專利名稱：動脈粥樣硬化疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種疫苗，尤其是一種動脈粥樣硬化疫苗，屬于醫(yī)學生物技術領域。
背景技術：
心血管疾病位列當前威脅人類健康的三大疾病，即心血管疾病、腫瘤和傳染性疾病之首，而動脈粥樣硬化又是心血管疾病的最重要的病理學基礎之一，是引起心肌梗塞、腦梗塞以及冠心病等心腦血管疾病死亡的主要原因，與許多疾病的發(fā)生發(fā)展都有關系。防治動脈粥樣硬化是防治心血管疾病的根本性措施。研制抗動脈硬化疫苗，將有助于抑制動脈硬化的發(fā)生與發(fā)展，有助于降低心肌梗塞、腦梗塞的發(fā)病率，減少冠心病的死亡率，減少這些疾病對人類的危害。膽固醇酯轉運蛋白CETP(即 cholesteryl ester transfer protein),為疏水性糖蛋白，能調(diào)節(jié)高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)向低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的轉運，能介導高密度脂蛋白(HDL)、膽固醇酯(CE)、低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、甘油三酯(TG)之間的交換，還能控制HDL及LDL的質(zhì)和量的變化。而HDL作為膽固醇的接受體，通過與HDL受體的相互作用，能介導膽固醇從外周組織和AS斑塊中流出，并轉運至肝進行代謝，從而降低血漿中的膽固醇水平，抑制AS的發(fā)生、發(fā)展，與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關。因此，抑制CETP的活性，可減少HDL-C向LDL-C的轉化，升高血液中的HDL水平，促進膽固醇逆向轉運，·降低血液中的膽固醇水平，從而減輕動脈粥樣硬化病變。利用噬菌體展示技術來研制基因工程疫苗，是近年來的研究熱點，具有下列多種優(yōu)勢:(1)噬菌體作為表達產(chǎn)物的載體展示的是生物體自身翻譯機制產(chǎn)生的天然構象產(chǎn)物，能很好的誘發(fā)機體的抗原、抗體免疫反應；(2)噬菌體有較強的免疫原性，是天然的免疫佐劑，在嗤囷體表面表達的多妝易于接近抗體，各易被免疫系統(tǒng)識別；(3)嗤囷體可以募集T輔助細胞，而且噬菌體顆粒的不對稱性有利于引發(fā)T細胞依賴的免疫反應；(4)由于噬菌體顆粒是由感染的細菌細胞分泌，噬菌體顆粒可以方便的大規(guī)模生產(chǎn)疫苗用抗原表位，還可以在同一噬菌體上展示多個具有保護性作用的抗原決定簇，構建多價疫苗；(5)純化簡單、花費少；(6)噬菌體顆粒穩(wěn)定，對理化因素的抵抗力強。由于應用噬菌體展示技術研究基因工程疫苗具有以上的優(yōu)點，彌補了傳統(tǒng)疫苗和其它基因工程疫苗產(chǎn)量不高、純化復雜等缺陷，對新型疫苗的開發(fā)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種安全、有效、穩(wěn)定的，能夠預防動脈粥樣硬化的疫苗。本發(fā)明通過下列技術方案完成:一種動脈粥樣硬化疫苗，包括T7噬菌體以及人類膽固醇酯轉運蛋白CETP，其特征在于將人類膽固醇酯轉運蛋白CETP的編碼核酸序列插入T7噬菌體的衣殼蛋白IOB的C端，使人類膽固醇酯轉運蛋白CETP展示于T7噬菌體的表面，從而構建出動脈粥樣硬化疫苗。所述插入T7噬菌體的衣殼蛋白IOB的C端的人類膽固醇酯轉運蛋白CETP的編碼核酸序列為:
atgCTGGCGGCGACCGTGCTGACCCTGGCGCTGCTGGGCAACGCGCATGCGTGCAGCAAAGGCACCAGCCAT
GAAGCGGGCATTGTGTGCCGTATTACCAAACCGGCGCTGCTGGTGCTGAACCATGAAACCGCGAAAGTGATTCAGAC
CGCGTTTCAGCGTGCGAGCTATCCGGATATTACCGGCGAAAAAGCGatgatgCTGCTGGGCCAGGTGAAATATGGCC
TGCATAACATTCAGATTAGCCATCTGAGCATTGCGAGCAGCCAGGTGGAACTGGTGGAAGCGAAAAGCATTGATGTG
AGCATTCAGAACGTGAGCGTGGTGTTTAAAGGCACCCTGAAATATGGCTATACCACCGCGTGGTGGCTGGGCATTGA
TCAGAGCATTGATTTTGAAATTGATAGCGCGATTGATCTGCAGATTAACACCCAGCTGACCTGCGATAGCGGCCGTG
TGCGTACCGATGCGCCGGATTGCTATCTGAGCTTTCATAAACTGCTGCTGCATCTGCAGGGCGAACGTGAACCGGGC
