙酯/己烷作洗脫劑的硅膠提純。收集含有所需產(chǎn)物的流分，真空蒸發(fā)，得到所需產(chǎn)物。
步驟B4-乙?；被?5-溴-7-(2，3，5-三-O-乙?；?2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶向步驟A所得化合物(460mg，1.00mmol)的DMF預(yù)冷卻(0℃)溶液中加入N-溴代丁二酰亞胺(178mg，1.0mmol)的DMF溶液。將所得溶液在0℃攪拌30分鐘，然后再在室溫下攪拌30分鐘。加入甲醇猝滅反應(yīng)，真空蒸發(fā)。將所得粗混合物通過(guò)用乙酸乙酯/己烷作洗脫劑的硅膠提純。收集含有所需產(chǎn)物的流分，真空蒸發(fā)，得到所需產(chǎn)物。
步驟C4-氨基-5-氟-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶向步驟B所得化合物(529mg，1.00mmol)的THF預(yù)冷卻(-78℃)溶液中加入丁基鋰(2M的己烷溶液)(0.5mL，1.00mmol)。將所得溶液在-78℃攪拌30分鐘，然后用N-氟代苯磺二酰亞胺(sulfonimide)(315mg，1.00mmol)的THF溶液猝滅反應(yīng)。使所得溶液非常慢地回復(fù)至室溫，然后將其倒進(jìn)飽和氯化銨水溶液和二氯甲烷的經(jīng)攪拌的混合物中。真空蒸發(fā)有機(jī)相，并在密閉容器中、55℃用氫氧化銨處理過(guò)夜。將所得粗混合物通過(guò)用二氯甲烷/甲醇作洗脫劑的硅膠提純。收集含有所需產(chǎn)物的流分，真空蒸發(fā)，得到所需產(chǎn)物。
生物學(xué)分析下面描述用于測(cè)定對(duì)HCV NS5B聚合酶和HCV復(fù)制的抑制的試驗(yàn)。
在下面的試驗(yàn)中測(cè)定本發(fā)明化合物作為HCV NS5B依賴于RNA的RNA聚合酶(RdRp)的抑制劑的有效性。
A.測(cè)試對(duì)HCV NS5B聚合酶的抑制本試驗(yàn)用于測(cè)定本發(fā)明核苷衍生物抑制丙型肝炎病毒(HCV)的依賴于RNA的RNA聚合酶(NS5B)在異數(shù)RNA模板上的酶活性的能力。
程序試驗(yàn)緩沖條件(50μL-總量/反應(yīng)物)20mM Tris，pH7.550μM EDTA5mM DTT2mM MgCl280mM KCl0.4U/μL RNAsin(Promega，含量(stock)為40單位/μL)0.75μg t500(一個(gè)用T7失控轉(zhuǎn)錄制成的500-nt RNA，具有來(lái)自丙型肝炎基因組的NS2/3區(qū)域的序列)1.6μg純化丙型肝炎NS5B(由21個(gè)C-末端截短的氨基酸形成)1μM A，C，U，GTP(核苷三磷酸混合物)[α-32P]-GTP或[α-33P]-GTP在最高達(dá)100μM最終濃度的各種濃度下測(cè)試所述化合物。
制備包括酶和模板t500的適當(dāng)量的反應(yīng)緩沖液。將本發(fā)明的核苷衍生物吸移到96孔板的孔中。制備包括放射性標(biāo)記GTP的核苷三磷酸(NTP’s)混合物，并將其吸移到96孔板的孔中。加入酶-模板反應(yīng)溶液引發(fā)反應(yīng)，并使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1-2小時(shí)。
加入20μL 0.5M EDTA，pH8.0猝滅反應(yīng)。包括空白試驗(yàn)，空白試驗(yàn)中將猝滅溶液在加入反應(yīng)緩沖液之前加入到NTPs中。
將50μL猝滅后的反應(yīng)物點(diǎn)滴到DE8l濾片(Whatman)上，并使其干燥30分鐘。用0.3M甲酸銨，pH8(每次洗滌用150mL，直到1mL洗液中的cpm小于100，通常洗6次)洗滌濾片。在閃爍計(jì)數(shù)器中，在5mL閃爍液中對(duì)濾片計(jì)數(shù)。
通過(guò)下述公式計(jì)算抑制百分比抑制％＝[1-(測(cè)試反應(yīng)中的cpm-空白反應(yīng)中的cpm)/(對(duì)照反應(yīng)中的cpm-空白反應(yīng)中的cpm)]×100。
在HCV NS5B聚合酶試驗(yàn)中測(cè)試的具有代表性的化合物顯示出小于100微摩爾的IC50值。
B.測(cè)試對(duì)HCV RNA復(fù)制的抑制還評(píng)價(jià)本發(fā)明化合物在含有亞基因組HCV復(fù)制子的培養(yǎng)肝癌(HuH-7)細(xì)胞中對(duì)丙型肝炎病毒RNA復(fù)制的影響。試驗(yàn)的細(xì)節(jié)如下所述。本復(fù)制子試驗(yàn)是在V.Lohmann，F(xiàn).Komer，J-O.Koch，U.Herian，L.Theilmann和R.Bartenschlager，″Replication of a Sub-genomicHepatitis C Virus RNAs in a Hepatoma Cell Line，″Science 28 5110(1999)中所述內(nèi)容的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)修改而進(jìn)行的。
