專利名稱：作為線蟲變應(yīng)原的天冬氨酰蛋白酶抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的變應(yīng)原。本發(fā)明廣泛涉及新的線蟲變應(yīng)原(多肽)和相關(guān)的氨基酸和核苷酸序列包括其功能片段和變體。本發(fā)明廣泛涉及從毛圓線蟲總科(Trichostrongyloidea)的線蟲獲得的變應(yīng)原。特別是本發(fā)明涉及上述分子在鑒定天然抵抗寄生線蟲的動(dòng)物中的用途，從而輔助選擇性繁殖先天更易于(disposed)發(fā)展對(duì)線蟲感染的免疫抗性的動(dòng)物，所述動(dòng)物特別是但不是僅限于綿羊(sheep)和牛(cattle)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明的分子最優(yōu)選但不是僅限于來自環(huán)紋奧斯特線蟲(Ostertagiacircumcincta)(環(huán)紋背帶線蟲(Teladorsagia circumcincta))和蛇形毛圓線蟲(Trichostrongylus colubriformis)，并且它們被用來減弱這些線蟲或類似線蟲對(duì)本文所討論的動(dòng)物的影響。為參考方便起見，本發(fā)明的背景僅描述與蛇形毛圓線蟲感染相關(guān)的內(nèi)容。然而，那些本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解此類描述對(duì)毛圓線蟲總科的大多數(shù)線蟲也是普遍適用的。
蛇形毛圓線蟲是感染綿羊小腸的線蟲寄生蟲，因此對(duì)新西蘭和世界上許多其他國家都有顯著的經(jīng)濟(jì)學(xué)重要性。這些寄生蟲生活周期簡(jiǎn)單，其包括在牧場(chǎng)上的自由生活階段(free-living stage)(卵到感染性幼蟲，L3)，和被攝食后在宿主胃腸道歷經(jīng)L4-L5-成蟲幾個(gè)階段的發(fā)育。它們不具有組織移行期(tissue migratory phase)。蛇形毛圓線蟲(T.colubriformis)存在于十二指腸和小腸絨毛表面沖刷的(eroded)覆蓋粘膜的通道(mucus covered tunnel)中。
現(xiàn)在控制蛇形毛圓線蟲和其他感染綿羊的線蟲的唯一有效途徑是使用驅(qū)腸蟲劑(anthelmintics)。
綿羊在反復(fù)的天然感染之后可以發(fā)展對(duì)蛇形毛圓線蟲的自然免疫。發(fā)展對(duì)線蟲建群(establishment)的免疫需要至少7周的持續(xù)感染(Dobson等，1990)。因此在過去，有效免疫綿羊是通過兩或三個(gè)截?cái)嗟母腥局芷?，每個(gè)之后用驅(qū)腸蟲劑處理從而在10-14天后去除感染。
然而，常規(guī)驅(qū)腸蟲劑的一個(gè)主要缺陷是線蟲對(duì)廣譜驅(qū)腸蟲劑的抗性現(xiàn)在變得更加廣泛并因此引起了關(guān)注(Waller，1997；Sangster等，1999；Van Wyk等，1999)。
多項(xiàng)研究提示，對(duì)蛇形毛圓線蟲的免疫力包括發(fā)展參與超敏反應(yīng)型事件(hypersensitivity type event)的Th2-型免疫反應(yīng)。這些反應(yīng)包括小腸粘膜中肥大細(xì)胞，球狀白細(xì)胞(globule leucocyte)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量增加。血清IgE水平升高也與對(duì)線蟲感染的免疫力相關(guān)(Shaw等，1998a & b)。在對(duì)線蟲感染的抗性中，寄生蟲-特異性IgE的一個(gè)可能作用是它參與速發(fā)型超敏反應(yīng)，其中特異性IgE在粘膜肥大細(xì)胞上與抗原交聯(lián)促進(jìn)了它們的脫顆粒，這在綿羊中導(dǎo)致了球狀白細(xì)胞的形成。炎性介質(zhì)因此而釋放被認(rèn)為是參與免疫綿羊中寄生蟲排斥的主要機(jī)制。炎性介質(zhì)釋放會(huì)造成腸微環(huán)境惡化(deterioration)從而驅(qū)逐線蟲寄生蟲。所述炎癥反應(yīng)也可使免疫球蛋白滲漏到腸腔，它也會(huì)有助于將線蟲從胃腸道驅(qū)逐。
因此，通過結(jié)合IgE引發(fā)超敏反應(yīng)的抗原(即變應(yīng)原)在診斷性試驗(yàn)中有用，所述試驗(yàn)可用Th2-型超敏免疫反應(yīng)來鑒定免疫動(dòng)物。因此，所述抗原在產(chǎn)生抵抗線蟲的動(dòng)物的選擇性繁殖(breeding)計(jì)劃中有用。
蛇形毛圓線蟲的新的主要變應(yīng)原，Tco-Aspin，已經(jīng)被發(fā)明者在2-D電泳凝膠上鑒定分子量為31kDa，pI5.1，并且確定了其核苷酸和多肽序列。它與若干鑒定為線蟲天冬氨酰蛋白酶抑制劑的蛋白具有一定程度的同源性。數(shù)名研究者已經(jīng)從旋盤尾絲蟲(Onchocerca volvulus)克隆了天冬氨酰蛋白酶抑制劑樣蛋白。Ov33-3(Lucius，等，1988)，在96％的盤尾絲蟲病(onchocerciasis)病人中識(shí)別的免疫顯性抗原；Oc3.6(Chandrashekar，等，1991)；OvD5B(CelineNkenfou，Thesis，″Molecular Cloning of Genes Coding Antigens Specific ForOnchocerca volvulusEvaluation of Expressed Proteins For Use In TheDiagnosis Of Onchocerciasis″University of Cameroon(1993)。直向同源物(Ortholog)已經(jīng)在馬來布魯線蟲(Brugia malayi)(Bm33)(Dissanayake 1993)，Acanthocheilonema viteae(Av33)(Willenbucher等，1993)，犬惡絲蟲(Dirofilariaimmitis)(DiT33)(Maja等，1994，F(xiàn)rank等，1998)，Parelaphostrongylus tenuis(Ptpi)(Duffy等，2002)和奧氏奧斯特線蟲(Ostertagia ostertagi)(Claerebout等，2002)中發(fā)現(xiàn)。
