專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于結(jié)腸癌腫瘤組織識(shí)別的量子點(diǎn)靶向探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納米生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于結(jié)腸癌腫瘤組織識(shí)別的量子點(diǎn)靶向探針及其制備方法。
背景技術(shù)：
量子點(diǎn)(QDs)是一種零維半導(dǎo)體納米晶體，近似球形，直徑f 12nm，可分散于水或者有機(jī)溶劑中形成膠體，由于QDs的尺寸接近甚至小于相應(yīng)半導(dǎo)體相材料的激子(電子-空穴對(duì))Bohr半徑，受激發(fā)時(shí)產(chǎn)生的電子和空穴被限制在狹小的三維空間，因而表現(xiàn)出量子效應(yīng)，與傳統(tǒng)的有機(jī)染料相比，QDs具有更優(yōu)異的光譜性質(zhì)，如激發(fā)光譜寬且連續(xù)分布，而發(fā)射光譜呈對(duì)稱(chēng)分布且寬度窄，顏色可調(diào)，并且光化學(xué)穩(wěn)定性高，不易光解(Marcel BJ, Mario M, Peter G, et al. Science 1998，281，2013-2016)。這些優(yōu)越的性能使 QDs 在體內(nèi)細(xì)胞成像和生物特定標(biāo)記等方面都得到了廣泛應(yīng)用，它正在并將日益成為分子細(xì)胞成像研究中非常重要的一種探針工具。因此，具有高性能的水溶性量子點(diǎn)的合成受到了密切關(guān)注。目前，在生物標(biāo)記中應(yīng)用最廣泛的是金屬有機(jī)溶劑法合成的脂溶性CdSe/ZnS量子點(diǎn)。因此，必須將脂溶性的QDs轉(zhuǎn)化成水溶性的QDs才能進(jìn)行生物標(biāo)記。而將脂溶性的QDs轉(zhuǎn)化成水溶性的QDs最常用的方法是先用巰基小分子(如巰基乙酸、巰基丙酸、谷胱甘肽、巰基丁二酸等)取代脂溶性QDs表面的配體，然后通過(guò)偶聯(lián)劑與生物分子偶聯(lián)；另一種常用的QDs標(biāo)記生物分子的方法是與含有組氨酸標(biāo)簽的多肽或蛋白結(jié)合。QDs表面的Zn原子和多組氨酸殘基的金屬親和協(xié)調(diào)作用，含有組氨酸殘基的蛋白質(zhì)和多肽能夠直接接到QDs表面的Zn原子，這種方法具有很好的穩(wěn)定性，已逐漸成為生物標(biāo)記中一種常用的方法。Sapsford等(Sapsford K. E. , Pons T. , Medintz I. L. , et al. J. Phys. Chem. <^2007,111，11528-11538)系統(tǒng)地研究了含組氨酸多肽與QDs之間的相互作用及結(jié)合常數(shù)等，6個(gè)組氨酸序列與QDs的結(jié)合速率是約100秒，KtT1約為I nM。因此，量子點(diǎn)與含有His_tag的多肽之間的結(jié)合是非常穩(wěn)定和迅速的。TCP-I (環(huán)狀多肽cyclo(l，9)_CTPSPFSHC)是通過(guò)體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)和原位結(jié)腸癌動(dòng)物模型相結(jié)合篩選出一種新型的腫瘤靶向多肽。這個(gè)多肽在體內(nèi)可以特異性地結(jié)合結(jié)腸腫瘤新生的血管細(xì)胞(⑶31+陽(yáng)性細(xì)胞)而不會(huì)結(jié)合到正常組織(Li Z J, Wu W K K,Ng S S M, et al. J Control Release, 2010, 148: 292 - 302)。因此，我們制備了一種雙功能的TCP-1-H6多肽，這種多肽既有TCP-I的靶向性又含有一個(gè)組氨酸標(biāo)簽，避免量子點(diǎn)與多肽的結(jié)合受到偶聯(lián)劑的影響，從而得到一種可特異性識(shí)別結(jié)腸癌腫瘤的靶向量子點(diǎn)探針。