TGGATTAAACAGCTGTTTACCAACTTTATTAGCTTTACCCTGAAACTGGTGCTGAAAGGCCAGATTTGCAAAGAAAT
TAACGTGATTAGCAACATTatgGCGGATTTTGTGCAGACCCGTGCGGCGAGCATTCTGAGCGATGGCGATATTGGCG
TGGATATTAGCCTGACCGGCGATCCGGTGATTACCGCGAGCTATCTGGAAAGCCATCATAAAGGCCATTTTATTTAT
AAAAACGTGAGCGAAGATCTGCCGCTGCCGACCTTTAGCCCGACCCTGCTGGGCGATAGCCGTatgCTGTATTTTTG
GTTTAGCGAACGTGTGTTTCATAGCCTGGCGAAAGTGGCGTTTCAGGATGGCCGTCTGatgCTGAGCCTGatgGGCG
ATGAATTTAAAGCGGTGCTGGAAACCTGGGGCTTTAACACCAACCAGGAAATTTTTCAGGAAGTGGTGGGCGGCTTT
CCGAGCCAGGCGCAGGTGACCGTGCATTGCCTGAAAatgCCGAAAATTAGCTGCCAGAACAAAGGCGTGGTGGTGAA
CAGCAGCGTGatgGTGAAATTTCTGTTTCCGCGTCCGGATCAGCAGCATAGCGTGGCGTATACCTTTGAAGAAGATA
TTGTGACCACCGTGCAGGCGAGCTATAGCAAAAAAAAACTGTTTCTGAGCCTGCTGGATTTTCAGATTACCCCGAAA
ACCGTGAGCAACCTGACCGAAAGCAGCAGCGAAAGCATTCAGAGCTTTCTGCAGAGCatgATTACCGCGGTGGGCAT
TCCGGAAGTGatgAGCCGTCTGGAAGTGGTGTTTACCGCGCTGatgAACAGCAAAGGCGTGAGCCTGTTTGATATTA
TTAACCCGGAAATTATTACCCGTGATGGCTTTCTGCTGCTGCAGatgGATTTTGGCTTTCCGGAACATCTGCTGGTG
GATTTTCTGCAGAGCCTGAGC
所述人類膽固醇酯轉運蛋白CETP的氨基酸序列為=MetLeuAlaAlaThrValLeuThrLeuAlaLeuLeuGlyAsnAlaHisAlaCysSerLysGlyThrSerHisGluAlaGlylleValCysArglleThrLysProAIaLeuLeuValLeuAsnHisGluThrAlaLysValIIeGlnThrAlaPheGlnArgAlaSerTyrProAspIIeThrGlyGluLysAlaMetMetLeuLeuGlyGlnValLysTyrGlyLeuHisAsnlleGlnlleSerHisLeuSerlleAlaSerSerGlnValGluLeuValGluAlaLysSerIIeAspValSerIIeGlnAsnValSerValValPheLysGlyThrLeuLysTyrGlyTyrThrThrAlaTrpTrpLeuGlylIeAspGlnSerIIeAspPheGluIIeAspSerAlaIIeAspLeuGlnIIeAsnThrGlnLeuThrCysAspSerGlyArgValArgThrAspAlaProAspCysTyrLeuSerPheHisLysLeuLeuLeuHisLeuGlnGlyGluArgGluProGlyTrpIIeLysGlnLeuPheThrAsnPheIIeSerPheThrLeuLysLeuValLeuLysGlyGlnIIeCysLysGluIIeAsnValIIeSerAsnIIeMetAlaAspPheValGlnThrArgAlaAlaSerIIeLeuSerAspGlyAspIIeGlyValAspIIeSerLeuThrGlyAspProValIIeThrAlaSerTyrLeuGluSerHisHisLysGlyHisPheIIeTyrLysAsnValSerGluAspLeuProLeuProThrPheSerProThrLeuLeuGlyAspSerArgMetLeuTyrPheTrpPheSerGluArgValPheHisSerLeuAlaLysValAlaPheGlnAspGlyArgLeuMetLeuSerLeuMetGlyAspGluPheLysAlaValLeuGluThrTrpGlyPheAsnThrAsnGlnGluIlePheGlnGluValValGlyGlyPheProSerGlnAlaGlnValThrValHisCysLeuLysMetProLysIleSerCysGlnAsnLysGlyValValValAsnSerSerValMetValLysPheLeuPheProArgProAspGlnGlnHisSerValAlaTyrThrPheGluGluAspIleValThrThrValGlnAlaSerTyrSerLysLysLysLeuPheLeuSerLeuLeuAs pPheGlnlIeThrProLysThrValSerAsnLeuThrGluSerSerSerGluSerlIeGlnSerPheLeuGlnSerMetIIeThrAlaValGlyIleProGluValMetSerArgLeuGluValValPheThrAlaLeuMetAsnSerLysGlyValSerLeuPheAspIIeIIeAsnProGluIIelIeThrArgAspGlyPheLeuLeuLeuGlnMetAspPheGlyPheProGluHisLeuLeuValAspPheLeuGlnSerLeuSer。