這其中的一些已經(jīng)被成功用于診斷重要的人絲蟲感染包括旋盤尾絲蟲(O.volvulus)(Chandrashekar，等，1991&1996)和馬來布魯線蟲(B.malayi)(Chandrashekar等，1994；Dissanayake等，1993)。
然而，現(xiàn)在仍有需要來鑒定動(dòng)物(特別是綿羊和牛)中線蟲感染的變應(yīng)原，并且其可被用于診斷那些天生易于發(fā)展對(duì)線蟲感染的免疫抗性的動(dòng)物。因此這些變應(yīng)原的存在可能在選擇性繁殖先天更易于發(fā)展免疫抗性的動(dòng)物的計(jì)劃中有用。
本發(fā)明一個(gè)目的是解決上述問題或至少給公眾提供可用的選項(xiàng)。
本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)可以從后文的舉例說明中明顯看出。
所有本說明書引用的參考文獻(xiàn)，包括專利或?qū)＠暾?qǐng)都在此引入作為參考。不承認(rèn)任何參考文獻(xiàn)構(gòu)成了現(xiàn)有技術(shù)。對(duì)參考文件的討論闡述了它們作者的所持見解，本文申請(qǐng)人保留質(zhì)疑所引用文獻(xiàn)的準(zhǔn)確性和恰當(dāng)性的權(quán)利?？汕宄斫獗M管在此參考了數(shù)篇現(xiàn)有技術(shù)的發(fā)表文獻(xiàn)，此參考關(guān)系不承認(rèn)任何這些文獻(xiàn)在新西蘭和任何其他國家構(gòu)成了本領(lǐng)域公知普通技術(shù)。
發(fā)明概述本發(fā)明廣泛涉及新的線蟲變應(yīng)原(多肽)和相關(guān)的氨基酸和核苷酸序列包括其功能片段和變體，它們用于鑒定能夠變成天然抵抗線蟲的動(dòng)物。特別是本發(fā)明涉及這些分子在選擇性繁殖能夠變成天然抵抗線蟲感染的動(dòng)物中的輔助用途。更特別的是，本發(fā)明針對(duì)核酸分子和多肽在鑒定先天更易于發(fā)展對(duì)線蟲的免疫抗性的動(dòng)物中的用途，所述核酸分子和多肽與如下的天冬氨酰蛋白酶抑制劑相同或是其功能變體蛇形毛圓線蟲的(Tco-Aspin)；和/或環(huán)紋奧斯特線蟲的(Oc-Aspin)；和/或捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的(Hc-Aspin)。
本發(fā)明發(fā)明者已經(jīng)用Western印跡技術(shù)用從多種免疫動(dòng)物純化的IgE鑒定了蛇形毛圓線蟲，環(huán)紋奧斯特線蟲(O.circumcinta)和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(H.contortus)的若干IgE結(jié)合抗原(變應(yīng)原)。用2-D電泳分離并用質(zhì)譜法鑒定了所述靶變應(yīng)原。從有線蟲感染歷史的動(dòng)物血清制備了重組變應(yīng)原蛋白并試驗(yàn)了它們結(jié)合IgE的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明第一方面提供了分離的多肽，其包含a)SEQ ID NO.1，3，5或7任一的氨基酸序列；或
b)上述a)的多肽的功能片段或變體，其中所述片段或變體在動(dòng)物中激發(fā)了體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)，所述反應(yīng)的特征類似如上a)所述的多肽所產(chǎn)生的那些。
本發(fā)明第二方面提供了基本如上所述的分離的多肽，其中所述功能片段或變體摻入了所述多肽的B細(xì)胞或T細(xì)胞表位。
通常所述多肽可源自毛圓線蟲總科的線蟲寄生蟲。然而，也可理解所述多肽也可被人工合成例如重組合成。
所述多肽和/或核酸分子可選自下列屬的線蟲寄生蟲毛圓線蟲屬，古柏線蟲屬(Cooperia)，網(wǎng)尾線蟲屬(Dictyocaulus)，血矛線蟲屬(Haemonchus)，奧斯特線蟲屬(Ostertagia)或背帶線蟲屬(Teladorsagia)。
所述線蟲寄生蟲優(yōu)選可以是毛圓線蟲屬或奧斯特線蟲屬，優(yōu)選選自蛇形毛圓線蟲或環(huán)紋奧斯特線蟲(環(huán)紋背帶線蟲)。
本發(fā)明第三方面提供了分離的核酸分子，其中所述分子a)包含SEQ ID NO.2，4，6或8任一的核苷酸序列；b)是a)的分子的功能片段或變體；或c)能在嚴(yán)格條件下與a)或b)的分子雜交；或d)是a)，b)或c)限定的分子的互補(bǔ)體；或e)是對(duì)應(yīng)于a)-d)的任一序列的反義序列。
本發(fā)明第四方面提供了分離的核酸分子，其編碼基本如上所述的多肽。
本發(fā)明第五方面提供了載體或構(gòu)建體，其包含本發(fā)明所述的核酸分子。
