專利名稱：甲型流感病毒抗原決定區(qū)更換方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種甲型流感病毒不同毒株之間HA基因上 抗原性片段相互替換的甲型流感病毒抗原決定區(qū)更換方法。
背景技術(shù)：
流行性感冒簡(jiǎn)稱流感，被人們認(rèn)識(shí)已有一百余年的歷史，每到秋冬以及冬春季節(jié) 會(huì)就發(fā)生流行，成為全球最嚴(yán)重的傳染病之一。20世紀(jì)發(fā)生的幾次全球性大規(guī)模流行，造 成大量人口死亡，給人類社會(huì)帶來深重災(zāi)難。例如，因1918年的西班牙流感(H1N1)而死亡 的人數(shù)估計(jì)超過5000萬，1957年的亞洲流感(H2N2)和1968年的香港流感(H3N2)也有幾 百萬人死亡，該病導(dǎo)致的死亡人數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了因戰(zhàn)爭(zhēng)而死亡的人數(shù)。2009年，發(fā)端于墨西哥 的新甲型Hmi流感在全球肆虐。流感病毒是引起流感的病原體，屬于正黏病毒科單股負(fù)義分節(jié)段的RNA病毒，根 據(jù)核蛋白和M蛋白抗原性的不同，分為甲、乙、丙三個(gè)型。其中乙型流感病毒抗原性相對(duì)穩(wěn) 定，疫苗預(yù)防效果顯著，并且普通人群自身攜帶的抗體已具有較好的免疫保護(hù)作用。丙型流 感病毒抗原性穩(wěn)定，多為散發(fā)病例，不引起流行，危害小。但甲型流感病毒具有極易變異、亞 型眾多、傳染性強(qiáng)、宿主范圍廣等特點(diǎn)，是當(dāng)前最難以控制的傳染病原之一。引起世界范圍 大流行的都是甲型流感病毒，近十年來人類感染H5m、H9N2、H7N7等亞型的禽流感病毒也 屬于甲型流感病毒范疇。甲型流感病毒按其表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的 抗原性不同，又可分為16個(gè)HA亞型和9個(gè)NA亞型，并且在HA和NA上存在著多個(gè)抗原決 定區(qū)，如HI亞型的HA蛋白抗原決定區(qū)分為Sa、Sb、Cal、Ca2和Cb，H3亞型病毒的HA蛋白 抗原決定區(qū)分為A、B、C、D和E。甲型流感病毒抗原性變異分為抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變兩類。 抗原漂移指逐漸發(fā)生點(diǎn)或局部變異，引起流感的中小規(guī)模流行，一般認(rèn)為抗原漂移使得流 感病毒每1 3年出現(xiàn)一次新變種；抗原轉(zhuǎn)變指大的抗原變異，變異結(jié)果會(huì)產(chǎn)生新的不同亞 型，并且它的改變和病毒的毒力密切相關(guān)。由于人群對(duì)新的亞型缺乏相應(yīng)抗體，常常會(huì)引起 大的流行。因此，亞型眾多的甲型流感病毒及其抗原性極易變異等特點(diǎn)給疫苗研發(fā)帶來了 巨大困難，常規(guī)滅活疫苗不能完全覆蓋隨時(shí)變異的流感病毒株，病毒往往能逃逸疫苗的保 護(hù)作用而引起大流行。現(xiàn)有的疫苗預(yù)防策略呈現(xiàn)一種明顯的滯后狀態(tài)，面對(duì)新的毒株或新 的亞型，原有疫苗無法提供足夠有效的保護(hù)，需要在短時(shí)間內(nèi)研發(fā)針對(duì)性疫苗。隨著分子生 物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，反向基因操作系統(tǒng)的誕生與不斷完善，使得人們定向改造流感病毒、 利用流感病毒為人類服務(wù)成為可能。本發(fā)明提出了一種流感病毒抗原更換的平臺(tái)，通過反 向基因操作系統(tǒng)對(duì)流感病毒抗原性進(jìn)行人為改變，在實(shí)現(xiàn)開發(fā)快速應(yīng)變能力的流感疫苗， 以及以流感病毒為載體的基因治療中具有重大的應(yīng)用價(jià)值。反向遺傳技術(shù)在病毒學(xué)研究領(lǐng)域具有重要作用，其中之一就是病毒的拯救和改 造。利用反向遺傳技術(shù)，人們可以根據(jù)需要對(duì)病毒進(jìn)行改造，人為拯救新型病毒，作為病毒 載體或疫苗株等來使用。1989年美國(guó)科學(xué)家首先利用反向基因操作系統(tǒng)并成功獲得經(jīng)人工 重組的流感病毒。1999年Neumann等利用反向基因操作系統(tǒng)在拯救流感病毒方面取得了
