專利名稱：表達對氧磷酶1基因的家蠶重組桿狀病毒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達對氧磷酶I基因的家蠶重組桿狀病毒及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
對氧磷酶I (paraoxonasel, PONI)廣泛存在于多種微生物、昆蟲、蛇毒、魷魚軸索、魷魚后唾液腺、鳥類及哺乳動物中，是生物體內(nèi)存在的一種廣譜的非專一性酯酶。它能通過催化磷酸酯鍵的水解，來降解有機磷酸、芳香羥基酸酯和氨基甲酸酯，從而對水解有機磷殺蟲劑及降解神經(jīng)毒劑發(fā)揮重要作用。因此對氧磷酶I有望成為有機磷中毒預(yù)防和治療的新途徑。據(jù)報道，PONl不但在有機磷毒劑解毒中起重要作用，而且與哺乳動物的動脈粥樣硬 化、冠心病及II型糖尿病的發(fā)病等有密切關(guān)系，同時PONs還可以淬滅群體感應(yīng)信號分子，干擾細菌群體感應(yīng)信號系統(tǒng)(Quorum sensing, QS),這一發(fā)現(xiàn)揭示了哺乳動物抗細菌感染的新機制。當(dāng)前恐怖主義泛濫、有機磷農(nóng)藥中毒和自殺的事件時有發(fā)生，針對神經(jīng)中毒傳統(tǒng)的治療方法是采用阿托品和氯解磷定，通過間接抑制M受體和復(fù)活磷?；哪憠A酯酶達到解毒目的，但治療中存在阿托品中毒及中毒反跳等不足。由于PONl可以直接水解多種有機磷類化合物，且其水解產(chǎn)物可以直接從體內(nèi)代謝出去，因此對氧磷酶I的發(fā)現(xiàn)極有可能為有機磷中毒的預(yù)防和治療提供一條新的途徑。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PONl還具有抑制低密度脂蛋白氧化的作用，與動脈粥樣硬化，慢性肝損傷、冠心病及II型糖尿病的等多種疾病的發(fā)病有密切關(guān)系。利用大腸桿菌表達的PONl有其自身的優(yōu)點，如廉價，生產(chǎn)周期短等，但表達的蛋白缺少糖基化及磷酸化修飾，在體內(nèi)應(yīng)用時存在免疫排斥，半衰期短，易降解等不足(大腸桿菌原核表達系統(tǒng)沒有翻譯后加工系統(tǒng)，不能進行糖基化、磷酸化等修飾，從而使部分對糖基化要求成都較高的基因不能在該系統(tǒng)中進行功能性表達)。孫曼霽等(滕霞，楊申，李前，孫曼霽，等.人血清Q型對氧磷酶在大腸桿菌中的表達[J].生物技術(shù)通訊，2007(18)15-18)曾應(yīng)用大腸桿菌系統(tǒng)表達人Q血清對氧磷酶，結(jié)果顯示所表達對蛋白均以包涵體形式存在，包涵體經(jīng)過分離、變性、復(fù)性等步驟處理后，產(chǎn)物未顯示有酶活性。姬愛國等(姬愛國，淮亞紅，張路培，等.牛對氧磷酶I基因和對氧磷酶2及in原核表達載體的構(gòu)建極其表達分析[J].生物技術(shù)通訊，2008，35 (9) 59-63)克隆出牛血清對氧磷酶基因，并利用基因工程方法初步表達出具有活性的對氧磷酶PONl，但未得到純化的重組蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種表達對氧磷酶I基因的家蠶重組桿狀病毒，通過桿狀病毒表達系統(tǒng)將PONl基因構(gòu)建到家蠶生物反應(yīng)器中進行高效表達，比原核表達增加了糖基化的功能，更接近哺乳動物表達的天然修飾功能，而且家蠶作為一種廉價低成本生物反應(yīng)器可以大大降低外源基因表達的成本。為達到上述目的，本發(fā)明提供一種表達對氧磷酶I基因的家蠶重組桿狀病毒，該病毒含有對氧磷酶I基因。優(yōu)選地，其中所述對氧磷酶I基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。本發(fā)明還提供一種上述家蠶重組桿狀病毒的制備方法，包括以下步驟
(1)對氧磷酶I基因的合成；
(2)將步驟(I)所合成的對氧磷酶I(PONl)基因連接到轉(zhuǎn)移載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl感受態(tài)細胞，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體；
(3)將步驟(2)構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細胞，得到重組桿狀病毒DNA ；
(4)將步驟(3)得到的重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染家蠶細胞，得到家蠶重組桿狀病毒。優(yōu)選地，其中步驟(I)所述對氧磷酶I基因的合成具體包括
(1)設(shè)計上游引物F: 5’-TATG^77TATGGCTAAACTGACAGCG-3’，其中斜體為 &oR I 位占.