本發(fā)明第六方面提供了宿主細(xì)胞，其已經(jīng)用本發(fā)明所述的載體或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明第七方面提供了分離的配體，其結(jié)合本發(fā)明所述的多肽。
本發(fā)明第八方面提供了探針，其能夠在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述的核酸分子雜交。
本發(fā)明第九方面提供了探針，其針對(duì)基本如上所述的多肽。
本發(fā)明第十方面提供了探針，其針對(duì)基本如上所述的配體，并且該配體為在與本發(fā)明所述多肽結(jié)合時(shí)的配體。
本發(fā)明第十一方面提供了確定動(dòng)物對(duì)線蟲感染的免疫狀態(tài)的方法，其特征在于如下步驟a)從所述動(dòng)物獲得血液或血清樣本；
b)制備步驟a)中樣本的IgE富集或IgG耗竭的(depleted)制備物；c)使步驟a)的樣本接觸包含SEQ ID NO.1，3，5或7任一的氨基酸序列或其功能片段或變體的多肽；d)使步驟c)的制備物接觸探針，該探針針對(duì)IgE和所述多肽形成的免疫復(fù)合物；e)檢測(cè)所述探針，通過所述探針的存在與否來鑒定所述動(dòng)物的免疫狀態(tài)。
本發(fā)明第十二方面提供了確定動(dòng)物對(duì)線蟲感染的免疫狀態(tài)的方法，其特征在于如下步驟a)從所述動(dòng)物獲得血液或血清樣本；b)制備步驟a)中樣本的IgE富集或IgG耗竭的制備物；c)使步驟b)的制備物暴露于包含SEQ ID NO.1，3，5或7任一的氨基酸序列或其功能片段或變體的多肽；d)洗滌步驟c)的制備物，以便去除任何未結(jié)合的IgE(即未結(jié)合所述多肽的IgE)；e)用抗IgE的單克隆抗體檢測(cè)所述多肽和IgE在步驟c)形成的免疫復(fù)合物；f)用合適標(biāo)記的抗-抗體檢測(cè)IgE。
優(yōu)選步驟b)中所述血液或血清通過硫酸銨沉淀或親和純化綿羊IgE來富集IgE或使IgG耗竭。然而不僅限于此。
優(yōu)選所述暴露步驟c)可通過將SEQ ID NO.1的多肽包被在微滴板上來進(jìn)行。然而，其他合適的暴露方法也可以。
優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟d)的單克隆抗體可以是小鼠單克隆抗體。然而，也可使用其他動(dòng)物來源的抗體而不偏離本發(fā)明范圍。
優(yōu)選，所述樣本可通過酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)或其他合適類型的試驗(yàn)暴露于多肽。
本發(fā)明第十三方面提供了確定動(dòng)物免疫狀態(tài)的方法，其包含如下步驟a)使所述動(dòng)物皮膚的一部分暴露于本發(fā)明的多肽；b)通過免疫反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)存在與否來確定免疫狀態(tài)。
本發(fā)明第十四方面提供了選擇性繁殖抵抗線蟲感染的動(dòng)物的方法，其特征在于如下步驟
a)確定雄性和雌性動(dòng)物的免疫狀態(tài)；b)選擇易于發(fā)展對(duì)線蟲的免疫抗性的雄性和雌性；c)使用所選擇的動(dòng)物來繁殖抵抗所述感染的后代。
通常，所述動(dòng)物可選自綿羊，山羊，牛和馬。然而，不應(yīng)被視為限于此清單，因?yàn)樗鰟?dòng)物可以是任何易于感染線蟲寄生蟲的哺乳動(dòng)物。
優(yōu)選，所述動(dòng)物可選自牛或綿羊。最優(yōu)選所述動(dòng)物可以是綿羊。
本發(fā)明第十五方面提供了基本如上所述的分離的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO.5的功能片段或變體，其與SEQ ID NO.5至少90％同源。
本發(fā)明第十六方面提供了基本如上所述的分離的多肽，其中所述分子是SEQ ID NO.6的功能片段或變體，其與SEQ ID NO.6至少94％同源。
本發(fā)明第十七方面提供了基本如上所述的分離的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO.1的功能片段或變體，其與SEQ ID NO.1至少基本75％同源。
本發(fā)明第十八方面提供了基本如上所述的分離的多肽，其中所述分子是SEQ ID NO.2的功能片段或變體，其與SEQ ID NO.2至少基本70％同源。
本發(fā)明第十九方面提供了基本如上所述的分離的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO.3的功能片段或變體，其與SEQ ID NO.3至少80％％同源。
本發(fā)明第二十方面提供了基本如上所述的分離的多肽，其中所述分子是SEQID NO.4的功能片段或變體，其與SEQ ID NO.4至少基本70％同源。
本發(fā)明第二十一方面提供了基本如上所述的分離的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO.7的功能片段或變體，其與SEQ ID NO.7至少80％同源。
本發(fā)明第二十二方面提供了基本如上所述的分離的多肽，其中所述分子是SEQ ID NO.8的功能片段或變體，其與SEQ ID NO.8至少75％同源。