所用基因工程載體為T7噬菌體。本發(fā)明具有以下優(yōu)點和效果:采用上述方案獲得的動脈粥樣硬化疫苗安全、無毒，遺傳穩(wěn)定性好，能夠有效誘導機體產(chǎn)生抗膽固醇酯轉運蛋白CETP的抗體，減少HDL-C向LDL-C的轉化，升高血液中HDL水平，促進膽固醇逆向轉運，降低血液中的膽固醇水平，從而減輕動脈粥樣硬化病變，達到預防動脈粥樣硬化的目的。


圖1為用CETP-1疫苗包被檢測抗CETP抗體的產(chǎn)生情況，樣本數(shù)η=12，數(shù)值表示為均值土標準差，即mean土 SEM, W表不week。圖2為用CETP-2疫苗包被檢測抗CETP抗體的產(chǎn)生情況，每組樣本數(shù)n=12，數(shù)值表示為均值土標準差，即mean土SEM, W表示week。圖3為用CETP-C26包被酶標板檢測CETP 抗體的產(chǎn)生情況，每組樣本數(shù)n=12，數(shù)值表示為均值土標準差，即mean土SEM，W表示week，如圖所示CETP1、CETP2組與phage組相比有差異，P〈0.05差異具有統(tǒng)計學意義。圖4為注射疫苗后CETP活性的變化，每組樣本數(shù)n=12，數(shù)值表示為均值土標準差，即mean土SEM,圖中縱坐標表不CETP活性單位pmmol/μ I sample/1 hr。CETP-1組即AS+CETP-1疫苗免疫組；CETP2組即AS+CETP2疫苗免疫組；phage組即AS+噬菌體空載體組！adjuvant組即AS+佐劑組(下同)。CETPl組、CETP2組與phage組、adjuvant組相比有差異，P〈0.05，差異具有統(tǒng)計學意義；CETP1組、CETP2組與phage組、adjuvant組相比有差異，Ρ〈0.05,差異具有統(tǒng)計學意義；phage組、adjuvant組與control組相比有顯著差異，P〈0.01，差異具有統(tǒng)計學意義。圖5為注射CETP疫苗后血中甘油三酯(mmol/L)的變化，每組樣本數(shù)n=12，數(shù)值表示為均值土標準差，即mean土SEM，如圖CETPl組、CETP2組與phage組相比差異顯著，P<0.01，差異具有統(tǒng)計學意義。圖6為注射CETP疫苗后血中總膽固醇(mmol/L)的變化，每組樣本數(shù)n=12，數(shù)值表示為均值土標準差，即mean土SEM，如圖CETPl組與phage組相比有差異，P〈0.05 ;差異具有統(tǒng)計學意義；phage組、adjuvant組與control組比有顯著差異，Ρ〈0.01,差異具有統(tǒng)計學意義。.圖7為注射CETP疫苗后血中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c) (mmol/L)的變化，每組樣本數(shù)n=12,數(shù)值表示為均值土標準差，即mean土SEM,如圖phage組、adjuvant組與control組相比有顯著差異，P〈0.01，差異具有統(tǒng)計學意義。圖8為注射CETP疫苗后血中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c) (mmol/L)的變化每組樣本數(shù)n=12,數(shù)值表示為均值土標準差，即mean土SEM。圖9為注射CETP疫苗后血中HDL-C/total-C比值的變化，每組樣本數(shù)n=12，數(shù)值表示為均值土標準差，即mean土SEM,如圖phage組、adjuvant組與control組比有顯著差異，P〈0.01，差異具有顯著性。圖10為注射CETP疫苗后血中LDL-c/total-c比值的變化，每組樣本數(shù)n=12，數(shù)值表示為均值土標準差，即mean土SEM，CETPl組、CETP2組與phage組相比有差異，Ρ〈0.05，差異具有統(tǒng)計學意義；CETPl組、CETP2組與adjuvant組相比有差異，P〈0.05，差異具有統(tǒng)計學意義；phage組、adjuvant組與control組相比有差異，Ρ〈0.05,差異具有統(tǒng)計學意義；phage組與control組相比有差異，P〈0.01,差異具有統(tǒng)計學意義。