下游引物 R : 5 ’ -GCGC7TG^TTACAGCTCACAGTAAAG-3，，其中斜體為 Xho I 位點； (2)以pBlueScript-PONl質(zhì)粒為模板，用所設(shè)計引物F和R擴增特異性片段，具體程序為95°C預(yù)變性5min，95°C變性45s，55°C退火30s，72°C延伸45s，循環(huán)30次；最后72°C延伸45s，回收產(chǎn)物，得到對氧磷酶I (PONl)基因，經(jīng)測序比對后發(fā)現(xiàn)得到的基因序列與設(shè)計一致。優(yōu)選地，其中所述步驟(2)具體包括
將PCR擴增得到的對氧磷酶I(PONl)基因用I和通ο I雙酶切后回收，連接到經(jīng)同樣處理的轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMHTA上，使PONl基因位于多角體基因啟動子控制之下，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TGl感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，得到重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac HTA-PONl。優(yōu)選地，其中所述步驟(3)具體包括
將步驟(2)得到的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMHTA-ΡΟΝΙ轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細胞，通過藍白斑篩選得到重組桿狀病毒DNA(Bacmid-PONl)，并利用M13上下游引物進行PCR組合鑒定。優(yōu)選地，其中步驟(4)所述重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染家蠶細胞的方法為將重組桿狀病毒DNA通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入家蠶細胞中。本發(fā)明還提供一種上述家蠶重組桿狀病毒表達的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO 2所示。本發(fā)明還提供上述蛋白的制備方法，包括以下步驟
(1)將上述的家蠶重組桿狀病毒感染家蠶BmN細胞進行病毒擴增；
(2)針刺法接種家蠶五齡幼蟲及蠶蛹；
(3)待發(fā)病后收集表達的上述蛋白。本發(fā)明進一步提供一種藥物，其活性成分為上述方法制備的蛋白。本發(fā)明采用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)來實現(xiàn)對氧磷酶I的表達，其優(yōu)勢主要在于
I)表達量聞利用桿狀病毒polh基因和plO基因的強啟動子驅(qū)動外源基因的聞效表達；2)具有轉(zhuǎn)錄、翻譯后加工能力家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)具有很強的轉(zhuǎn)錄、翻譯后加工能力，表達產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)、生物活性、免疫原性和糖基化修飾等方面與天然蛋白具有很強的相似性；3)得益于人工孵化及人工飼料技術(shù)的發(fā)展，家蠶可以全年進行大規(guī)模無菌人工飼養(yǎng)，大量生產(chǎn)有用物質(zhì)；4)安全性好昆蟲桿狀病毒只在無脊椎動物細胞中復(fù)制，對脊椎動物和植物細胞而言并非病原體，因此昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)對使用者安全無害(家蠶桿狀病毒的表達宿主有家蠶細胞、家蠶幼蟲和蠶蛹，但家蠶幼蟲和蠶蛹使用范圍較廣，因其便于注射操作)；4)利用家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)表達對氧磷酶1，有利于解決天然PONl來源不足的問題，并在此基礎(chǔ)上研究家蠶作為真核表達系統(tǒng)產(chǎn)生的對氧磷酶活性，可以為進一步利用家蠶生物反應(yīng)器低成本生產(chǎn)有機磷神經(jīng)解毒劑奠定基礎(chǔ)。


圖I為PONl基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳分析圖；M:DNA ladder marker; I:陰性對照；2 =PCR產(chǎn)物；