可清楚理解，本發(fā)明也包括肽的類似物，其包括但不限于如下1.一或更多個(gè)氨基酸被其對(duì)應(yīng)的D-氨基酸取代的化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道可用標(biāo)準(zhǔn)方法合成retro-inverso氨基酸序列；見例如Chorev和Goodman，1993；2.肽模擬(Peptidomimetic)化合物，其中肽鍵被更抵抗代謝降解的結(jié)構(gòu)取代。見例如Olson等，1993；和3.化合物，其中氨基酸被類似結(jié)構(gòu)取代，例如偕二氨基烷基(gem-diaminoalkyl)基團(tuán)或烷基丙二?；?alkylmalonyl)基團(tuán)，它們有或無修飾的末端或烷基，?；虬啡〈鷣砀淖兯鼈兊碾姾?。
這類備選結(jié)構(gòu)的應(yīng)用可在體內(nèi)提供明顯更長(zhǎng)的半衰期，因?yàn)樗鼈冊(cè)谏項(xiàng)l件下更能抵抗降解。
本領(lǐng)域公知組合合成肽的類似物以及篩選肽和肽類似物的方法(見例如Gallop等，1994；Hogan，1997)。
本說明書中術(shù)語“肽和肽類似物”包括由多個(gè)單元組成的化合物，所述單元具有呈1，2、1，3、1，4或更大取代模式分隔的氨基和羧基末端。這包括20個(gè)天然形成的或“常規(guī)的”L或D構(gòu)型的α-氨基酸，生物合成得到的或通常不在蛋白中發(fā)現(xiàn)的“非常規(guī)的”氨基酸，如4-羥脯氨酸，5-羥賴氨酸，瓜氨酸和鳥氨酸；合成來源的α-氨基酸，如α-甲基丙氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，Cα-和N-烷基化的氨基酸，高半胱氨酸和高絲氨酸；和其他本領(lǐng)域公知的很多。
也包括氨基和羧基功能基團(tuán)分開呈1，3或更大取代模式的化合物，如β-丙氨酸，γ-氨基丁酸，F(xiàn)reidinger內(nèi)酰胺(Freidinger等，1982)，二環(huán)二肽(bicyclicdipeptide)(BTD)(Freidinger等，1982；Nagai和Sato，1985)，氨甲基苯甲酸(Smythe和von Itzstein，1994)和其他本領(lǐng)域公知的。本發(fā)明也可使用抑制素樣(Statine-like)等構(gòu)物(isostere)，羥乙烯(hydroxyethylene)等構(gòu)物，還原型(reduced)酰胺鍵等構(gòu)物，硫代酰胺(thioamide)等構(gòu)物，脲等構(gòu)物，氨基甲酸酯等構(gòu)物，硫醚等構(gòu)物，乙烯基(vinyl)等構(gòu)物和本領(lǐng)域已知的其他酰胺鍵等構(gòu)物。
“常規(guī)”氨基酸是選自如下的L-氨基酸甘氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸，蛋氨酸，精氨酸，賴氨酸，脯氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和組氨酸。這些在本文用它們的常規(guī)三字母或單字母縮寫來表示。
“非常規(guī)”氨基酸包括但不限于選自如下D-氨基酸，高-氨基酸，N-烷基氨基酸，脫氫氨基酸，芳香氨基酸(除了苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸以外)，鄰-，間-或?qū)?氨基苯甲酸，鳥氨酸，瓜氨酸，正亮氨酸，α-谷氨酸，氨基丁酸(Abu)，和α-α雙取代的氨基酸。
本文術(shù)語“多肽”，“肽”和“蛋白”互換使用，其都指包含一或更多氨基酸的鏈的分子。
本文所用術(shù)語“變體”指核苷酸和多肽序列，其中所述核苷酸或氨基酸序列表現(xiàn)出-與包含在序列表中的核苷酸或氨基酸序列至少基本70％，或至少基本75％的同源性；-優(yōu)選表現(xiàn)出與所述序列至少基本80％或85％或更高的同源性；-最優(yōu)選表現(xiàn)出與包含在序列表中的序列基本為選自90-99％的同源性，其可包括與所述序列至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同源性；這是用GAP或BESTFIT(核苷酸和肽)，或BLASTP(肽)或BLASTN(核苷酸)評(píng)估的。所述變體可來自對(duì)天然核苷酸或氨基酸序列的修飾，所述修飾如插入，取代或缺失一或更多核苷酸或氨基酸，或所述變體可以是天然出現(xiàn)的變體。
因此，術(shù)語變體應(yīng)被認(rèn)為包括本文所述的核苷酸序列的變化，其由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性并不改變所編碼的氨基酸(即保守取代)。術(shù)語“變體”也包括同源序列，其與本發(fā)明序列在標(biāo)準(zhǔn)的，但最優(yōu)選在嚴(yán)格的條件下雜交。
為確定同源程度，“嚴(yán)格條件”通?？芍竌)低鹽濃度(即低于1M，優(yōu)選低于500mM，最優(yōu)選低于200mM)；和b)高雜交溫度(即至少30℃，優(yōu)選高于37℃，最優(yōu)選高于50℃)。
然而，因?yàn)殡s交的嚴(yán)格度可被其它因素影響，包括探針的組成和有機(jī)溶劑(organism solvent)的存在，所以上述參數(shù)的組合對(duì)于確定雜交嚴(yán)格度才是重要的。