實(shí)施方案本試驗(yàn)是原位核糖核酸酶保護(hù)、基于閃爍親近的平板測(cè)定(SPA)。將10,000-40,000個(gè)細(xì)胞加入到96孔cytostar板(Amersham)中的100-200μL含有0.8mg/mL G418的培養(yǎng)基中。在0-18小時(shí)，以在1％DMSO中的最高達(dá)100μM的各種濃度將化合物加入到細(xì)胞中，然后培養(yǎng)24-96小時(shí)。將細(xì)胞固定(20分鐘，10％福爾馬林)，透化(20分鐘，0.25％Triton X-100/PBS)并與單33P RNA探針雜交(一夜，50℃)，所述單鏈33P RNA探針與RNA病毒基因組中所含的(+)鏈NS5B(或其它基因)互補(bǔ)。將細(xì)胞洗滌，用RNAse處理，洗滌，加熱至65℃，并在Top-Count中計(jì)數(shù)。讀取每分鐘計(jì)數(shù)(cpm)的減少作為對(duì)復(fù)制的抑制。
被選擇來(lái)含有亞基因組復(fù)制子的人HuH-7肝癌細(xì)胞帶有細(xì)胞質(zhì)RNA，該細(xì)胞質(zhì)RNA由HCV 5’非翻譯區(qū)(NTR)、新霉素選擇性標(biāo)記、EMCV IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))和HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3-NS5B以及跟隨其后的3’NTR構(gòu)成。
在本復(fù)制試驗(yàn)中測(cè)試的具有代表性的化合物顯示出小于100微摩爾的EC50值。
還在下述的counterscreen中評(píng)價(jià)了本發(fā)明核苷衍生物的細(xì)胞毒性和抗病毒特異性。
C.COUNTERSCREENS在下面的試驗(yàn)中測(cè)試了本發(fā)明核苷衍生物對(duì)人DNA聚合酶的抑制能力。
a.對(duì)人DNA聚合酶α和β的抑制反應(yīng)條件50μL反應(yīng)容積反應(yīng)緩沖組分20mM Tris-HCl，pH7.5200μg/mL牛血清清蛋白100mM KCl2mM β-巰基乙醇10mM MgCl21.6μM dA，dG，dC，dTTPα-33P-dATP酶和模板0.05mg/mL缺口魚(yú)精子DNA模板
0.01U/μL DNA聚合酶α或β缺口魚(yú)精子DNA模板的制備將5μL 1M MgCl2加入到500μL活化魚(yú)精子DNA(USB 70076)中；加熱至37℃，并加入30μL 65U/μL的外切核酸酶III(GibcoBRL18013-011)；在37℃培育5分鐘；通過(guò)加熱至65℃10分鐘終止反應(yīng)；將50-100μL等分試樣裝到Bio-spin 6色譜柱(Bio-Rad 7326002)中，該色譜柱已用20mM Tris-HCl，pH7.5進(jìn)行了平衡；通過(guò)以1,000Xg離心4分鐘進(jìn)行洗脫；收集洗出液，并在260nm測(cè)定吸光度，以確定濃度。
將DNA模板稀釋至20mM Tris-HCl，pH7.5的適當(dāng)體積，將酶稀釋至20mM Tris-HCl的適當(dāng)體積，含有2mM β-巰基乙醇和100mMKCI。將模板和酶吸移至微量離心管或96孔板中。還分別用酶稀釋緩沖液和測(cè)試化合物溶劑制備了排除酶的空白反應(yīng)物和排除測(cè)試化合物的對(duì)照反應(yīng)物。用具有上述組分的反應(yīng)緩沖液引發(fā)反應(yīng)。將反應(yīng)物在37℃培育1小時(shí)。加入20μL 0.5M EDTA猝滅反應(yīng)。將50μL猝滅后的反應(yīng)物點(diǎn)滴到Whatman DE81濾片上并風(fēng)干。用150mL 0.3MpH8的甲酸銨反復(fù)洗滌濾片，直到1mL洗液＜100cpm。將濾片用150mL無(wú)水乙醇洗滌兩次，用150mL無(wú)水乙醚洗滌一次，干燥并在5mL閃爍液中計(jì)數(shù)。
通過(guò)下述公式計(jì)算抑制的百分比抑制％＝[1-(測(cè)試反應(yīng)中的cpm-空白反應(yīng)中的cpm)/(對(duì)照反應(yīng)中的cpm-空白反應(yīng)中的cpm)]×100。