圖2為重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac HTA-PONl的雙酶切-PCR鑒定圖M DNA laddermarker ；1 :雙酶切產(chǎn)物；2 :PCR產(chǎn)物；
圖 3 為重組 Bacmid-PONl 的 PCR 鑒定圖；M DNA ladder marker ；1 M13F/M13R 的 PCR產(chǎn)物；2 M13F/P0N1下游引物的PCR產(chǎn)物；3 =PONl上游引物/M13R的PCR產(chǎn)物；4 =PONl上游引物/PONl下游產(chǎn)物的PCR產(chǎn)物；
圖 4 為重組桿狀病毒BmNPV-PONl 的 PCR鑒定圖；M :DNA ladder marker ；1 M13F/M13R的PCR產(chǎn)物；2 M13F/P0N1下游引物的PCR產(chǎn)物；3 =PONl上游引物/M13R的PCR產(chǎn)物；4 PONl上游引物/PONl下游產(chǎn)物的PCR產(chǎn)物；
圖5為重組桿狀病毒BmNPV-PONl在家蠶細胞中表達產(chǎn)物的SDS-PAGE及Westernblotting鑒定圖；M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :正常細胞總蛋白；2 :發(fā)病細胞上清；3 :發(fā)病細胞沉淀；
圖6為重組桿狀病毒BmNPV-PONl在家蠶五齡幼蟲中表達產(chǎn)物的SDS-PAGE及Westernblotting鑒定圖；M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :接種野生病毒發(fā)病的家蠶血淋巴；2 :接種BmNPV-PONl發(fā)病的家蠶血淋巴上清；3 :接種BmNPV-PONl發(fā)病的家蠶血淋巴沉淀；
圖7為重組桿狀病毒BmNPV-PONl在蠶蛹中表達產(chǎn)物的SDS-PAGE及Western blotting鑒定圖；M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 :正常蠶蛹；2 :發(fā)病蠶蛹上清；3 :發(fā)病蠶蛹沉淀；
圖8為家蠶細胞中表達的PONl活性檢測 圖9為家蠶幼蟲血淋巴中表達的PONl活性檢測 圖10為大腸桿菌中表達的PONl活性檢測 圖11為兔血清中存在的PONl活性檢測圖。
具體實施例方式應(yīng)該指出，以下具體說明都是事例性的，旨在對本發(fā)明提供進一步說明，除非另有說明，本文中使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明。
實施例I :P0N1基因的合成
根據(jù)GenBank登錄號AY499193. I公布的PONl基因序列設(shè)計一對引物用于擴增PONl基因(斜體為酶切位點)，其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。上游引物F :5’ -TATG^77TATGGCTAAACTGACAGCG-3’，其中斜體為 &oR I 位點； 下游引物 R : 5 ’ -GCGC7TG^TTACAGCTCACAGTAAAG-3，，其中斜體為 Xho I 位點；
以pBlueScript-PONl質(zhì)粒(滕霞，楊申等.人血清Q型對氧磷酶在大腸桿菌中的表達· [J]生物技術(shù)通訊2007，18 (I) =015-018)為模板，利用上述引物進行PCR擴增，進行瓊脂糖凝膠電泳(如圖I所示)，PONl的基因片段大小約1065bp，瓊脂糖凝膠電泳顯示2號甬道目的基因的PCR產(chǎn)物大小與實際一致，回收產(chǎn)物，得到PONl基因。反應(yīng)體系及反應(yīng)程序設(shè)置如下 反應(yīng)體系
2XMixIOyL;
模板O. 4 μ L ;
上游引物O. 4yL;
下游引物O. 4yL;
ddH208. 8 μ L ;
Total20 μ L ；
反應(yīng)程序
951預(yù)變性 5ιιι ι 95'C 變性 4 、
55'C ii 大. 30s 30 cycles 72'C 延伸 45s
J
72'C 延·沖 45s 實施例2 :重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac HTA-PONl的構(gòu)建