例如，嚴(yán)格雜交條件可被限定為2×SSC(在65℃)，或并例如標(biāo)準(zhǔn)雜交條件可被限定為6×SCC(在55℃)，只要所述變體總是能夠診斷線蟲感染。當(dāng)需要這類變體時(shí)，可以適當(dāng)改變天然DNA的核苷酸序列。這種改變可受DNA合成或天然DNA的修飾的影響，例如，受位點(diǎn)特異性(site specific)誘變或盒式誘變(cassette mutagenesis)的影響。優(yōu)選，當(dāng)cDNA或基因組DNA的部分需要序列修飾時(shí)，用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行位點(diǎn)特異性引物指導(dǎo)的誘變。
術(shù)語“分離的”指從天然出現(xiàn)所述核酸的細(xì)胞或生物體中分離或純化，從而不含污染序列，其包括用標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)純化的核酸以及用重組技術(shù)，包括PCR技術(shù)制備的核酸，以及化學(xué)合成的那些。優(yōu)選，所述核酸分子來自蛇形毛圓線蟲的基因組DNA或mRNA。
所述核酸分子可以是RNA，cRNA，基因組DNA或cDNA分子，并可以是單鏈或雙鏈的。所述核酸分子也可可選包含一或更多合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基或其組合。
核酸的片斷是比全長(zhǎng)短的核酸部分，至少包含在嚴(yán)格條件下能夠與本發(fā)明核酸分子(或其互補(bǔ)序列)特異性雜交的最小序列，其限定如下。多肽片段是多肽的一部分，其短于全長(zhǎng)但仍保持能診斷線蟲感染的生物功能。本發(fā)明的片段至少具有本發(fā)明核酸或多肽的生物活性中的一種。
本發(fā)明多肽可用多種方法制備。例如，可從天然來源分離，用任何合適的已知技術(shù)合成(如逐步，固相，合成描述見Merryfield(1963)，J.Amer.Chem.Soc.Vol 852149-2156)或優(yōu)選，通過使用DNA技術(shù)來制備。
可根據(jù)要使用的宿主或宿主細(xì)胞來選擇克隆載體?？捎玫妮d體通常具有如下性質(zhì)(a)自主復(fù)制的能力；(b)具有任何具體限制性內(nèi)切核酸酶的、位置合適的單個(gè)靶；并(c)理想地?cái)y帶容易選擇的標(biāo)記物例如抗生素抗性的基因。
具有這些性質(zhì)的兩類主要載體是質(zhì)粒和細(xì)菌病毒(細(xì)菌噬菌體或噬菌體)?，F(xiàn)在優(yōu)選載體包括細(xì)菌噬菌體lambda Uni-ZApTMXR和修飾的質(zhì)粒pBAD18載體，AY2-4。緊密調(diào)控(regulation)，調(diào)節(jié)(modulation)，和高水平表達(dá)是包含阿拉伯糖PBAD啟動(dòng)子的載體的特征(J.Bacteriol.1774121-4130)。
可將本發(fā)明的DNA分子與可復(fù)制的(repliable)表達(dá)載體上的合適控制序列可操作連接來表達(dá)它們。所述控制序列可包括復(fù)制起點(diǎn)，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列及其他。選擇要被包括在表達(dá)載體中的控制序列要依賴于要用來表達(dá)DNA的宿主或宿主細(xì)胞的種類。
通常，真核的、酵母的、昆蟲的或哺乳動(dòng)物的細(xì)胞是可用的宿主。術(shù)語“宿主”也包括質(zhì)粒載體。合適的原核宿主包括大腸桿菌，芽孢桿菌(Bacillusspecies)和多種假單胞菌(species of Pseudomonas)。常用的啟動(dòng)子如β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)啟動(dòng)子系統(tǒng)在本領(lǐng)域公知?？墒褂萌魏闻c所選宿主相容的可得到的啟動(dòng)子系統(tǒng)。酵母中使用的載體也可得并公知。合適的例子是質(zhì)粒的2μ復(fù)制起點(diǎn)質(zhì)粒。
類似地，也公知哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用的載體。此類載體包括如下的公知衍生物SV-40，腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的DNA序列，單純皰疹病毒，和衍生自質(zhì)粒和噬菌體DNA的組合的載體。
本領(lǐng)域公知其他真核表達(dá)載體(例如P.J.Southern和P.Berg，J.Mol.Appl.Genet.1 327-341(1982)；S.Subramani等，Mol.Cell.Biol.1，854-864(1981)；R J.Kaufmann和P.A.Sharp，“Amplification and Expression of SequencesCotransfected with a Modular Dihydrofolate Reducase Complementary DNAGene”，J.Mol.Biol.159，601-621(1982)；R J.Kaufmann和P.A.Sharp，Mol.Cell.Biol.159，601-664(1982)；S.I.Scahill等，“Expressions And Characterization OfThe Product Of A Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese HamsterOvary Cells，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80，4654-4659(1983)；G.Urlaub和L.A.Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77，4216-4220，(1980)。