b.對(duì)人DNA聚合酶γ的抑制在包含下述成分的反應(yīng)中測(cè)試了對(duì)人DNA聚合酶γ的抑制能力0.5ng/μL酶；10μm dATP，dGTP，dCTP和TTP；2μCi/反應(yīng)[a-33P]-dATP和0.4μg/μL活化魚(yú)精子DNA(購(gòu)自US Biochemical)，在含有20mM Tris pH8，2mM β-巰基乙醇、50mM KCl、10mM MgCl2和0.1μg/μL BSA的緩沖液中。使反應(yīng)在37℃進(jìn)行1小時(shí)，然后通過(guò)加入0.5M EDTA至142mM的最終濃度猝滅反應(yīng)。通過(guò)陰離子交換過(guò)濾結(jié)合和閃爍計(jì)數(shù)對(duì)所形成的產(chǎn)物定量。在最高達(dá)50μM的濃度測(cè)試化合物。
通過(guò)下述公式計(jì)算抑制的百分比抑制％＝[1-(測(cè)試反應(yīng)中的cpm-空白反應(yīng)中的cpm)/(對(duì)照反應(yīng)中的cpm-空白反應(yīng)中的cpm)]×100。
在下述測(cè)試中，測(cè)定了本發(fā)明核苷衍生物抑制HIV感染和HIV擴(kuò)散的能力。
c.HIV感染性測(cè)試用表達(dá)CXCR4和CCR5的HeLa Magi細(xì)胞的變體進(jìn)行本測(cè)試，根據(jù)低背景β-半乳糖苷酶(β-gal)表達(dá)進(jìn)行選擇。使細(xì)胞感染48小時(shí)，用化學(xué)發(fā)光底物(Galactolight Plus，Tropix，Bedford，MA)對(duì)得自綜合(integrated)HIV-1 LTR啟動(dòng)子的β-gal產(chǎn)物進(jìn)行定量。在開(kāi)始于100μm的兩倍連續(xù)稀釋液中滴定(在重復(fù)試驗(yàn)中)抑制物；計(jì)算相對(duì)于對(duì)照感染的各濃度下的抑制百分比。
d.對(duì)HIV擴(kuò)散的抑制通過(guò)美國(guó)專利5,413,999號(hào)(1995年5月9日)和J.P.Vacca等的Proc.Natl.Acad.Sci.，914096-4100(1994)中所述的方法測(cè)試本發(fā)明化合物抑制人類(lèi)免疫缺陷性病毒(HIV)擴(kuò)散的能力，將所述文獻(xiàn)的內(nèi)容全部引用結(jié)合進(jìn)本文。
在下列測(cè)試中所述的基于MTS細(xì)胞的測(cè)試中，篩選了本發(fā)明核苷衍生物對(duì)含有亞基因組HCV復(fù)制子的培養(yǎng)肝癌(HuH-7)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在H.Nakabayashi等的Cancer Res.，423858(1982)中描述了HuH-7細(xì)胞系。
e.細(xì)胞毒性測(cè)試在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)物，濃度為大約1.5×105個(gè)細(xì)胞/mL的用于3天培育中的懸浮培養(yǎng)，濃度為5.0×104個(gè)細(xì)胞/mL的用于3天培育中的貼壁培養(yǎng)。將99μL細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至96孔組織培養(yǎng)處理板的孔中，加入1μL在DMSO中的100倍最終濃度的測(cè)試化合物。將平板在37℃和5％CO2條件下培育一段特定時(shí)間。培育期之后，向各孔中加入20μL CellTiter 96 Aqueous One Solution CellProliferation測(cè)試試劑(MTS)(Promega)，再將平板在37℃和5％CO2條件下培育最長(zhǎng)為3小時(shí)的一段時(shí)間。振蕩平板以使各孔混合，用平板讀數(shù)器讀取490nm下的吸光度。用臨添加MTS試劑前的已知細(xì)胞數(shù)制作懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)曲線。代謝活性細(xì)胞將MTS分解為甲，甲在490nm吸收。將化合物存在下490nm的吸光度與未添加任何化合物的細(xì)胞的吸光度相比。參考Cory，A.H等，“Use of anaqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays inculture，”Cancer Commun.3207(1991)。
將下面的測(cè)試用于測(cè)定本發(fā)明化合物對(duì)其它依賴于RNA的RNA病毒的活性。