圖11為注射CETP疫苗后血中HDL-C/LDL-C的變化，每組樣本數(shù)n=12，數(shù)值表示為均值土標準差，即mean土SEM，CETP2組與adjuvant組相比有差異，Ρ〈0.05，差異具有統(tǒng)計學意義；phage組、adjuvant組與control組相比有顯著差異，Ρ〈0.01,差異具有統(tǒng)計學意義。圖12為注射CETP疫苗后血中Apo-Al (g/L)的變化，每組樣本數(shù)n=12，數(shù)值表示為均值土標準差，即mean 土 SEM，CETPl組與phage組、adjuvant組相比有差異，Ρ〈0.05，差異具有統(tǒng)計學意義；phage組、adjuvant組與control組相比Ρ〈0.01.差異具有統(tǒng)計學意義；CETP1組與phage組相比有差異，P〈0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。圖13為注射CETP疫苗后血中Apo-B (g/L)的變化每組樣本數(shù)n=12，數(shù)值表示為均值土標準差，即mean 土 SEM。
具體實施例方式下面結合實施對發(fā)明進行進一步描述，但發(fā)明之內(nèi)容并不局限于此。實施例1
A動脈粥樣硬化疫苗重組噬菌體的構建
由商業(yè)公司合成人類膽固醇酯轉運蛋白C`ETP編碼DNA序列在pGEM-T載體上，DNA序列的5’端含限制性內(nèi)切酶EcoRI的酶切位點，3’端含限制性內(nèi)切酶Hind III的酶切位點。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Hind III處理pGEM_T載體，得到含有EcoRI和Hind III粘性末端的人類膽固醇酯轉運蛋白CETP編碼DNA序列，用市售小量膠回收試劑盒回收該片段；用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Hind III處理T7噬菌體載體T7 select 10_3b，用市售小量膠回收試劑盒回收經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和Hind III處理的T7噬菌體載體T7 select10-3b大片段；用T4連接酶體系將含有EcoRI和Hind III粘性末端的人類膽固醇酯轉運蛋白CETP編碼DNA序列與經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和Hind III處理的T7噬菌體載體T7select 10-3b大片段連接，即將含有EcoRI和Hind III粘性末端的人類膽固醇酯轉運蛋白CETP編碼DNA序列插入T7 select 10_3b的克隆位點EcoRI和Hind III之間，該插入點正好位于T7噬菌體IOB基因的3’端；將連接所得的重組噬菌體核酸，用T7噬菌體包裝試劑盒T7 Select Packaging Kit包裝為完整噬菌體；按每100 μ I包裝反應物與250 μ I菌液的量，將包裝反應物接種于用LB培養(yǎng)基37°C新鮮培養(yǎng)的0D600為1.0的BLT5403菌液上混勻后，迅速與5ml融化后42°C溫浴的上層瓊脂混合均勻，并鋪氨芐抗性LB瓊脂培養(yǎng)平板，37°C倒置培養(yǎng)至形成噬菌斑；其中:
所用LB培養(yǎng)基配法如下:細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10g，細菌培養(yǎng)用酵母提取物5g，NaCl 5g，溶于約900ml注射用水中，用lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，再定容至1000ml，1.034X 105Pa高壓蒸汽滅菌20min ；
所用上層瓊脂配法如下:細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10 g，細菌培養(yǎng)用酵母提取物
5g，NaCl 5 g，瓊脂6 g，加入注射用水約900ml，用lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，1.034 X 105Pa高壓下蒸汽滅菌20min后，分裝成5ml每支，4°C存放備用；當中，所用細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨以及細菌培養(yǎng)用酵母提取物和瓊脂，均購自英國OXOID LTD公司，NaCl購自中山化學試劑公司；
所用氨芐抗性LB瓊脂培養(yǎng)平板制法如下:細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10g，細菌培養(yǎng)用酵母提取物5g，NaCl 5g，細菌培養(yǎng)用瓊脂15g，加入注射用水約900ml，用lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5,再定容至1000ml,1.034X 105Pa高壓蒸汽滅菌20min,冷卻至50°C以下加入氨節(jié)青霉素，混勻后鋪平板；