本發(fā)明可用的表達(dá)載體包括至少一個(gè)與要表達(dá)的DNA序列或片段可操作連接的表達(dá)控制序列。將所述控制序列插入載體來控制并調(diào)控所克隆的DNA序列的表達(dá)。表達(dá)控制序列的可用實(shí)例是lac系統(tǒng)，trp系統(tǒng)，tac系統(tǒng)，trc系統(tǒng)，噬菌體lambda的主要操縱子和啟動(dòng)子區(qū)，酵母酸性磷酸酶的糖酵解啟動(dòng)子，例如Pho5，酵母alpha-交配因子的啟動(dòng)子，和來自多形瘤(polyoma)，腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，和猿猴病毒的啟動(dòng)子，例如SV40的早期和晚期啟動(dòng)子，和其他已知控制原核和真核細(xì)胞基因及其病毒或其組合物表達(dá)的序列。
優(yōu)選本文使用的啟動(dòng)子是阿拉伯糖啟動(dòng)子(Guzman，L.，Belin，D.，Carson，M.J.和Beckwith，J.，1995.參考文獻(xiàn))，然而，技術(shù)人員可以理解任何合適的啟動(dòng)子都被包括在本發(fā)明范圍。
在載體構(gòu)建中，另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是用方便快速的試驗(yàn)?zāi)軌蚍直鎿饺氘愒碊NA的載體和未修飾的載體。此類試驗(yàn)可用的報(bào)道子系統(tǒng)包括報(bào)道基因和其他產(chǎn)生可檢測(cè)的顏色改變，抗生素抗性等的可檢測(cè)標(biāo)記。一個(gè)優(yōu)選載體中使用了β-半乳糖苷酶報(bào)道基因，該基因可通過在X-gal平板上表現(xiàn)藍(lán)色表型的克隆來檢測(cè)。這有利于選擇。一個(gè)實(shí)施方案中，β-半乳糖苷酶基因可被編碼多角體蛋白的基因取代；該基因可用X-gal染色時(shí)表現(xiàn)白色表型的克隆來檢測(cè)。此藍(lán)白色選擇可用作檢測(cè)重組載體的有效標(biāo)記物。
術(shù)語“配體”指任何結(jié)合其它分子如多肽或肽的分子，并應(yīng)認(rèn)為包括但不限于抗體，細(xì)胞表面受體或噬菌體展示分子。
術(shù)語“噬菌體展示分子”指分子，如肽，蛋白或抗體；它用本領(lǐng)域公知技術(shù)在細(xì)菌噬菌體或類似微生物的細(xì)胞表面表達(dá)。
可理解術(shù)語“抗體”包括保留結(jié)合本發(fā)明多肽的能力的抗體片段或類似物，包括但不限于Fr，F(xiàn)(ab)2片段，scFv分子等。所述抗體可以是多克隆但優(yōu)選是單克隆。一些實(shí)施方案中，所述配體可以是噬菌體展示分子。
“引物”是短的核酸，優(yōu)選長(zhǎng)度15個(gè)核苷酸或更多的DNA寡核苷酸，其通過核酸雜交與互補(bǔ)靶DNA鏈退火來形成引物和所述靶DNA鏈的雜合體，然后通過聚合酶，優(yōu)選DNA聚合酶沿靶DNA鏈延伸?？捎靡飳?duì)來擴(kuò)增核酸序列，例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或其他本領(lǐng)域公知擴(kuò)增核酸的方法。PCR引物對(duì)可衍生自本發(fā)明核酸的序列，例如，通過使用用于此目的的計(jì)算機(jī)程序如Primer(Version 0.56D 1991，Whitehead Institute for BiomedicalResearch，Cambridge，MA)來衍生。
本文所用“探針”指以某種方式(例如放射性，熒光或免疫)標(biāo)記的配體，它通過結(jié)合靶分子或與其相連的分子可用于發(fā)現(xiàn)并標(biāo)記靶分子。通常，所述靶分子可以是本發(fā)明核酸或多肽，它也可包括與另一配體(如例如抗體)復(fù)合(例如結(jié)合)的本發(fā)明多肽，或與所述多肽結(jié)合(即相連)的配體。
本發(fā)明可以清楚理解術(shù)語“包含”指“包括但不限于”，“包括”也具有相應(yīng)的含義。
現(xiàn)在通過如下非限制性實(shí)施例(僅通過參考)來詳細(xì)描述本發(fā)明。
序列表簡(jiǎn)述本發(fā)明可進(jìn)一步參見所附序列表，其中SEQ ID NO.1顯示蛇形毛圓線蟲Aspin(Tco-Aspin)的氨基酸序列SEQ ID NO.2顯示蛇形毛圓線蟲Aspin(Tco-Aspin)的核苷酸序列SEQ ID NO.3顯示截短的蛇形毛圓線蟲Aspin(Tco-Aspin*)的氨基酸序列SEO ID NO.4顯示截短的蛇形毛圓線蟲Aspin(Tco-Aspin*)的核苷酸序列SEQ ID NO.5顯示環(huán)紋奧斯特線蟲()Aspin(Oc-Aspin)的氨基酸序列SEQ ID NO.6顯示環(huán)紋奧斯特線蟲Aspin(Oc-Aspin)的核苷酸序列SEQ ID NO.7顯示捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Aspin(Hc-Aspin)的氨基酸序列SEQ ID NO.8顯示捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Aspin(Hc-Aspin)的核苷酸序列附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明可進(jìn)一步參見以下舉例說明和附圖，其中