3重大突破，采用的全質(zhì)粒系統(tǒng)擺脫了輔助病毒的使用。隨著技術(shù)的進(jìn)步，質(zhì)粒數(shù)量由最起先 的17個(gè)不斷縮減。目前最常用的是8個(gè)質(zhì)粒系統(tǒng)，即RNA聚合酶I/II (Pol I/II)的雙啟 動(dòng)子載體系統(tǒng)。反向基因操作系統(tǒng)已越來越被廣泛應(yīng)用，包括流感病毒的分子生物學(xué)研究、 流感疫苗的研制和流感病毒載體的嘗試等，使得研究開發(fā)新型的流感疫苗成為可能。根據(jù) 流感病毒生物學(xué)特性，在其HA、NA和NS基因都可以攜帶外源基因片段，流感病毒作為基因 載體在基因治療領(lǐng)域亦得到越來越多的關(guān)注?；蛑委熓侵笇⑷说恼；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì) 胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)。基因 治療目前主要是治療那些對(duì)人類健康威脅嚴(yán)重的疾病，包括遺傳病、惡性腫瘤、心血管疾 病、感染性疾病等。然而選擇適合的載體則是治療取得成功的關(guān)鍵因素?；蛑委煶Ｓ幂d 體可分為非病毒載體和病毒載體兩大類，其中非病毒載體轉(zhuǎn)染能力差，動(dòng)物水平研究以及 臨床應(yīng)用都受到巨大限制；而病毒載體具有感染效率高、宿主范圍廣、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)令人 矚目。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體、痘苗病毒載體等 在基因治療上取得了較大進(jìn)展，但是使用病毒載體首次治療后因機(jī)體的免疫保護(hù)作用而使 得重復(fù)使用的療效不理想，這個(gè)科學(xué)難題始終制約著病毒載體在臨床治療上的推廣使用， 目前最為成熟的腺病毒載體也存在這個(gè)問題，尚不能有效解決。而亞型眾多的流感病毒雖 然為疫苗研發(fā)帶來了巨大困難，但是在基因治療過程中為病毒載體的重復(fù)使用提供了有利 條件。流感病毒載體通過抗原的更換，再次使用時(shí)逃避免疫系統(tǒng)的追蹤，從而有望能有效解 決病毒載體在重復(fù)使用效果不理想這一難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種甲型流感病毒抗原決定區(qū)更換 方法，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了不同亞型病毒之間以及同一亞型不同毒株之間的抗原區(qū)整體替換或部 分替換，為流感減毒性活疫苗和流感病毒載體在基因治療中的應(yīng)用提供有效的抗原性轉(zhuǎn)換 技術(shù)平臺(tái)。本發(fā)明中所涉及的裝載流感病毒抗原區(qū)序列的轉(zhuǎn)錄載體為pPolI，全長(zhǎng)HA基因 插入到pPolI兩個(gè)BsmBI限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)之間。插入的HA基因片段通過序列分析 以及核苷酸定點(diǎn)突變，設(shè)定若干限制性酶切位點(diǎn)(這些酶切位點(diǎn)不存在于載體骨架上)，在 氨基酸序列上，將抗原區(qū)分為若干個(gè)部分，適用于抗原決定區(qū)序列的更換。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種甲型流感病毒抗原決定區(qū)更換方法，該方法包括以下步驟(1)從病毒培養(yǎng)液中克隆獲得流感病毒全長(zhǎng)血凝素基因，該血凝素基因兩端包含 完整的非翻譯區(qū)序列，并插入到轉(zhuǎn)錄載體PPolI中，構(gòu)建出含有血凝素基因的重組轉(zhuǎn)錄載 體，作為反向基因操作系統(tǒng)的重組質(zhì)粒之一。(2)在HA基因序列上選擇合適位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建出新的限制性酶切位點(diǎn)， 適用于抗原決定區(qū)的更換。(3)不同抗原性流感病毒之間HA基因抗原決定區(qū)序列的相互更換所述的抗原決 定區(qū)序列相互更換包含兩個(gè)內(nèi)容，一個(gè)是抗原決定區(qū)序列的整體更換，或者是整條HA基因 的更換；一個(gè)是抗原決定區(qū)序列的部分更換。更換可以在同一亞型不同毒株的對(duì)應(yīng)序列之 間進(jìn)行，也可以在不同亞型不同毒株的對(duì)應(yīng)序列之間進(jìn)行。