對實施例I所得的PONl基因及pFastBac HTA載體(Invitrogen)用EcoR I和Xho I (Fermentas公司)同時進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物；將回收的PONl基因片段用Ligation high連接酶(Fermentas公司)連接到經(jīng)酶切的pFastBac HTA載體上，使目的基因(P0N1基因)位于多角體啟動子控制之下，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl感受態(tài)細胞(Fermentas公司)，篩選陽性克隆，得到重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMHTA-PONl。將該重組轉(zhuǎn)移載體進行PCR與雙酶切，產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定(如圖2所示)，I號甬道雙酶切產(chǎn)物出現(xiàn)兩條亮帶，其中一條為1065bp的PONl基因片段，另一條為質(zhì)粒酶切后片段；2號甬道中的亮帶為1065bp的PONl基因片段的PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成功，然后送去測序，經(jīng)測序知，目的基因已成功克隆到pFastBac HTA載體上。實施例3 :家蠶重組桿狀病毒BmNPV-PONl的構(gòu)建 I)重組桿狀病毒DNA(Bacmid-PONl)的獲得
將實施例2構(gòu)建好的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMHTA-PONl轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細胞(Fermentas公司)中，通過藍白斑篩選獲得陽性克隆，利用M13通用引物與目的基因上下游引物分別組合進行PCR，取少量PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(如圖3所示)，電泳結(jié)果表明獲得正確的Bacmid-PONl陽性克隆。2)重組桿狀病毒DNA (Bacmid-PONl)轉(zhuǎn)染家蠶BmN細胞
a.提前8 12h將生長狀態(tài)良好的家蠶BmN細胞用移液器取Iml鋪于小型細胞培養(yǎng)皿(規(guī)格為3. 5cm)中；
b.取10μ L重組Bacmid-PONl與8μ L脂質(zhì)體于已滅菌的EP管中，加入100 μ L的Sf-900 II SFM(IX)無血清培養(yǎng)基(購于美國GIBCO公司)，室溫孵育約20min，得到Bacmid-PONl/脂質(zhì)體復(fù)合物；
c.將步驟a中貼壁生長狀態(tài)良好的家蠶BmN細胞棄去培養(yǎng)基后加入2mLSf-900 II SFM(IX)無血清培養(yǎng)基(購于美國GIBCO公司)洗滌兩次，以清除原培養(yǎng)基中殘·留的胎牛血清；
d.加入新鮮的Sf-900II SFM(IX)無血清培養(yǎng)基lmL，然后加入Bacmid-PONl/脂質(zhì)體復(fù)合物100 μ L，輕輕晃動培養(yǎng)皿使復(fù)合物分布均勻；28°C細胞培養(yǎng)箱中孵育6h左右向該培養(yǎng)基中加入10 μ L胎牛血清(FBS)(購于奧地利PAA公司)繼續(xù)培養(yǎng)；
e.28°C培養(yǎng)3 5d后，顯微鏡下觀察細胞的發(fā)病狀況(典型發(fā)病癥狀細胞由長梭形變圓，核仁增大，細胞游離于培養(yǎng)基中；而正常細胞排列緊密且呈梭形，細胞核明顯，細胞貼壁生長明顯。細胞發(fā)病表明重組Bacmid成功轉(zhuǎn)染家蠶BmN細胞，并在細胞內(nèi)成功進行復(fù)制、裝配形成重組病毒BmNPV-PONl)。實施例4 :家蠶重組桿狀病毒BmNPV-PONl的鑒定 I) PCR鑒定
待家蠶BmN細胞發(fā)病后，收集重組病毒懸液，用UNIQ-10柱式病毒基因組抽提試劑盒(購自上海生工生物公司)提取病毒基因組。分別以M13F/M13R、M13F/P0N1下游引物、PONl上游引物/M13R、P0N1上游引物/PONl下游引物組合進行PCR，取少量PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(見圖4)，電泳結(jié)果表明獲得了正確的重組家蠶桿狀病毒BmNPV-PONl。2) SDS-PAGE 與 Western blotting 分析鑒定