圖1顯示蛇形毛圓線蟲L3的勻漿蛋白的單向(one dimensional)免疫印跡分析，它用在發(fā)展針對(duì)線蟲感染的免疫力的過程中綿羊的時(shí)程(time-course)IgE樣本探測(cè)(probed)。所述IgE由在野外羊羔從斷奶后到18月齡的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)取血清樣本來純化。箭頭表明在免疫印跡上檢測(cè)到的主要抗原帶(I-42kDa，II-31-32kDa，III-27-31kDa，IV-20-21kDa，V-2-14kDa)。
圖2顯示蛇形毛圓線蟲L3的勻漿蛋白的雙向(two dimensional)免疫印跡分析。所述蛋白先進(jìn)行等電聚焦(從左到右)之后進(jìn)行SDS-PAGE(從上到下)。免疫印跡用來自免疫綿羊的匯總血清的親和純化總IgE抗體來探測(cè)。對(duì)應(yīng)Tco-Aspin的點(diǎn)用圈標(biāo)明，Tco-Aspin降解產(chǎn)物用正方形標(biāo)明。
圖3顯示蛇形毛圓線蟲L3的勻漿總蛋白經(jīng)雙向凝膠電泳分離和考馬斯藍(lán)染色的結(jié)果。對(duì)應(yīng)Tco-Aspin的點(diǎn)用圈標(biāo)明，Tco-Aspin降解產(chǎn)物用正方形標(biāo)明。
圖4顯示了Tco-Aspin與公認(rèn)的天冬氨酰蛋白酶抑制劑家族其他成員的比對(duì)。以前測(cè)序的成員的數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)是(Oo)奧氏奧斯特線蟲(CAD10783)，(Pt)Parelaphostrongylus tenuis(AAG50205)，(Ce)秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)(AAC46663)，(Av)Acanthocheilonema viteae(S23229)，(Di)犬惡絲蟲(AAA70419)，(Ov)旋盤尾絲蟲(AAA29419)。在公認(rèn)的起始蛋氨酸開始比對(duì)。公認(rèn)的YVRDLT序列基序中被提示對(duì)于抑制功能關(guān)鍵的保守殘基RDL用*表示。不變的半胱氨酸殘基用^標(biāo)記。
圖5顯示蛇形毛圓線蟲成蟲勻漿物(第1道)和L3勻漿物(第2道)用兔抗Tco-Aspin血清免疫染色的單向免疫印跡。
圖6顯示蛇形毛圓線蟲L3勻漿蛋白的雙向免疫印跡分析。所述蛋白先進(jìn)行等電聚焦(從左到右)之后進(jìn)行SDS-PAGE(從上到下)。所述免疫印跡用純化的重組Tco-Aspin免疫的兔血清來探測(cè)。
圖7顯示親和純化的天然Tco-Aspin的單向SDS-PAGE凝膠的銀染結(jié)果，以及用兔抗Tco-Aspin血清顯色的相應(yīng)免疫印跡。
圖8顯示親和純化的天然Tco-Aspin經(jīng)單向SDS-PAGE凝膠和考馬斯藍(lán)染色后轉(zhuǎn)移到PVDF的結(jié)果(A)以及相應(yīng)的免疫印跡(B)，其中顯示了為進(jìn)行Edman測(cè)序而切割的節(jié)段，并且免疫印跡用兔抗Tco-Aspin血清顯色。
試驗(yàn)實(shí)施例1 線蟲幼蟲和抗原制備物從單特異性感染的Romney綿羊的糞便培養(yǎng)物獲得蛇形毛圓線蟲的感染幼蟲(第3期)(TcL3)。液氮下在研缽和研杵中將脫鞘的幼蟲勻漿來制備體細(xì)胞抗原(TcL3-Homog)。在加入了蛋白酶抑制劑(Complete，BoehringerMannheim)的5mM Tris緩沖液(pH 7.6)中提取可溶性蛋白。3000rpm離心10分鐘后，在230/260nm用吸光度確定上清的蛋白濃度，之后分裝并冷凍于-70℃。
實(shí)施例2 雙向凝膠電泳根據(jù)生產(chǎn)者說明書手冊(cè)稍做改動(dòng)進(jìn)行樣本制備和等電聚焦。簡(jiǎn)言之，在3600μl丙酮中-20℃沉淀900μl的TcL3-Homog(～360-1920μg)30-120分鐘。在17000g，4℃離心30分鐘后去除丙酮并干燥沉淀。在含8M尿素，3M硫脲，4％CHAPS，40mM二硫蘇糖醇，0.5％IPG緩沖液(pH 3-10或pH 4-7)和痕量溴酚蘭的～280μl的再水化(rehydration)緩沖液中溶解所述沉淀。在IPGphor(Amersham Pharmacia Biotech)上，用所述溶液在30V再水化ImmobilineDryStrips(13或18cm，pH 3-10或pH 4-7)30-60小時(shí)。在20℃根據(jù)如下電壓方案聚集(focus)蛋白120V/2小時(shí)，500V/1小時(shí)，1000V/1小時(shí)，1000-8000V梯度30分鐘，8000V/6.0-8.5小時(shí)(總Vhr為52000-80000Vhr)。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)平衡步驟后，所述蛋白在10-18％的線性SDS-Page凝膠上沿第二個(gè)方向泳動(dòng)(run)。將經(jīng)過分辨的凝膠(resolved gel)中的蛋白用Copper(Bio-Rad)或微波輔助的考馬斯蘭R-250(Wong 2000)染色或根據(jù)生產(chǎn)者指南(Bio-Rad)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素。