(4)HA基因抗原決定區(qū)序列更換后重組病毒的拯救利用上述已進(jìn)行過HA基因抗 原區(qū)DNA序列更換的重組質(zhì)粒，通過8質(zhì)粒的反向基因操作系統(tǒng)，共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，并用 MDCK細(xì)胞增殖，拯救出抗原更換的重組流感病毒。本發(fā)明的有益效果是，1.減毒性流感病毒活疫苗候選株的快速構(gòu)建一方面，通過上述抗原更換平臺(tái)，可以將高致病性毒株的抗原更換為低致病性毒 株的抗原，對(duì)病毒株進(jìn)行減毒；另一方面，通過上述抗原更換平臺(tái)，可以有目的地改變流感 病毒株的抗原性，面對(duì)突發(fā)的流感疫情，將病原體的抗原決定區(qū)更換到原有的溫度敏感性 減毒活疫苗上，使得重組病毒一方面保留低毒特征，一方面具有與病原體相似的抗原性，對(duì) 生產(chǎn)具有快速應(yīng)變能力的減毒活疫苗具有重大意義。2.解決病毒載體不能重復(fù)使用的瓶頸問題基因治療在未來攻克惡性腫瘤、遺傳病等多種疑難病癥方面具有非常廣闊的應(yīng)用 前景。病毒侵染人體細(xì)胞時(shí)能將自身的基因組攜帶到細(xì)胞內(nèi)，并利用人體細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)完成 自身繁殖，最終導(dǎo)致人類疾病。利用這一特性，去掉病毒基因組中與致病相關(guān)的基因，保留 其攜帶基因組進(jìn)入人體細(xì)胞的功能，再組裝上理想的外源基因，即成為一種病毒載體。病 毒載體具有感染效率高、宿主范圍廣、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)令人矚目，在基因治療上具有獨(dú)特優(yōu) 勢(shì)。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體、痘苗病毒載體等在 基因治療上取得了較大進(jìn)展，但是使用病毒載體首次治療后因機(jī)體的免疫保護(hù)作用而使得 重復(fù)使用的療效不理想，這個(gè)科學(xué)難題始終制約著病毒載體在臨床治療上的推廣使用。目 前研究最為成熟的腺病毒載體雖然已經(jīng)在臨床上開展了諸多工作，但是始終無法有效突破 在同一個(gè)體上多次使用效果不佳這一困境。而流感病毒的抗原多樣，多個(gè)亞型之間免疫交 叉反應(yīng)弱這一特點(diǎn)，為解決這一難題帶來希望。通過本發(fā)明可以對(duì)流感病毒進(jìn)行有目的的 抗原更換，構(gòu)建出一系列抗原多樣的流感病毒載體系統(tǒng)，在重復(fù)使用時(shí)利用不同抗原性的 流感病毒載體進(jìn)行多次治療，逃避免疫系統(tǒng)的追蹤，從而能有效解決病毒載體在重復(fù)使用 效果不理想這一難題。


圖1為重組質(zhì)粒pPolI/WSN-HA/Xba82/Hl的PCR鑒定圖，圖中，從左至右排列分別 是:M. DL2000 ；1.全長(zhǎng)HA基因的PCR產(chǎn)物；2. Xbal和SacI酶切位點(diǎn)之間DNA片段的PCR產(chǎn) 物；3. SacI和Ncol酶切位點(diǎn)之間DNA片段的PCR產(chǎn)物；4. Ncol和EcoRI酶切位點(diǎn)之間DNA 片段的PCR產(chǎn)物；M. DL2000。圖2為重組質(zhì)粒pPolI/WSN-HA/Xba82/Hl的酶切鑒定圖，圖中，從左至右排列分 別是:M. DL2000 ； 1.pPolI/WSN-HA/Xba82/Hl ；2.pPolI/WSN-HA/Xba82/Hl 的 Nhel 酶切； 3. pPolI/WSN-HA/Xba82/Hl 的 Xbal 和 SacI 雙酶切；4. pPolI/WSN-HA/Xba82/Hl 的 SacI 和 Ncol 雙酶切；5. pPolI/WSN-HA/Xba82/Hl 的 Ncol 和 EcoRI 雙酶切；M. DL2000。圖3為重組質(zhì)粒pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3的PCR鑒定圖，圖中，從左至右排列 分別是M. 200bp DNA Ladder ；M. lkb DNA Ladder ； 1.全長(zhǎng) HA 基因的 PCR 產(chǎn)物；2. PstI 和 HindHI酶切位點(diǎn)之間DNA片段的PCR產(chǎn)物；3. HindHI和Xbal酶切位點(diǎn)之間DNA片段的 PCR產(chǎn)物；4. Xbal和Nsil酶切位點(diǎn)之間DNA片段的PCR產(chǎn)物；5. Nsil和SphI酶切位點(diǎn)之間DNA片段的PCR產(chǎn)物；6. SphI和Xhol酶切位點(diǎn)之間DNA片段的PCR產(chǎn)物。