將經(jīng)PCR鑒定呈陽性的家蠶重組桿狀病毒接種BmN細胞，27°C培養(yǎng)72h左右，待細胞發(fā)病(顯微鏡觀察)(典型發(fā)病癥狀細胞由長梭形變圓，核仁增大，細胞游離于培養(yǎng)基中；而正常細胞排列緊密且呈梭形，細胞核明顯，細胞貼壁生長明顯。細胞發(fā)病表明重組Bacmid成功轉(zhuǎn)染家蠶BmN細胞，并在細胞內(nèi)成功進行復(fù)制、裝配形成重組病毒BmNPV-PONl)。后收集細胞并對細胞表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE與Western blotting分析，結(jié)果顯示在43kD附近出現(xiàn)特異性條帶(如圖5所示)，說明該家蠶重組桿狀病毒在家蠶BmN細胞中成功表達。實施例5 :家蠶重組桿狀病毒BmNPV-PONl接種家蠶五齡幼蟲的SDS-PAGE與Western blotting 分析鑒定
家蠶重組桿狀病毒BmNPV-PONl擴增后針刺法接種家蠶(箐松X皓月)五齡幼蟲，待其發(fā)病后收集家蠶血淋巴于_80°C冰箱凍存。發(fā)病的家蠶幼蟲血淋巴處理方法將血淋巴經(jīng)9層醫(yī)用紗布過濾后，4°C經(jīng)2000rpm離心lOmin，收集上清，沉淀用O. 9%的生理鹽水重懸。對處理后的蠶血淋巴進行SDS-PAGE及Western blotting分析。結(jié)果顯示,上清中43kD附近出現(xiàn)特異性條帶(如圖6所示)，說明家蠶重組桿狀病毒在家蠶五齡幼蟲中成功表達。實施例6 :家蠶重組桿狀病毒BmNPV-PONl接種蠶蛹的SDS-PAGE與Westernblotting分析鑒定
將家蠶重組桿狀病毒BmNPV擴增后接種蠶蛹，待蠶蛹發(fā)病后于-80°C冰箱凍存。發(fā)病蠶蛹的處理方法稱取200g發(fā)病蠶蛹，加入200mL、0. 9%的生理鹽水進行勻漿。勻漿2min，冰浴2min，重復(fù)操作10次；然后在4°C下4000rpm離心30min后用9層紗布過濾除去油脂,重復(fù)操作3次。對處理后的蠶蛹樣品進行SDS-PAGE及Western blotting分析。結(jié)果顯示，沉淀中約43kD附近出現(xiàn)特異性條帶(如圖7所示)，說明家蠶重組桿狀病毒在蠶蛹中成功表達。實施例7 :利用對氧磷作為底物檢測家蠶細胞、幼蟲血淋巴、大腸桿菌中表達的以及家兔血清中存在的天然PONl的活性
根據(jù)對氧磷酶能水解對氧磷成為對硝基酚(黃色化合物，在405nm處有吸收峰)的原理，通過檢測對硝基酚的生成速率來反應(yīng)對氧磷酶的活性水平，目前國內(nèi)外對對氧磷酶的活性檢測主要是用對氧磷或乙酸苯酯作為底物。原理以對氧磷(paraoxon)為底物,25°C溫育生成對硝基酹,在405nm波長處檢測吸光度，以每分鐘每升樣品水解生成對硝基酚I μ mo I為一個單位(U/L)。方法采用連續(xù)監(jiān)測法測定PONl活性。具體操作在96孔板(Thermo Scientific公司)中分別按如下反應(yīng)體系依次加樣(注待測樣品應(yīng)最后加入反應(yīng)體系)，搖床混勻后立即放入提前設(shè)置好反應(yīng)程序的全波長酶標(biāo)儀(ThermoFisher Scientific Skan I +)中進行OD值的連續(xù)測量。反應(yīng)程序孵育lmin，25°C下連續(xù)測量181個動力學(xué)點，時間間隔為lmin，比色命令設(shè)置為405nm。根據(jù)所測的OD值繪制出酶反應(yīng)動力學(xué)曲線并根據(jù)公式進行酶活力的計算。根據(jù)吸光度上升的速率(Λ A/min)計算出結(jié)果。反應(yīng)體系的配方如下表1_4所示(注P0N1是鈣離子依賴性酯酶，在對氧磷酶I的活性中心有兩個Ca2+，其中一個參與構(gòu)成催化中心，為維持酶活性所必需；另一個在維持PONl結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性方面起重要作用，Ca2+能促使短期形成酶-底物復(fù)合物并促成其分解，EDTA則可抑制PONl的活性。)
表I家蠶血淋巴中表達PONl活性檢測(單位μ L)
權(quán)利要求
1.一種表達對氧磷酶I基因的家蠶重組桿狀病毒，其特征在于，該病毒含有對氧磷酶I基因。
2.如權(quán)利要求I所述的家蠶重組桿狀病毒，其特征在于，所述對氧磷酶I基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。