a.測(cè)定化合物對(duì)鼻病毒的體外抗病毒活性(致細(xì)胞病變效應(yīng)抑制測(cè)試)測(cè)試條件描述在Sidwell and Huffman，″Use of disposablemicrotissue culture plates for antiviral and interferon induction studies，″Appl.Microbiol.22797-801(1971)的文章中。
病毒如Sidwell and Huffman參考中所述，使用2型鼻病毒(RV-2)HGP毒株與KB細(xì)胞和培養(yǎng)基(0.1％NaHCO3，無(wú)抗生素)。由ATCC獲得的病毒取自具有輕微的急性發(fā)熱上呼吸道疾病的成年男性的咽喉棉棒。
9型鼻病毒(RV-9)211毒株和14型鼻病毒(RV-14)Tow毒株也由Rockville，MD中的American Type Culture Collection(ATCC)獲得。RV-9取自人咽喉洗液，RV-14取自具有上呼吸道疾病的年輕成人的咽喉棉棒。這兩種病毒都采用人子宮頸上皮樣癌細(xì)胞HeLa Ohio-1細(xì)胞(Dr.Fred Hayden，Univ.of VA)。用具有5％胎牛血清(FBS)和0.1％NaHCO3的MEM(Eagle’s極限必需培養(yǎng)基)作為生長(zhǎng)培養(yǎng)基。全部三種病毒類(lèi)型的抗病毒測(cè)試培養(yǎng)基都是具有5％FBS、0.1％NaHCO3、50μg慶大霉素/mL和10mM MgCl2的MEM。
2000μg/mL是用于測(cè)試本發(fā)明化合物的最高濃度。在加入受試化合物之后大約5分鐘，將病毒加入到測(cè)試板中。同時(shí)制作適當(dāng)?shù)膶?duì)照試樣。將測(cè)試板在潮濕空氣、5％CO2、37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)顯微鏡觀察對(duì)照細(xì)胞的形態(tài)變化來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞毒性。病毒CPE數(shù)據(jù)和毒性對(duì)照數(shù)據(jù)的回歸分析給出了ED50(50％有效劑量)和CC50(50％細(xì)胞毒性濃度)。通過(guò)式子SI＝CC50÷ED50計(jì)算選擇性指數(shù)(SI)。
b.測(cè)定化合物對(duì)登革熱 班齊和黃熱病的體外抗病毒活性(CPE抑制測(cè)試)測(cè)試詳細(xì)內(nèi)容給出在上述Sidwell and Huffman參考文獻(xiàn)中。
病毒從疾病控制中心獲取登革熱2型病毒New Guinea毒株。用兩行非洲綠猴腎細(xì)胞培養(yǎng)病毒(非洲綠猴腎細(xì)胞株系(Vero))并進(jìn)行抗病毒測(cè)試(MA-104)。從ATCC獲得自被感染的鼠腦制取的黃熱病病毒17D毒株和分離自南非發(fā)熱男孩的血清的班齊病毒H336毒株。這兩種病毒的測(cè)試都使用Vero細(xì)胞。
細(xì)胞和培養(yǎng)基在具有5％FBS和0.1％NaHCO3、沒(méi)有抗生素的199培養(yǎng)基中使用MA-104細(xì)胞(Bio Whittaker，Inc.，Walkersville，MD)和Vero細(xì)胞(ATCC)。用于登革熱、黃熱病和班齊病毒的測(cè)試培養(yǎng)基是MEM、2％FBS、0.18％NaHCO3和50μg慶大霉素/mL。
本發(fā)明化合物的抗病毒測(cè)試按照Sidwell and Huffman參考文獻(xiàn)中所述進(jìn)行，類(lèi)似于上述鼻病毒抗病毒測(cè)試。對(duì)于各種病毒，在5-6天后獲得適當(dāng)?shù)闹录?xì)胞病變效應(yīng)(CPE)記錄。
c.測(cè)定化合物對(duì)西尼羅病毒的體外抗病毒活性(CPE抑制測(cè)試)測(cè)試詳細(xì)內(nèi)容給出在上述引用的Sidwell and Huffman參考文獻(xiàn)中。從疾病控制中心獲得取自鴉腦的西尼羅病毒New York分離物。使Vero細(xì)胞生長(zhǎng)并如上使用。測(cè)試培養(yǎng)基為MEM、1％FBS、0.1％NaHCO3和50μg慶大霉素/mL。
本發(fā)明化合物的抗病毒測(cè)試按照Sidwell and Huffman參考文獻(xiàn)中所述方法進(jìn)行，類(lèi)似于用于鼻病毒活性測(cè)試的那些方法。在5-6天后獲得適當(dāng)?shù)闹录?xì)胞病變效應(yīng)(CPE)記錄。
d.測(cè)定化合物對(duì)鼻病毒、黃熱病、登革熱、班齊和西尼羅病毒的體外抗病毒活性(中心紅攝取測(cè)試)如上進(jìn)行CPE抑制測(cè)試后，再使用“Microtiter Assay for InterferonMicrospectrophotometric Quantitation of Cytopathic Effect，”Appl.Environ.Microbiol.3135-38(1976)中所述的細(xì)胞病變檢測(cè)方法。用EL309型小平板讀出器(Bio-Tek Instruments Inc.)對(duì)測(cè)試平板讀數(shù)。如上計(jì)算出ED50值和CD50值。