圖4為重組質(zhì)粒pP0lI/MemphiS-HA/PSt35/H3的酶切鑒定圖，圖中，從左至右排 列分別是1. pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3 ；2. pPolI/Memphis_HA/Pst35/H3 的 Nhel 酶切； 3. pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3 的 PstI 和 Hindlll 雙酶切；4. pPolI/Memphis_HA/Pst35/ H3 的 Hindlll 和 Xbal 雙酶切；5. pPolI/Memphis_HA/Pst35/H3 的 Xbal 和 Nsil 雙酶切； 6. pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3 的 Nsil 和 SphI 雙切；7. pPolI/Memphis_HA/Pst35/H3 的 SphI 和 Xhol 雙酶切；M. 200bp DNA Ladder ；M. lkb DNA Ladder。圖5為重組質(zhì)粒pPolI/HK312-HA/Xho68/H5的PCR鑒定圖，圖中，從左至右排列分 別是M. 200bp DNA Ladder ； 1.全長(zhǎng)HA基因的PCR產(chǎn)物；2. Xhol和SacI酶切位點(diǎn)之間DNA 片段的PCR產(chǎn)物；3. SacI和BamHI酶切位點(diǎn)之間DNA片段的PCR產(chǎn)物；4. BamHI和SphI酶切 位點(diǎn)之間DNA片段的PCR產(chǎn)物；5. SphI和AfIII酶切位點(diǎn)之間DNA片段的PCR產(chǎn)物；M. lkb DNA Ladder。圖6為重組質(zhì)粒pPolI/HK312-HA/Xho68/H5的酶切鑒定圖，圖中，從左至右排列分 別是1. pPo11/HK312-HA/Xho68/H52. pPo11/HK312-HA/Xho68/H5 的 Nhel 酶切；3.pPolI/ HK312-HA/Xho68/H5 的 Xhol 和 SacI 雙酶切；4. pPo 11/HK312-HA/Xho68/H5 的 SacI 和 BamHI 雙酶切；5. pPo 11/HK312-HA/Xho68/H5 的 BamHI 和 SphI 雙酶切；6. pPo 11/HK312-HA/Xho68/ H5 的 SphI 和 Aflll 雙酶切；M. 200bp DNA Ladder ；M. lkb DNA Ladder。
具體實(shí)施例方式

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明甲型流感病毒抗原決定區(qū)更換方法，包括以下步驟1.從病毒培養(yǎng)液中克隆獲得流感病毒全長(zhǎng)血凝素基因，血凝素基因兩端包含完整 的非翻譯區(qū)序列，并插入到轉(zhuǎn)錄載體pHH21(又稱為pPolI)中，構(gòu)建出含有血凝素基因的重 組轉(zhuǎn)錄載體，作為反向基因操作系統(tǒng)的重組質(zhì)粒之一。(1) HI亞型流感病毒以HI亞型流感病毒株A/WSN/1933 (H1N1)為材料，RT-PCR方法獲得兩端含有完整 非翻譯區(qū)的全長(zhǎng)HA基因片段，克隆到所述的轉(zhuǎn)錄載體pPolI的兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)BsmBI 之間，該重組質(zhì)粒命名為pPolI/WSN-HA/Hl。(2) H3亞型流感病毒以H3亞型流感病毒株A/Memphis/1/1971 (H3N2)為材料，RT-PCR方法獲得兩端含 有完整非翻譯區(qū)的全長(zhǎng)HA基因片段，克隆到所述的轉(zhuǎn)錄載體pPolI的兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn) BsmBI之間，該重組質(zhì)粒命名為pPolI/Memphis-HA/H3。(3) H5亞型流感病毒以H5亞型流感病毒株A/duck/HK/312/78 (H5N3)為材料，RT-PCR方法獲得兩端含 有完整非翻譯區(qū)的全長(zhǎng)HA基因片段，克隆到所述的轉(zhuǎn)錄載體pPolI的兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn) BsmBI之間，該重組質(zhì)粒命名為pPolI/HK312-HA/H5。2.在HA基因序列上選擇合適位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建出新的限制性酶切位點(diǎn)，適 用于抗原決定區(qū)的更換。(1). HI亞型流感病毒