3.—種權(quán)利要求I所述家蠶重組桿狀病毒的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)對氧磷酶I基因的合成； (2)將步驟(I)所合成的對氧磷酶I基因連接到轉(zhuǎn)移載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl感受態(tài)細胞，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體； (3)將步驟(2)構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細胞，得到重組桿狀病毒DNA ； (4)將步驟(3)得到的重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染家蠶細胞，得到家蠶重組桿狀病毒。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述對氧磷酶I基因的合成具體包括 (1)設(shè)計上游引物F: 5’-TATG^77TATGGCTAAACTGACAGCG-3’，其中斜體為 &oR I 位占. 下游引物 R : 5 ’ -GCGC7TG^TTACAGCTCACAGTAAAG-3 ’，其中斜體為 Xho I 位點； (2)以pBlueScript-PONl質(zhì)粒為模板，用所設(shè)計引物F和R擴增特異性片段，具體程序為95°C預(yù)變性5min，95°C變性45s，55°C退火30s，72°C延伸45s，循環(huán)30次；最后72°C延伸45s，回收產(chǎn)物，得到對氧磷酶I基因PONl。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)具體包括 將PCR擴增得到的對氧磷酶I基因用及^7 I和通ο I雙酶切后回收，連接到經(jīng)同樣處理的轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMHTA上，使對氧磷酶I基因位于多角體基因啟動子控制之下，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TGl感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，得到重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac HTA-PONl。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)具體包括 將步驟(2)得到的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac HTA-PONl轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac感受態(tài)細胞，通過藍白斑篩選得到重組桿狀病毒DNA。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染家蠶細胞的方法為將重組桿狀病毒DNA通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入家蠶細胞中。
8.一種權(quán)利要求I所述家蠶重組桿狀病毒表達的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
9.一種權(quán)利要求8所述蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (1)將權(quán)利要求1-2任一所述的家蠶重組桿狀病毒感染家蠶BmN細胞進行病毒擴增； (2)針刺法接種家蠶五齡幼蟲及蠶蛹； (3)待發(fā)病后收集表達的權(quán)利8所述蛋白。
10.一種藥物，其特征在于，其活性成分為按照權(quán)利要求9所述方法制備的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種表達對氧磷酶1基因的家蠶重組桿狀病毒及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用基因工程相關(guān)技術(shù)將對氧磷酶1基因構(gòu)建到家蠶桿狀病毒表達系統(tǒng)中，然后利用家蠶生物反應(yīng)器進行目的蛋白的表達。本發(fā)明采用家蠶生物反應(yīng)器表達對氧磷酶1并對其進行了活性檢測，不僅實現(xiàn)了蛋白的高效表達，而且比原核表達的目的蛋白增加了糖基化等修飾，其為進一步研究目的蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號A61K38/46GK102925415SQ20121043344
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月2日
發(fā)明者張耀洲, 李霞, 李曉瑞, 陳劍清, 舒特俊 申請人:天津耀宇生物技術(shù)有限公司