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了克服現(xiàn)有多肽配體與QDs結(jié)合穩(wěn)定性差以及受到偶聯(lián)劑影響等問(wèn)題，限制其在生物領(lǐng)域中的普及使用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種雙功能的多肽分子，能與QDs結(jié)合速度快，而且穩(wěn)定性好，可以很好的實(shí)現(xiàn)結(jié)腸癌腫瘤的靶向標(biāo)記。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是一種用于結(jié)腸癌腫瘤組織識(shí)別的量子點(diǎn)靶向探針，包括用于結(jié)合量子點(diǎn)的組氨酸序列(I)、提供多肽剛性結(jié)構(gòu)的序列(2)和靶向序列(3)，各序列之間以肽鍵相結(jié)合。所述的組氨酸序列(I)由6-8個(gè)組氨酸組成(H6)；所述的剛性結(jié)構(gòu)的序列為9-11個(gè)脯氨酸序列；所述的靶向序列(3)為T(mén)CP-1，使得量子點(diǎn)與多肽連接后具有結(jié)腸癌腫瘤靶向功能。本發(fā)明所述的量子點(diǎn)為含有Zn的量子點(diǎn)，如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。本發(fā)明還公開(kāi)了上述用于結(jié)腸癌腫瘤組織識(shí)別的量子點(diǎn)靶向探針的制備方法，包括以下步驟首先將多肽與量子點(diǎn)按照18-36:1的比例混合，震蕩10分鐘后，多肽的組氨酸 序列與量子點(diǎn)表面的Zn結(jié)合，再通過(guò)超濾去除多余的多肽分子，即得到量子點(diǎn)一多肽熒光探針。采用上述的技術(shù)方案后，本發(fā)明取得的有益效果是，本發(fā)明提供的可用于結(jié)腸癌腫瘤識(shí)別的靶向性雙功能多肽配體，合成方法簡(jiǎn)單，可重復(fù)性高，與量子點(diǎn)結(jié)合速度快，穩(wěn)定性高，解決了現(xiàn)有量子點(diǎn)多肽配體穩(wěn)定性不足，進(jìn)一步拓展了量子點(diǎn)一多肽復(fù)合物作為納米熒光探針在腫瘤成像中的應(yīng)用。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。圖I是修飾QDs的新型雙功能多肽配體(TCP-1-H6)的結(jié)構(gòu)示意圖；圖中I是結(jié)合QDs的組氨酸序列、2是提供多肽剛性結(jié)構(gòu)的序列、3是靶向序列。圖2 是不同比例TCP-1_H6:QD 的電泳圖譜a, QDs; b, 9:1; c, 18:1; d, 36:1
電泳圖譜。圖3 是Colon 26 細(xì)胞分別與 TCP-1-H6 QD (A), QDs (B)和 TP-1-H6 QD(C)混合孵育4 h后的共聚焦成像圖，標(biāo)尺20 μπι。圖4是TCP-1-H6 QD識(shí)別結(jié)腸癌腫瘤組織。A，TCP-1-Η6 QD結(jié)腸腫瘤組織成像；B，TCP-1-H6 QD 腫瘤組織成像，同時(shí)加入 150 μ M TCP-1-H6 ；C, TCP-1-H6 QD 正常結(jié)腸組織成像；D，TCP-1-H6 QD腦組織成像；E，量子點(diǎn)腫瘤組織成像。放大倍數(shù)400X。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例本發(fā)明將就以下實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，但應(yīng)了解的是，這些實(shí)施例僅為例示說(shuō)明之用，而不應(yīng)被解釋為本發(fā)明實(shí)施的限制。實(shí)施例I
本發(fā)明所述的方法采用常規(guī)的固相Fmoc法，即固相樹(shù)脂上被Fmoc保護(hù)的單體氨基酸去保護(hù)后露出氨基，通過(guò)縮合反應(yīng)與溶液中氨基酸的羧基形成肽鍵，從而將氨基酸連接到樹(shù)脂上，使妝鏈從C端向N端延伸。