對(duì)上述的重組質(zhì)粒pPolI/WSN-HA/Hl的HA基因序列進(jìn)行核苷酸定點(diǎn)突變，同時(shí)利 用原有的部分限制性酶切位點(diǎn)，構(gòu)建出HA基因的82位上有Xbal、124位上有Sacl、267位 上有NcoI、412位上有EcoRI酶切位點(diǎn)的重組質(zhì)粒，命名為pPo 11/WSN-HA/Xba82/Hl，適用于 抗原決定區(qū)的更換。上述重組質(zhì)粒pPolI/WSN-HA/Xba82/Hl的Xbal和SacI酶切位點(diǎn)之間 相距126個(gè)核苷酸；SacI和Ncol酶切位點(diǎn)之間相距429個(gè)核苷酸；Ncol和EcoRI酶切位點(diǎn) 之間相距435個(gè)核苷酸(圖1、圖2)。(2) H3亞型流感病毒對(duì)上述的重組質(zhì)粒pP0lI/MemphiS-HA/H3的HA基因序列進(jìn)行核苷酸定點(diǎn)突變，同 時(shí)利用原有的部分限制性酶切位點(diǎn)，構(gòu)建出HA基因的35位上有PstI、109位上有Hindlll、 235位上有Xbal、298位上有Nsil、321位上有Sphl、425位上有Xhol酶切位點(diǎn)的重組質(zhì) 粒，命名為pPolI/Memphis-HA/Pst35/H3，適用于抗原決定區(qū)的更換。上述重組質(zhì)粒pPolI/ Memphis-HA/Pst35/H3的PstI和Hindlll酶切位點(diǎn)之間相距293個(gè)核苷酸；Hindlll和 Xbal酶切位點(diǎn)之間相距378個(gè)核苷酸；Xbal和Nsil酶切位點(diǎn)之間相距267個(gè)核苷酸；Nsil 和SphI酶切位點(diǎn)之間相距69個(gè)核苷酸；SphI和Xhol酶切位點(diǎn)之間相距312個(gè)核苷酸(圖 3、圖 4)。(3) H5亞型流感病毒對(duì)上述的重組質(zhì)粒pPolI/HK312-HA/H5的HA基因序列進(jìn)行核苷酸定點(diǎn)突變，同時(shí) 利用原有的部分限制性酶切位點(diǎn)，構(gòu)建出HA基因的68位上有Xhol、149位上有SacI、193 位上有BamHI、306位上有Sphl、468位上有Aflll等酶切位點(diǎn)的重組質(zhì)粒，命名為pPolI/ HK312-HA/Xho68/H5，適用于抗原決定區(qū)的更換。上述重組質(zhì)粒pPo 11/HK312-HA/Xho68/H5 的Xhol和SacI酶切位點(diǎn)之間相距243個(gè)核苷酸；SacI和BamHI酶切位點(diǎn)之間相距132個(gè) 核苷酸；BamHI和SphI酶切位點(diǎn)之間相距339個(gè)核苷酸；SphI和Aflll酶切位點(diǎn)之間相距 486個(gè)核苷酸(圖5、圖6)。3.不同抗原性流感病毒之間HA基因抗原決定區(qū)序列的相互更換所述的抗原決定區(qū)序列相互更換包含兩個(gè)內(nèi)容，一個(gè)是抗原決定區(qū)序列的整體更 換，或者是整條HA基因的更換；一個(gè)是抗原決定區(qū)序列的部分更換。更換可以在同一亞型 不同毒株的對(duì)應(yīng)序列之間進(jìn)行，也可以在不同亞型不同毒株的對(duì)應(yīng)序列之間進(jìn)行。下面以高致病性病毒株A/Vietnam/1203/04(H5m)的抗原片段替換到低致病性 流感病毒 A/duck/HK/312/78 (H5N3)為例。(1).流感病毒HA基因抗原決定區(qū)序列的整體更換當(dāng)進(jìn)行整條基因更換時(shí)，將上述的重組質(zhì)粒pPolI/HK312-HA/Xho68/H5中HA基因 片段切除，插入A/Vietnam/1203/04(H5m)毒株的HA基因片段的相對(duì)應(yīng)序列，使得新構(gòu)建 的重組質(zhì)粒中包含的HA基因完全來源于A/Vietnam/1203/04 (H5N1)毒株，起到完全更換的 效果。(2).流感病毒HA基因抗原決定區(qū)序列的部分更換當(dāng)進(jìn)行抗原區(qū)部分更換時(shí)，則在上述重組質(zhì)粒PPolI/HK312-HA/Xho68/H5的 Xhol、SacI、BamHI、SphI、Aflll酶切位點(diǎn)中，根據(jù)所需要替換的抗原區(qū)大小及位置選擇 合適的兩個(gè)酶切位點(diǎn)。如所需要更換的抗原區(qū)在酶切位點(diǎn)SacI和SphI之間，則可采 用PCR擴(kuò)增或酶切方法得到A/Vietnam/1203/04 (H5W)毒株HA基因相應(yīng)區(qū)段的DNA片