藥物制劑的實(shí)施例作為本發(fā)明化合物的口服組合物的具體實(shí)施方案，用50mg實(shí)施例1或?qū)嵤├?的化合物與充分粉碎后的乳糖一起配制制劑，以提供580-590mg的總量，將其裝進(jìn)0號(hào)硬質(zhì)明膠膠囊中。
如上對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述并參照其具體實(shí)施方案進(jìn)行了舉例說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員都將意識(shí)到在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對(duì)其進(jìn)行各種變化、改進(jìn)和替換。例如，根據(jù)需要治療HCV嚴(yán)重傳染的人的反應(yīng)的各種變化的推斷，前文中列出的優(yōu)選劑量以外的有效劑量也是適用的。同樣，所觀察到的藥理學(xué)反應(yīng)也可根據(jù)并依賴所選擇的具體活性化合物或者是否存在制藥載體以及制劑類(lèi)型和所用給藥方式而變化，根據(jù)本發(fā)明的目的和實(shí)踐注意到這些預(yù)期的變化或結(jié)果差異。因此，本發(fā)明僅由所附權(quán)利要求的范圍限定，這些權(quán)利要求適當(dāng)?shù)乇３州^寬的范圍。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)構(gòu)式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽， 其中R1為C2-4鏈烯基、C2-4炔基或C1-4烷基，其中烷基為未取代的或者被羥基、氨基、C1-4烷氧基、C1-4烷硫基或1-3個(gè)氟原子取代；R2為氫、氟、羥基、巰基、C1-4烷氧基或C1-4烷基；或者R1和R2同與其相連的碳原子一起形成任選含有一個(gè)選自O(shè)、S和NC0-4烷基的雜原子的3-6元飽和單環(huán)系；R3和R4各自獨(dú)立選自氫、氰基、疊氮基、鹵素、羥基、巰基、氨基、C1-4烷氧基、C2-4鏈烯基、C2-4炔基和C1-4烷基，其中烷基為未取代的或者被羥基、氨基、C1-4烷氧基、C1-4烷硫基或1-3個(gè)氟原子取代；R5為氫、C1-10烷基羰基、P3O9H4、P2O6H3或P(O)R13R14；R6和R7各自獨(dú)立為氫、甲基、羥基甲基或氟甲基；R8為氫、C1-4烷基、C2-4炔基、鹵素、氰基、羧基、C1-4烷氧基羰基、疊氮基、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、羥基、C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6烷基磺?；?、(C1-4烷基)0-2氨基甲基或C4-6環(huán)雜烷基，它們是未取代的或者被1-2個(gè)獨(dú)立選自鹵素、羥基、氨基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的基團(tuán)取代；R9為氫、氰基、硝基、C1-3烷基、NHCONH2、CONR12R12、CSNR12R12、COOR12、C(＝NH)NH2、羥基、C1-3烷氧基、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、鹵素、(1，3-噁唑-2-基)、(1，3-噻唑-2-基)或(咪唑-2-基)；其中烷基為未取代的或者被1-3個(gè)獨(dú)立選自鹵素、氨基、羥基、羧基和C1-3烷氧基的基團(tuán)取代；R10和R11各自獨(dú)立為氫、羥基、鹵素、C1-4烷氧基、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基、C3-6環(huán)烷基氨基、二(C3-6環(huán)烷基)氨基或C4-6環(huán)雜烷基，它們是未取代的或者被1-2個(gè)獨(dú)立選自鹵素、羥基、氨基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的基團(tuán)取代；各R12獨(dú)立為氫或C1-6烷基；并且R13和R14各自獨(dú)立為羥基、OCH2CH2SC(＝O)C1-4烷基、OCH2O(C＝O)OC1-4烷基、NHCHMeCO2Me、OCH(C1-4烷基)O(C＝O)C1-4烷基、 或 條件是當(dāng)R1為β-甲基且R4為氫或者R4為β-甲基且R1為氫，R2和R3為α-羥基，R10為氨基，R5、R6、R7、R8和R11為氫時(shí)，R9不為氰基或CONH2。