B動脈粥樣硬化疫苗重組噬菌體的篩選、鑒定
從步驟A所得長有噬菌斑的平板挑取單個噬菌斑，用PCR方法和測序方法綜合鑒定篩選出含人類膽固醇酯轉運蛋白CETP編碼基因的陽性噬菌體克隆得到含人類膽固醇酯轉運蛋白CETP編碼基因的重組噬菌體，作為動脈粥樣硬化疫苗種子；
C動脈粥樣硬化疫苗原液的制備
將步驟B所得單克隆化的含人類膽固醇酯轉運蛋白CETP編碼基因的重組噬菌體作為疫苗種子接種于用LB培養(yǎng)基37°C新鮮培養(yǎng)的0D600為1.0的BLT5403菌液進行大量擴增，得到動脈粥樣硬化疫苗原液；
D動脈粥樣硬化疫苗的濃縮純化
在步驟C所得動脈粥樣硬化疫苗原液中加入氯化鈉固體，加入量為:每IL動脈粥樣硬化疫苗原液中加入58.6g氯化鈉，振搖至溶解,促進細菌碎片沉淀，4°C,4000rpm離心20min，收集上清加入PEG8000，加入量為:每IL動脈粥樣硬化疫苗原液中加入IOOgPEG8000，振蕩至完全溶解后，4°C過夜；4°C，IOOOOrpm離心30min，棄上清，取沉淀，將每IL動脈粥樣硬化疫苗原液所得沉淀用20ml噬菌體稀釋液劇烈抽提沉淀，4°C、IOOOOrpm離心15min，收集上清，再重復抽提I次，將兩次抽提離心所得上清液合并，即為動脈粥樣硬化疫苗的濃縮液，并用噬斑法測定該濃縮液中重組噬菌體滴度；其中，所述噬菌體稀釋液成分如下:每 IL 菌體稀釋液含 ImolNaCl, IOmmolTris-HCl (ρΗ8.0), lmmol EDTA ；
E動脈粥樣硬化疫苗的甲醛滅活
將步驟D所得動脈粥樣硬化疫苗濃縮液按照每4000ml動脈粥樣硬化疫苗的濃縮液加入Ig甲醛的比例加入甲醛，37°C IOOrpm振蕩滅活4天后檢測滴度為0，按每Iml噬菌體溶液加入100 μ I NaHSO3的比例，中和動脈粥樣硬化疫苗濃縮液中的殘余甲醛，得到動脈粥樣硬化疫苗滅活液；
F將步驟E所得動脈粥樣硬化疫苗滅活液用生理鹽水稀釋至所需濃度，得到動脈粥樣硬化疫苗使用液，用于疫苗接種。所用限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物公司。所用小量膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司。所用限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物公司。所用Τ7卩遼菌體載體Τ7 select 10_3b購自Novagen公司。所用T4連接酶體系購自大連寶生物公司。所用T7卩遼菌體包裝試劑盒T7 Select Packaging Kit購自Novagen公司。 所用菌種BLT5403購自Novagen公司。所用細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨購自英國OXOID LTD公司。
所用細菌培養(yǎng)用酵母提取物購自英國OXOID LTD公司。所用瓊脂購自英國OXOID LTD公司。所用NaCl購自廣州市番禺力強化工廠。所用氨節(jié)青霉素購自Amresco。PEG6000 購自 Merck, Tris-HCl 購自 Amresco ；EDTA 購自 Amresco,甲醒購自廣州市番禺力強化工廠，NaHSO3購自廣州市番禺力強化工廠。本發(fā)明經(jīng)一系列生物學實驗，結果如下:1、動脈粥樣硬化疫苗的遺傳穩(wěn)定性試驗
動脈粥樣硬化疫苗種子經(jīng)連續(xù)傳代20次，于原代、第5代、第10代、第20代分別用PCR方法及測序方法檢測是否表達動脈粥樣硬化CETP蛋白。實驗證明，動脈粥樣硬化疫苗種子經(jīng)連續(xù)傳代20次之后仍能穩(wěn)定表達CETP蛋白。結果見表I。、動脈粥樣硬化疫苗種·子的熱穩(wěn)定性試驗 O疫苗種子37°c保存的穩(wěn)定性
37°C條件下，動脈粥樣硬化疫苗種子滴度下降很快，無甘油組第7天時由IO11 pfu /ml下降至IO9 pfu / ml,而添加甘油組則在第7天時降至IO8 pfu / ml,添加甘油未見明顯的保護作用，結果見表2。2)疫苗種子25°C保存的穩(wěn)定性
25°C條件下，動脈粥樣硬化疫苗種子滴度無甘油組第15天時下降至IO9 pfu / ml，而添加甘油組則下降至IO8 pfu / ml，添加甘油未見明顯的保護作用，見表3。3)疫苗種子4°C保存的穩(wěn)定性
4°C條件下，噬菌體疫苗種子滴度無甘油組與添加甘油組第47天時均下降至101°Pfu / ml，與在37°C和25°C條件下保存相比，下降速度較慢，在相對長的時間內(nèi)仍保持較高的滴度，但添加甘油未見明顯的保護作用，見表4。4)疫苗種子一 20°C保存的穩(wěn)定性