7段，插入到上述的重組質(zhì)粒pPo 11/HK312-HA/Xho68/H5中，替代原有相對(duì)應(yīng)的基因序列， 使得新構(gòu)建的重組質(zhì)粒HA基因SacI和SphI酶切位點(diǎn)之間的DNA序列來源于毒株A/ Vietnam/1203/04 (H5N1)，起到部分更換的效果。采用上述整體更換和部分更換方法，可以對(duì)任意兩個(gè)同一亞型或不同亞型的流感 病毒株之間進(jìn)行抗原決定區(qū)的相互替換。4. HA基因抗原決定區(qū)序列更換后重組病毒的拯救利用上述已進(jìn)行過HA基因抗原區(qū)DNA序列更換的重組質(zhì)粒，通過8質(zhì)粒的反向基 因操作系統(tǒng)，共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，并用MDCK細(xì)胞增殖，拯救出抗原更換的重組流感病毒。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。但這些實(shí)施例不得理解為任何意義 上對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1血凝素基因的克隆在生物安全柜中，按Initrogen公司說明書提供的方法用Trizol提取病毒RNA， 以V13為逆轉(zhuǎn)錄引物，通過反轉(zhuǎn)錄酶MMLV合成病毒cDNA。并以上述的病毒cDNA為模板， 通過V12和V13兩條引物PCR擴(kuò)增獲得兩端含有完整非翻譯區(qū)的全長(zhǎng)HA基因片段。再以 此全長(zhǎng)HA基因片段為模板，通過5BmHA和3BmHA兩條引物擴(kuò)增得到HA全長(zhǎng)基因，同時(shí)在基 因的兩端各自引入一個(gè)BsmBI限制性酶切位點(diǎn)。具體就是用于擴(kuò)增HI亞型流感病毒(A/ WSN/1933)全長(zhǎng)HA基因的引物是V12和V13，再以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，通過引物5BmHA和3BmHA 在HA基因兩端各引入一個(gè)BsmBI限制性酶切位點(diǎn)，用于克隆到轉(zhuǎn)錄載體pPolI中；用于擴(kuò) 增H3亞型流感病毒(A/Memphis/1/1971)全長(zhǎng)HA基因的引物是V12和V13，再以擴(kuò)增產(chǎn)物 為模板，通過引物5BmHA和3BmHA在HA基因兩端各引入一個(gè)BsmBI限制性酶切位點(diǎn)，用于 克隆到轉(zhuǎn)錄載體pPolI中；用于擴(kuò)增H5亞型流感病毒(A/duck/HK/312/78)全長(zhǎng)HA基因的 引物是V12和V13，再以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，通過引物5BmHA和3BmHA在HA基因兩端各引入一 個(gè)BsmBI限制性酶切位點(diǎn)，用于克隆到轉(zhuǎn)錄載體pPolI中。上述PCR的引物序列分別為V12 :AGCAAAAGCAGG ；V13 :AGTAGAAACAAGG ；5BmHA TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG3BmHA :ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT。實(shí)施例2全長(zhǎng)HA基因克隆到轉(zhuǎn)錄載體pPolI將實(shí)施例1所述的兩端都具有BsmBI限制性酶切位點(diǎn)的全長(zhǎng)HA基因用BsmBI酶 切，酶切產(chǎn)物純化后與BsmBI酶切的轉(zhuǎn)錄載體pPolI連接，篩選得到重組質(zhì)粒后并進(jìn)行DNA 序列測(cè)定。在pPolI中插入HI亞型A/WSN/1933(H1N1)毒株HA基因的重組質(zhì)粒命名為 pPolI/WSN-HA/Hl ；在 pPolI 中插入 H3 亞型 A/Memphis/1/1971 (H3N2)毒株 HA 基因的重組 質(zhì)粒命名為 pPolI/Memphis-HA/H3 ；在 pPolI 中插入 H5 亞型 A/duck/HK/312/78 (H5N3)毒 株HA基因的重組質(zhì)粒命名為pPo 11/HK312-HA/H5。實(shí)施例3定點(diǎn)突變，引入新的酶切位點(diǎn)