2.權(quán)利要求1的具有結(jié)構(gòu)式II的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽， 其中R1為C1-3烷基，其中烷基被羥基、氨基、C1-3烷氧基、C1-3烷硫基或1-3個(gè)氟原子任選取代；R2為羥基、氟或C1-4烷氧基；R3為氫、鹵素、羥基、氨基或C1-4烷氧基；R5為氫、P3O9H4、P2O6H3或PO3H2；R8為氫、氨基或C1-4烷基氨基；R9為氫、氰基、甲基、鹵素或CONH2；并且R10和R11各自獨(dú)立為氫、鹵素、羥基、氨基、C1-4烷基氨基、二(C1-4烷基)氨基或C3-6環(huán)烷基氨基；條件是當(dāng)R1為β-甲基，R2和R3為α-羥基，R10為氨基，R5、R8和R11為氫時(shí)，R9不為氰基或CONH2。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中R1為甲基、氟甲基、羥基甲基、二氟甲基、三氟甲基或氨基甲基；R2為羥基、氟或甲氧基；R3為氫、氟、羥基、氨基或甲氧基；R5為氫或P3O9H4；R8為氫或氨基；R9為氫、氰基、甲基、鹵素或CONH2；并且R10和R11各自獨(dú)立為氫、氟、羥基或氨基；條件是當(dāng)R1為β-甲基，R2和R3為α-羥基，R10為氨基，R5、R8和R11為氫時(shí)，R9不為氰基或CONH2。
4.權(quán)利要求1的選自下列的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽1.4-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-阿糖呋喃基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，2.4-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，3.4-甲基氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，4.4-二甲基氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，5.4-環(huán)丙基氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，6.4-氨基-7-(2-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，7.4-氨基-7-(2-C-羥基甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，8.4-氨基-7-(2-C-氟甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，9.4-氨基-5-甲基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，10.4-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-羧酸，11.4-氨基-5-溴-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，12.4-氨基-5-氯-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，13.4-氨基-5-氟-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，14.2，4-二氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，15.2-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，16.2-氨基-4-環(huán)丙基氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，17.2-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮，18.4-氨基-7-(2-C-乙基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，19.4-氨基-7-(2-C，2-O-二甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，20.7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮，21.2-氨基-5-甲基-7-(2-C，2-O-二甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4(3H)-酮，22.4-氨基-7-(3-脫氧-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，23.4-氨基-7-(3-脫氧-2-C-甲基-β-D-阿糖呋喃基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，24.4-氨基-2-氟-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，25.4-氨基-7-(3-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，26.4-氨基-7-(3-C-甲基-β-D-呋喃木糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，27.4-氨基-7-(2，4-二-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，和28.4-氨基-7-(3-脫氧-3-氟-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶；以及對(duì)應(yīng)的5’-三磷酸酯。
5.權(quán)利要求4的選自下列的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽1.4-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-阿糖呋喃基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，2.4-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，3.4-氨基-7-(2-C-氟甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，4.4-氨基-5-甲基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，5.4-氨基-5-溴-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，6.4-氨基-5-氯-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，7.4-氨基-5-氟-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，和8.4-氨基-7-(2-C，2-O-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶，以及對(duì)應(yīng)的5’-三磷酸酯。
6.權(quán)利要求5的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，該化合物為4-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-阿糖呋喃基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶。
7.權(quán)利要求5的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，該化合物為4-氨基-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶。
8.權(quán)利要求5的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，該化合物為4-氨基-7-(2-C-氟甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶。
9.權(quán)利要求5的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，該化合物為4-氨基-5-氯-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶。
10.權(quán)利要求5的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，該化合物為4-氨基-5-溴-7-(2-C-甲基-β-D-呋喃核糖基)-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶。
11.一種藥物組合物，該組合物含有權(quán)利要求1的化合物及其藥學(xué)上可接受的載體。