I、基本材料
(I)樹(shù)脂與連接分子固相Fmoc法選擇的樹(shù)脂為Rink Amide-ChemMatrix 樹(shù)脂。這種樹(shù)脂具有非常好的溶脹性，可以使肽鏈之間更好地進(jìn)行縮合反應(yīng)，且有足夠的網(wǎng)絡(luò)空間滿(mǎn)足不斷增長(zhǎng)的肽鏈。采用HBTU和HOBt作為連接分子，將多肽分子固定到樹(shù)脂上。(2)單體合成所用單體為經(jīng)化學(xué)修飾的α -氨基酸。2、反應(yīng)步驟
第一步，將第一個(gè)氨基酸共價(jià)連接到樹(shù)脂上
加入適當(dāng)?shù)目s合劑如HBTU和HOBt，使被保護(hù)氨基酸羧基端與樹(shù)脂形成共脂以完成氨基酸的固定；
第二步，去保護(hù)
采用堿性溶劑20%哌啶去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基。第三步，激活和交聯(lián)
采用活化劑HBTU和HOBt活化下一個(gè)氨基上的羧基，與樹(shù)脂上的氨基交聯(lián)，形成肽鍵。第四步，重復(fù)第二步和第三步，反復(fù)循環(huán)添加單體氨基酸，直到合成完成。3、合成后處理
(I)洗脫和脫保護(hù)用脫保護(hù)劑三氟乙酸(TFA)將肽鏈從樹(shù)枝上洗脫下來(lái)，并脫除保護(hù)基。(2 ) HPLC分析純化，凍干保存。(3)成環(huán)反應(yīng)。稱(chēng)取得到的直鏈多肽CTPSPFSHCGP9G2H6 2mg,在ΡΗ9· 4的緩沖液(O. IM NaHCO3,0. 8mL ；0. IM Na2CO3,0. 2 mL)中，震蕩 4 小時(shí)，凍干保存。通過(guò)上述方法，得到多肽序列TCP-l-H6(cyclo(l，9) _CTPSPFSHCGP9G2H6)，見(jiàn)圖 I。4、量子點(diǎn)與多肽偶聯(lián)
將多肽與量子點(diǎn)按照18:1的比例混合，震蕩10分鐘后，用超濾去除多余的多肽分子，即得到量子點(diǎn)一多肽熒光探針，并通過(guò)毛細(xì)管電泳進(jìn)行證實(shí)(圖2，曲線(xiàn)C)。5、結(jié)腸癌腫瘤標(biāo)記
Colon 26細(xì)胞分別與TCP-1-H6 QD混合孵育，熒光成像結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，量子點(diǎn)的熒光與DAPI的熒光有很大重合，這表明TCP-1-H6 QD主要存在于細(xì)胞核內(nèi)。量子點(diǎn)熒光成像清晰地表明TCP-1-H6 QD能特異性進(jìn)入colon 26細(xì)胞內(nèi)，TCP-1-H6的靶向作用引導(dǎo)量子點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)(圖3)。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還證實(shí)，TCP-1-H6 QD可以特異性識(shí)別結(jié)腸癌腫瘤組織切片(圖4A)，但是不會(huì)識(shí)別正常的組織比如結(jié)腸組織和腦組織(圖4C和圖4D)。在下面的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中，將腫瘤組織與TCP-1-H6 QD和150 μ M TCP-1-H6—起混合。有趣的是，TCP-1-Η6 QD仍然能夠清楚的標(biāo)記腫瘤組織(圖4Β)。這些結(jié)果表明TCP-1-H6-QD與腫瘤組織結(jié)合后，由于多價(jià)作用不會(huì)被高濃度的TCP-1-H6競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)。此外，沒(méi)標(biāo)記多肽的量子點(diǎn)與腫瘤組織混合作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)(圖4Ε)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的量子點(diǎn)熒光。因此，這些實(shí)驗(yàn)清楚的表明TCP-1-H6 QD能特異性地結(jié)合結(jié)腸癌腫瘤組織，而且通過(guò)多價(jià)相互作用其標(biāo)記效率可以大大提高。實(shí)施例2