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通過定點(diǎn)突變的方法，在實(shí)施例2所述的重組質(zhì)粒中引入新的酶切位點(diǎn)，用于抗 原更換。以在所述的重組質(zhì)粒pPolI/WSN/Hl中引入Xbal限制性酶切位點(diǎn)為例，具體步驟 如下以 pPolI/WSN/Hl 為模板，以 HlXbaHA82F 和 HlXbaHA82R 為點(diǎn)突變引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性3min ；94°C變性45s、55°C退火45s、72°C延伸6min，共18個(gè) 循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用限制性內(nèi)切酶Dpnl在37°C消化lh，乙醇/ 醋酸鈉沉淀后溶于20 yl雙蒸水中，取1 yl轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，篩選突變克隆并進(jìn)行序列 測(cè)定，證實(shí)引入Xbal酶切位點(diǎn)。經(jīng)過點(diǎn)突變的HA基因含有Xbal、SacI、Ncol、EcoRI酶切 位點(diǎn)(圖2)。以H3Pst35HAF和H3Pst35HAR為點(diǎn)突變引物，應(yīng)用上述方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，在所述 的重組質(zhì)粒pPolI/MemphiS-HA/H3血凝素基因的35位引入PstI酶切位點(diǎn)，經(jīng)過定點(diǎn)突變 的HA基因含有限制性酶切位點(diǎn)PstI、HindIII、XbaI、NsiI、SphI、XhoI。以H5XhoHA68F和H5XhoHA68R為點(diǎn)突變引物，應(yīng)用上述方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，在所述 的重組質(zhì)粒pPolI/HK312-HA/H5血凝素基因的68位引入Xho I酶切位點(diǎn)，經(jīng)過定點(diǎn)突變的 HA基因含有限制性酶切位點(diǎn)Xhol、SacI、BamHI、SphI、AfIII。上述定點(diǎn)突變的引物分別是HlXbaHA82F GGGAAATCTAGAATGCGAC ；HlXbaHA82R :GTCGCATTCTAGATTTCCC ；H3Pst35HAF CATCCTGCAGTGCCAAAC ；H3Pst35HAR :GTTTGGCACTGCAGGATG ；H5XhoHA68F CCTCTCATCTCGAGGGATTG ；H5XhoHA68R CAATCCCTCGAGATGAGAGG實(shí)施例4抗原更換——全基因更換將高致病性病毒株A/Vietnam/1203/04 (H5N1)的HA基因整體更換到低致病性毒 株 A/duck/HK/312/78 (H5N3)中。對(duì)于流感病毒株 A/Vietnam/1203/04 (H5N1)，按照實(shí)施例 1所述的血凝素基因克隆方法，擴(kuò)增得到兩端各自有一個(gè)BsmBI限制性酶切位點(diǎn)的完整HA 基因(包含5’端和3’端的非翻譯區(qū))，BsmBI酶切后并進(jìn)行純化。同時(shí)用BsmBI對(duì)所述重 組質(zhì)粒pPolI/HK312-HA/H5進(jìn)行酶切，去除來源于A/duck/HK/312/78 (H5N3)的HA基因片 段后并進(jìn)行純化。兩者連接后篩選重組克隆，獲得的重組質(zhì)粒(命名為pPolI/VN1203-HA/ H5)的HA基因完全來源于A/Vietnam/1203/04 (H5N1)，HA基因得到整體更換。實(shí)施例5抗原更換——部分抗原區(qū)更換將高致病性流感病毒A/Vietnam/1203/04 (H5W)的部分抗原片段替換到低致病 性流感病毒A/duck/HK/312/78 (H5N3)中，以SacI和SphI兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間抗原區(qū)序列的 更換為例。通過序列分析，A/Vietnam/1203/04(H5N1)和 A/duck/HK/312/78 (H5N3)兩個(gè)病 毒株的相應(yīng)位置都具有SacI和SphI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。通過PCR擴(kuò)增或雙酶切方法獲得A/ Vietnam/1203/04 (H5N1)病毒株HA基因中位于SacI和SphI兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間的DNA片段，并進(jìn)行純化。同時(shí)用SacI和SphI雙酶切重組質(zhì)粒pPolI/HK312-HA/Xho68/H5，去除SacI 和SphI位點(diǎn)之間的DNA片段后進(jìn)行純化。將上述兩個(gè)經(jīng)純化的DNA片段進(jìn)行連接，篩選重 組克隆。獲得的重組質(zhì)粒中，HA基因上SacI和SphI位點(diǎn)之間的基因序列來源于病毒株A/ Vietnam/1203/04 (H5N1)，HA基因的抗原區(qū)序列得到部分更換。