在一 20°C條件下，動脈粥樣硬化疫苗種子滴度無甘油組第60天時仍保持在101°pfu / ml,第90天時下降至IO7 pfu / ml ;添加甘油組第90天時仍保持在101° pfu / ml,至第150天時下降至IO8 pfu / ml，明顯高于無甘油組，添加甘油可見較明顯的保護作用，見表5。試驗證明動脈粥樣硬化疫苗種子在4°C可短期保存，在一 20°C可長期保存，并可添加甘油作為保護劑。動脈粥樣硬化疫苗的穩(wěn)定性試驗
測定2°C 8°C條件下保存不同時長的動脈粥樣硬化疫苗pH值、免疫小鼠后的抗CETP抗體效價、異常毒性試驗及無菌試驗,結果見表6。實驗證明該疫苗在2_8°C條件下保存6個月，其免疫原性、異常毒性、無菌試驗、理化性質(zhì)均保持穩(wěn)定。后續(xù)將進行更長保存時長的疫苗穩(wěn)定性實驗，以為疫苗最終效期制訂提供實驗依據(jù)。、動脈粥樣硬化疫苗的初步藥效學研究
4.1利用新西蘭大耳白兔高脂食物誘發(fā)動脈粥樣硬化模型(以下簡稱AS模型)觀察動脈粥樣硬化疫苗(以下實驗圖表中簡稱CETP疫苗)防治動脈粥樣硬化的效果。4.1.1家兔動脈粥樣硬化模型制備
新西蘭大耳白兔，高脂飼料配方:基礎飼料:蛋黃粉:豬油:膽固醇=86: 10: 3:1,每只每天定量給予飼料120g/天，飼喂2/3基礎飼料，1/3高膽固醇飼料(含0.4g膽固醇)，自由飲水。連續(xù)喂養(yǎng)6個月，即可制備出較穩(wěn)定的動脈粥樣硬化模型。4.2實驗分組:
I)AS模型組，實驗開始(n=10，下同):高脂飼料喂養(yǎng)24周。該組又分為AS+佐劑(adjuvant)組和AS+曬菌 體空載體(phage)組兩種處理，以排除佐劑和空載體對AS形成的影響。制備兩個批次的動脈粥樣硬化疫苗重組噬菌體原液，分別稱CETP-1和CETP-2。2)CETP-1組，n=12:分別在第O周、4周、8周初注射I號CETP疫苗各一次，共注射3次，之后開始詞喂聞脂詞料24周，總觀察期32周。3)CETP-2組，n=12:分別在第O周、4周、8周初注射I號CETP疫苗各一次，共注射3次，之后開始詞喂聞脂詞料24周，總觀察期32周。4)正常對照組(n=12):正常飼料喂養(yǎng)32周，同時在上述相同時間點注射佐劑3次。疫苗劑量、給藥時間、抗CETP抗體產(chǎn)生情況以及CETP活性的變化:
將動脈粥樣硬化疫苗(加鋁佐劑(lml/lmg/只)和硫酸乙酰肝素2mg/只)混懸液)主動免疫，于O周、4周、8周初分別皮下注射，其中疫苗噬菌體濃度相當于IXlO9 pfu/只。4.3采用ELISA方法對家兔血清的CETP抗體和CETP活性進行了檢測，方法穩(wěn)定。結果如圖1和圖2所示，家兔在分別注射兩種疫苗后的第4周抗體水平開始升高，到第16周達到頂峰，以后抗體水平開始緩慢下降，但仍明顯高于adjuvant組和正常對照組(n=12，mean土SEM)。而用人工合成的含CETP羧基端26個氨基酸殘基的多肽(CETP-C26)作為抗原包被酶標板，進一步證實家兔體內(nèi)產(chǎn)生的抗體為CETP抗體(如圖3)，但用CETP-C26檢測抗體的方法僅在第8周發(fā)現(xiàn)CETP-1組和CETP-2組動物的CETP抗體顯示了有統(tǒng)計學意義的升高，而4周后的其余時間點盡管似有CETP抗體水平的升高，但無統(tǒng)計學差異。這里需要指出的是，由于CETP-C26檢測方法的靈敏度或檢查方法不同的問題，所檢測出的抗體水平并不一定與用CETP疫苗主動免疫組CETP抗體產(chǎn)生水平一致，這里僅說明用CETP疫苗主動免疫動物后抗體產(chǎn)生的特異性(是否針對CETP)。CETP抗體的產(chǎn)生抑制了 CETP的活性:由圖4可知，AS組家兔血清中的CETP活性從第16周開始逐漸升高，明顯高于正常對照組。而CETP-1組和CETP-2組CETP活性雖有所升高，在第8周、第24周明顯低于AS組。說明由動脈粥樣硬化疫苗產(chǎn)生的抗CETP抗體能有效抑制家兔體內(nèi)CETP的活性。4.4采用酶法及免疫比濁法對血清中的血脂進行檢測，CETP疫苗免疫后可不同程度地降低高脂家兔血脂的某些指標，包括甘油三酯(圖5)、總膽固醇(圖6)、LDL-c (圖10)以及 LDL-c/total-c 比值(圖 8)顯著降低，HDL-c/total-c 比值(圖 9)、HDL-c/LDL_c 比值(圖11)和Apo-Al (圖12)顯著升高，但HDL-c (圖7)和Apo-Bl (圖13)的水平與AS組相比無顯著性變化。4.5采用病理切片染色及免疫組化的方法對家兔動脈管壁的病變程度進行分析。結果表明，事先注射CETP疫苗免疫可在一定程度上減輕動脈粥樣硬化病變。主動脈大體油紅O染色顯示，正常對照組主動脈內(nèi)膜光滑，未見粥樣硬化斑塊。模型組主動脈內(nèi)膜有嚴重的粥樣硬化病變，斑塊呈點、斑、條狀隆起，邊緣清楚，表面無明顯破潰，較嚴重者斑塊融合成片，密布內(nèi)膜面，以主動脈起始部為重。