12.權(quán)利要求11的藥物組合物，該組合物可用于抑制依賴于RNA的RNA病毒聚合酶，抑制依賴于RNA的RNA復(fù)制和/或治療依賴于RNA的RNA病毒感染。
13.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述依賴于RNA的RNA病毒聚合酶為HCV NS5B聚合酶，所述依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制為HCV復(fù)制，所述依賴于RNA的RNA病毒感染為HCV感染。
14.一種抑制依賴于RNA的RNA病毒聚合酶和/或抑制依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制的方法，該方法包括給予需要所述抑制的哺乳動(dòng)物有效量的權(quán)利要求1的化合物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述依賴于RNA的RNA病毒聚合酶為HCV NS5B聚合酶，所述依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制為HCV病毒復(fù)制。
16.一種治療依賴于RNA的RNA病毒感染的方法，該方法包括給予需要所述治療的哺乳動(dòng)物有效量的權(quán)利要求1的化合物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述依賴于RNA的RNA病毒感染為HCV感染。
18.權(quán)利要求17的方法，該方法與治療有效量的另一種有效對(duì)抗HCV的試劑相結(jié)合。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述有效對(duì)抗HCV的試劑為利巴韋林、levovirin、胸腺素α-1、NS3絲氨酸蛋白酶抑制劑、肌苷一磷酸脫氫酶抑制劑、單獨(dú)或者與利巴韋林或levovirin相結(jié)合的干擾素α或pegylated干擾素α。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述有效對(duì)抗HCV的試劑為單獨(dú)或者與利巴韋林相結(jié)合的干擾素α或pegylated干擾素α。
21.權(quán)利要求1的化合物用于抑制哺乳動(dòng)物的依賴于RNA的RNA病毒聚合酶或抑制哺乳動(dòng)物的依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制的用途。
22.權(quán)利要求1的化合物用于治療哺乳動(dòng)物的依賴于RNA的RNA病毒感染的用途。
23.權(quán)利要求22的用途，其中所述依賴于RNA的RNA病毒感染為丙型肝炎感染。
24.權(quán)利要求1的化合物在制造用于抑制哺乳動(dòng)物的依賴于RNA的RNA病毒聚合酶或抑制哺乳動(dòng)物的依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制的藥物中的用途。
25.權(quán)利要求1的化合物在制造用于治療哺乳動(dòng)物的依賴于RNA的RNA病毒感染的藥物中的用途。
26.權(quán)利要求25的用途，其中所述依賴于RNA的RNA病毒感染為丙型肝炎感染。
全文摘要
本發(fā)明提供為依賴于RNA的RNA病毒聚合物抑制劑的核苷化合物及其某些衍生物。這些化合物是依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制的抑制劑，可用于治療依賴于RNA的RNA病毒感染。它們作為丙型肝炎病毒(HCV)NS5B聚合酶的抑制劑、作為HCV復(fù)制的抑制劑和/或用于治療丙型肝炎感染特別有用。本發(fā)明還描述了藥物組合物，該藥物組合物含有單獨(dú)的或者與其它有效對(duì)抗依賴于RNA的RNA病毒感染的試劑相結(jié)合的這些核苷化合物。還公開(kāi)了用本發(fā)明的核苷化合物抑制依賴于RNA的RNA聚合酶，抑制依賴于RNA的RNA病毒復(fù)制和/或治療依賴于RNA的RNA病毒感染的方法。
文檔編號(hào)C07H19/167GK1498221SQ02806977
公開(kāi)日2004年5月19日 申請(qǐng)日期2002年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月22日
發(fā)明者S·S·卡洛爾, M·麥科斯, D·B·奧爾森, B·巴特, N·巴特, P·D·庫(kù)克, A·B·埃爾德魯普, T·P·普拉卡斯, M·普爾哈夫克, 宋全來(lái), S S 卡洛爾, 埃爾德魯普, 奧爾森, 庫(kù)克, 撲, 普拉卡斯, 蚩 申請(qǐng)人:麥克公司, 埃西斯藥品公司