實(shí)施例6拯救獲得HA基因抗原更換的重組病毒流感病毒拯救以8質(zhì)粒反向基因操作系統(tǒng)為基礎(chǔ)，共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，并用 MDCK 細(xì)胞增殖。8 個(gè)質(zhì)粒分別為 pPol-II/I-Ann60-PB2、pPol-II/I-Ann60_PBl、pPol-II/ I-Ann60-PA、pPol-II/I-Ann60-NP、pPol-II/I-Ann60-HA、pPol-II/I-Ann60-NA、pPol-II/ I-Arm60-M、pPol-II/I-Arm60-NS(參見國(guó)際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志的第33卷第5期，“改 進(jìn)型反向基因操作系統(tǒng)的構(gòu)建和流感病毒變異株的選育”一文)。若要獲得HA基因經(jīng)過抗原更換的重組流感病毒，則采用上述反向基因操作系統(tǒng)， 其中質(zhì)粒pPOl-II/I-Arm60-HA可根據(jù)需要進(jìn)行選擇性替換。例如要將重組病毒的HA完 全更換為毒株 A/Vietnam/1203/04(H5m)的 HA，則只要將 pPol-II/I-Ann60-HA 替換成 pPolI/VN1203-HA/H5 即可。
權(quán)利要求
一種甲型流感病毒抗原決定區(qū)更換方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)從病毒培養(yǎng)液中克隆獲得流感病毒全長(zhǎng)血凝素基因，該血凝素基因兩端包含完整的非翻譯區(qū)序列，并插入到轉(zhuǎn)錄載體pHH21(又稱為pPolI)中，構(gòu)建出含有血凝素基因的重組轉(zhuǎn)錄載體，作為反向基因操作系統(tǒng)的重組質(zhì)粒之一。(2)在HA基因序列上選擇合適位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建出新的限制性酶切位點(diǎn)，適用于抗原決定區(qū)的更換。(3)不同抗原性流感病毒之間HA基因抗原決定區(qū)序列的相互更換。(4)HA基因抗原決定區(qū)序列更換后重組病毒的拯救。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述甲型流感病毒抗原決定區(qū)更換方法，其特征在于所述步驟(3) 中，所述的抗原決定區(qū)序列相互更換包含兩個(gè)內(nèi)容，一個(gè)是抗原決定區(qū)序列的整體更換，或 者是整條HA基因的更換；一個(gè)是抗原決定區(qū)序列的部分更換。更換可以在同一亞型不同毒 株的對(duì)應(yīng)序列之間進(jìn)行，也可以在不同亞型不同毒株的對(duì)應(yīng)序列之間進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述甲型流感病毒抗原決定區(qū)更換方法，其特征在于所述步 驟(4)具體為利用上述已進(jìn)行過HA基因抗原區(qū)DNA序列更換的重組質(zhì)粒，通過8質(zhì)粒的 反向基因操作系統(tǒng)，共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，并用MDCK細(xì)胞增殖，拯救出抗原更換的重組流感 病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開一種甲型流感病毒抗原決定區(qū)更換方法。本發(fā)明針對(duì)抗原決定區(qū)的位置，利用和設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)同一亞型或不同亞型流感病毒株相互之間抗原決定區(qū)序列的整體或部分更換，并利用8質(zhì)粒反向基因操作系統(tǒng)拯救出抗原性經(jīng)過人為定向改變的重組流感病毒，在流感病毒減毒性活疫苗的快速制備和病毒載體在基因治療中多次重復(fù)使用方面具有重大的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N7/01GK101857872SQ201010140628
公開日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2010年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月6日
發(fā)明者沃恩康, 郭潮潭 申請(qǐng)人:浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院