CETP疫苗I組和CETP疫苗2組主動脈內(nèi)膜散在粥樣斑塊，多集中在主動脈起始部。病理圖像分析系統(tǒng)定量測定主動脈斑塊面積占主動脈總面積的百分比，疫苗I組和疫苗II組斑塊面積分別較模型組減少30.8%和27.6%。通過大體觀察進行病變分級:0級，內(nèi)膜表面光滑，無紅染；0.5級，內(nèi)膜有輕度紅染，但無凸出于表面的斑塊；I級，有明顯凸起紅染斑塊，面積小于3mm2; 2級，斑塊面積大于3mm2 ；3級，斑塊融合成片，大部分斑塊面積大于3mm2 ；4級，斑塊幾乎覆蓋整個動脈內(nèi)膜。統(tǒng)計結果=CETPl組病變評分為3.00±0.71，CETP2組病變評分為2.60±0.90，模型組病變評分為3.40 ±1.34，正常對照組病變評分為O級。其它組織學檢查均顯示用疫苗免疫后，動脈粥樣硬化病變有一定程度減輕，從主動脈切片HE染色、彈力纖維染色、巨噬細胞免疫組化染色、主動脈切片油紅O染色等均能得到看出以上效果。疫苗藥效學研究小結:
1)兩個批次CETP噬菌體疫苗均能有效誘導動物體內(nèi)CETP抗體的產(chǎn)生；
2)兩個批次CETP噬菌體疫苗均能抑制動物體內(nèi)CETP的活性；
3)CETP噬菌體疫苗在一定程度上能改善AS動物的血脂指標，包括升高動物血清中HDL-c/總膽固醇的比值，降低甘油三酯和LDL-c水平以及LDL_c/總膽固醇的比值，升高Apo-Al水平等；
4)CETP疫苗能在一定程度上抑制家兔動脈粥`樣硬化斑塊的形成，與AS組相比，疫苗免疫平均可使動脈粥樣硬化瘢塊面積減少約25%左右，且兩種疫苗的預防效果無明顯差異；但CETP疫苗免疫并不能完全阻止粥樣硬化病變的形成；
5)CETP疫苗能抑制巨噬細胞向血管壁的浸潤，對血管內(nèi)皮有一定保護作用。疫苗猴體實驗
疫苗經(jīng)預防接種后，有效誘導恒河猴產(chǎn)生抗CETP蛋白的抗體，抗體滴度達到1:3012±21。動脈粥樣硬化疫苗免疫恒河猴后血清抗CETP抗體水平的檢測:
用動脈粥樣硬化疫苗免疫恒河猴，IO10Pfu/只/次，分別于第0、1、4月三次免疫，同時設空白對照組，注射生理鹽水0.1 ml/只。分別于0、4、8、12、16、20、24、28周采集靜脈血，分離血清，用ELISA法檢測抗CETP抗體。檢測結果表明，動脈粥樣硬化疫苗免疫恒河猴后，誘導了抗CETP抗體的產(chǎn)生，并且抗體水平在20周時升至最高，達到1:1396±21，與空白對照組相比，差異顯著，P〈0.01，之后開始下降，說明動脈粥樣硬化疫苗能有效地誘導動物抗CETP抗體的產(chǎn)生，檢測結果見附表7。附表I動脈粥樣硬化疫苗遺傳穩(wěn)定性
權利要求
1.一種動脈粥樣硬化疫苗，包括T7噬菌體以及人類膽固醇酯轉運蛋白CETP，其特征在于將人類膽固醇酯轉運蛋白CETP的編碼核酸序列插入Τ7噬菌體的衣殼蛋白IOB的C端，使人類膽固醇酯轉運蛋白CETP展示于Τ7噬菌體的表面，從而構建出動脈粥樣硬化疫苗。
2.如權利要求1所述的動脈粥樣硬化疫苗，其特征在于，所述插入Τ7噬菌體的衣殼蛋白IOB的C端的人類膽固醇酯轉運蛋白CETP的編碼核酸序列為:atgCTGGCGGCGACCGTGCTGACCCTGGCGCTGCTGGGCAACGCGCATGCGTGCAGCAAAGGCACCAGCCATGAAGCGGGCATTGTGTGCCGTATTACCAAACCGGCGCTGCTGGTGCTGAACCATGAAACCGCGAAAGTGATTCAGACCGCGTTTCAGCGTGCGAGCTATCCGGATATTACCGGCGAAAAAGCGatgatgCTGCTGGGCCAGGTGAAATATGGCCTGCATAACATTCAGATTAGCCATCTGAGCATTGCGAGCAGCCAGGTGGAACTGGTGGAAGCGAAAAGCATTGATGTGAGCATTCAGAACGTGAGCGTGGTGTTTAAAGGCACCCTGAAATATGGCTATACCACCGCGTGGTGGCTGGGCATTGATCAGAGCATTGATTTTGAAATTGATAGCGCGATTGATCTGCAGATTAACACCCAGCTGACCTGCGATAGCGGCCGTGTGCGTACCGATGCGCCGGATTGCTATCTGAGCTTTCATAAACTGCTGCTGCATCTGCAGGGCGAACGTGAACCGGGCTGGATTAAACAGCTGTTTACCAACTTTATTAGCTTTACCCTGAAACTGGTGCTGAAAGGCCAGATTTGCAAAGAAATTAACGTGATTAGCAACATTatgGCGGATTTTGTGCAGACCCGTGCGGCGAGCATTCTGAGCGATGGCGATATTGGCGTGGATATTAGCCTGACCGGCGATCCGGTGATTACCGCGAGCTATCTGGAAAGCCATCATAAAGGCCATTTTATTTATAAAAACGTGAGCGAAGATCTGCCGCTGCCGACCTTTAGCCCGACCCTGCTGGGCGATAGCCGTatgCTGTATTTTTGGTTTAGCGAACGTGTGTTTCATAGCCTGGCGAAAGTGGCGTTTCAGGATGGCCGTCTGatgCTGAGCCTGatgGGCGATGAATTTAAAGCGGTGCTGGAAACCTGGGGCTTTAACACCAACCAGGAAATTTTTCAGGAAGTGGTGGGCGGCTTTCCGAGCCAGGCGCAGGTGACCGTGCATTGCCTGAAAatgCCGAAAATTAGCTGCCAGAACAAAGGCGTGGTGGTGAACAGCAGCGTGatgGTGAAATTTCTGTTTCCGCGTCCGGATCAGCAGCATAGCGTGGCGTATACCTTTGAAGAAGATATTGTGACCACCGTGCAGGCGAGCTATAGCAAAAAAAAACTGTTTCTGAGCCTGCTGGATTTTCAGATTACCCCGAAAACCGTGAGCAACCTGACCGAAAGCAGCAGCGAAAGCATTCAGAGCTTTCTGCAGAGCatgATTACCGCGGTGGGCATTCCGGAAGTGatgAGCCGTCTGGAAGTGGTGTTTACCGCGCTGatgAACAGCAAAGGCGTGAGCCTGTTTGATATTATTAACCCGGAAATTATTACCCGTGATGGCTTTCTGCTGCTGCAGatgGATTTTGGCTTTCCGGAACATCTGCTGGTGGATTTTCTGCAGAGCCTGAGC。
3.如權利要求1所述 的動脈粥樣硬化疫苗，其特征在于插入T7噬菌體的衣殼蛋白IOB的C端的人類膽固醇酯轉運蛋白CETP的氨基酸序列為=MetLeuAlaAlaThrValLeuThrLeuAlaLeuLeuGlyAsnAlaHisAlaCysSerLysGlyThrSerHisGluAlaGlyIIeValCysArgIIeThrLysProAlaLeuLeuValLeuAsnHisGluThrAlaLysVallleGlnThrAlaPheGlnArgAlaSerTyrProAspIleThrGlyGluLysAlaMetMetLeuLeuGlyGlnValLysTyrGlyLeuHisAsnlIeGlnIIeSerHisLeuSerIleAlaSerSerGlnValGluLeuValGluAlaLysSerIIeAspValSerIIeGlnAsnValSerValValPheLysGlyThrLeuLysTyrGlyTyrThrThrAlaTrpTrpLeuGlylIeAspGlnSerIIeAspPheGluIIeAspSerAlaIIeAspLeuGlnlleAsnThrGlnLeuThrCysAspSerGlyArgValArgThrAspAlaProAspCysTyrLeuSerPheHisLysLeuLeuLeuHisLeuGlnGlyGluArgGluProGlyTrpIIeLysGlnLeuPheThrAsnPheIIeSerPheThrLeuLysLeuValLeuLysGlyGlnlIeCysLysGluIIeAsnValIIeSerAsnIIeMetAlaAspPheValGlnThrArgAlaAlaSerlleLeuSerAspGlyAspIleGlyValAspIleSerLeuThrGlyAspProVallleThrAlaSerTyrLeuGluSerHisHisLysGlyHisPheIIeTyrLysAsnValSerGluAspLeuProLeuProThrPheSerProThrLeuLeuGlyAspSerArgMetLeuTyrPheTrpPheSerGluArgValPheHisSerLeuAlaLysValAlaPheGlnAspGlyArgLeuMetLeuSerLeuMetGlyAspGluPheLysAlaValLeuGluThrTrpGlyPh
全文摘要
本發(fā)明提供一種動脈粥樣硬化疫苗，包括T7噬菌體以及人類膽固醇酯轉運蛋白CETP，其特征在于將人類膽固醇酯轉運蛋白CETP的編碼核酸序列插入T7噬菌體的衣殼蛋白10B的C端，使人類膽固醇酯轉運蛋白CETP展示于T7噬菌體的表面，從而構建出動脈粥樣硬化疫苗。該疫苗接種后，能夠有效降低血漿中的膽固醇水平，達到預防動脈粥樣硬化的目的，并且具有安全無毒，遺傳穩(wěn)定性好等特點。
文檔編號A61P9/10GK103071152SQ20121043280
公開日2013年5月1日 申請日期2012年11月3日 優(yōu)先權日2012年11月3日
發(fā)明者胡凝珠, 曹濟民, 胡云章, 徐啟華, 郝維, 王海漩 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所, 中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所