多肽合成步驟同實(shí)施例I。合成多肽配體序列如下cyclo(l, 9)-CTPSPFSHCGP1(iG2H7。實(shí)施例3
多肽合成步驟同實(shí)施例I。合成多肽配體序列如下 cyciod, 9)-CtpspfsHCGp11G2H8
以上述依據(jù)本發(fā)明的理想實(shí)施例為啟示，通過(guò)上述的說(shuō)明內(nèi)容，相關(guān)工作人員完全可以在不偏離本項(xiàng)發(fā)明技術(shù)思想的范圍內(nèi)，進(jìn)行多樣的變更以及修改。本項(xiàng)發(fā)明的技術(shù)性范圍并不局限于說(shuō)明書(shū)上的內(nèi)容，必須要根據(jù)權(quán)利要求范圍來(lái)確定其技術(shù)性范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于結(jié)腸癌腫瘤組織識(shí)別的量子點(diǎn)靶向探針，其特征在于該探針包括用于結(jié)合量子點(diǎn)的組氨酸序列(I )、提供多肽剛性結(jié)構(gòu)的序列(2)和靶向序列(3)，各序列之間以肽鍵相結(jié)合；所述的組氨酸序列(I)由6-8個(gè)組氨酸序列組成；所述的提供多肽剛性結(jié)構(gòu)的序列(2)為9-11個(gè)脯氨酸序列；所述的靶向序列(3)為結(jié)腸癌腫瘤靶向性的多肽序列TCP-1。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于結(jié)腸癌腫瘤組織識(shí)別的量子點(diǎn)靶向探針，其特征在于所述的量子點(diǎn)為含有Zn的量子點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于結(jié)腸癌腫瘤組織識(shí)別的量子點(diǎn)靶向探針，其特征在于所述含有 Zn 的量子點(diǎn)是 CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe 或者 CdTe/ZnSe。
4.一種制備用于結(jié)腸癌腫瘤組織識(shí)別的量子點(diǎn)靶向探針的方法，其特征在于，是首先將多肽與量子點(diǎn)按照18-36:1的比例混合,震蕩10分鐘后，多肽的組氨酸序列與量子點(diǎn)表面的Zn結(jié)合，再通過(guò)超濾去除多余的多肽分子，即得到量子點(diǎn)一多肽熒光探針。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于結(jié)腸癌腫瘤組織識(shí)別的量子點(diǎn)靶向探針的制備方法(TCP-1-H6)，屬于納米生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明中的新型多肽配體包括用于結(jié)合量子點(diǎn)的組氨酸序列(1)、提供多肽剛性結(jié)構(gòu)的序列(2)和靶向序列(3)，各序列之間以肽鍵相結(jié)合。該雙功能配體合成方法簡(jiǎn)單，其N(xiāo)端通過(guò)6個(gè)組氨酸序列與量子點(diǎn)結(jié)合，大大提高了配體與量子點(diǎn)的穩(wěn)定性，可以作為納米熒光探針應(yīng)用于結(jié)腸癌腫瘤標(biāo)記。
文檔編號(hào)A61K49/00GK102961761SQ20121043334
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月2日
發(fā)明者王建浩, 王車(chē)禮, 蔣鵬舉, 邱琳, 夏江 申請(qǐng)人:常州大學(xué)