實(shí)施例3 Western印跡首先用麗春紅(Ponceau)S(Harper&Speicher，1995)檢測(cè)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素的蛋白，并且對(duì)膜作標(biāo)記來協(xié)助之后鑒定凝膠中的蛋白從而作進(jìn)一步的分析。在室溫進(jìn)行所有溫育，并用PBS+0.05％Tween 20洗膜3×5分鐘。硝酸纖維素用Blotto封閉后，用10-15μg ml-1的純化綿羊IgE(Shaw等，1997)探測(cè)過夜。從單特異性感染蛇形毛圓線蟲的綿羊或田野(field)放牧的綿羊獲得IgE，所述綿羊通過糞便卵計(jì)數(shù)和蠕蟲計(jì)數(shù)測(cè)定顯示了高的免疫水平(數(shù)據(jù)未示)。連續(xù)用小鼠單克隆抗羊IgE抗體(XB6 & YD3 1/15稀釋的培養(yǎng)物上清)和辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG gamma鏈特異性抗體(1/1000)(Sigma Chemical)溫育所述膜，之后用3-氨基-9-乙基卡唑(ethylcarbozole)檢測(cè)。分析Western印跡上對(duì)應(yīng)于強(qiáng)IgE結(jié)合點(diǎn)的分子量33,000且pI 5.1的蛋白點(diǎn)(Tco-Aspin)來確定氨基酸序列信息。
實(shí)施例4 蛋白的凝膠內(nèi)消化通過與IgE染色的平行(companion)Western印跡比較來鑒定考馬斯蘭染色的凝膠中的蛋白點(diǎn)。切割、脫色并用胰蛋白酶消化所述點(diǎn)(Shevchenko等，1996)。簡(jiǎn)言之，在25mM NH4HCO3的50％乙腈(ACN)溶液中脫去所述點(diǎn)的染色。然后所述點(diǎn)通過離心蒸發(fā)干燥，在含12.5μg ml-1胰蛋白酶的25mMNH4HCO3中再水化，并在37℃溫育16小時(shí)。然后連續(xù)用25mM NH4HCO3，50％ACN/0.5％三氟乙酸(TFA)(3次)以及用100％ACN來提取肽。在Speedvac中干燥提取物混合物，用milliQ水淋洗，然后再干燥。再在0.5％TFA中溶解所述提取物。用ZipTips(Millipore)根據(jù)生產(chǎn)者指南凈化所述胰蛋白酶消化物。在基質(zhì)溶液中從ZipTips洗脫肽，所述溶液由50％ACN/0.5％TFA中的α-氰基-4-羥基肉桂酸的飽和溶液組成，并直接在Maldi樣本板上點(diǎn)樣(spot)。
實(shí)施例5 通過肽質(zhì)量指紋法(peptide mass fingerprinting)鑒定蛋白在裝備了337nm氮激光的MALDI-tof儀器(Perceptive Biosystems，Voyager質(zhì)譜儀(mass spectrometer))上確定從每個(gè)蛋白點(diǎn)經(jīng)胰蛋白酶消化得到的肽的分子量。用CALMIX2外部校準(zhǔn)所有MALDI譜。將肽的質(zhì)量提交ProFound的蛋白質(zhì)量數(shù)據(jù)庫檢索(URLhttp//www.proteometrics.com/prowl-cqi/ProFound.exe)。
實(shí)施例6 利用電噴射離子化作用進(jìn)行肽的從頭測(cè)序?qū)⒌鞍c(diǎn)提交澳大利亞蛋白質(zhì)組分析中心(Australian Proteome AnalysisFacility)(APAF，Sydney，Australia)來確定所選肽的氨基酸序列。簡(jiǎn)言之樣本在37℃經(jīng)過16-小時(shí)胰蛋白酶消化。所得肽用ZipTip純化，使所述樣本濃縮并脫鹽。然后用裝備了奈噴灑來源(nanospray source)的Micromass Q-TOF MS通過ESI-TOF MS/MS來分析所述樣本，其使用連接至Waters CapLC的流動(dòng)注射或用硼硅酸鹽毛細(xì)管手動(dòng)來進(jìn)行奈噴灑采集。采集處于400-1800Da范圍的m/z數(shù)據(jù)以便選出用于MS/MS分析的肽。選定肽以后，將MS切換到MS/MS模式并收集處于50-2000Da范圍的m/z數(shù)據(jù)，其帶有可變碰撞能量設(shè)置(variable collision energy setting)。然后從該數(shù)據(jù)確定氨基酸序列。
實(shí)施例7 N-末端氨基酸測(cè)序用2-D電泳(如實(shí)施例2)分離蛇形毛圓線蟲L3的粗制蛋白，并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將其電印跡到PVDF膜來制備測(cè)序蛋白。用0.1％麗春紅S和/或0.025％考馬斯蘭R染色所述PVDF，鑒定對(duì)應(yīng)于平行Western印跡(實(shí)施例3)上的變應(yīng)原的點(diǎn)并將其切下。然后用Edman降解法分析PVDF點(diǎn)來確立氨基末端的氨基酸序列，從而確立盡可能多的殘基。
實(shí)施例8 分子生物學(xué)所述蛋白點(diǎn)進(jìn)行QTOF質(zhì)譜法時(shí)產(chǎn)生兩個(gè)肽，TC41A和TC41I的序列。所述蛋白的成熟氨基末端也用蛋白測(cè)序確定。設(shè)計(jì)正向和反向的簡(jiǎn)并寡核苷酸并將它們用作允許條件下的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物。除了開始提取是在液氮條件下在存在Trizol時(shí)通過碾碎幼蟲進(jìn)行的之外，蛇形毛圓線蟲總RNA是用Trizol(GibcoBRL)根據(jù)生產(chǎn)者方案制備的。通過標(biāo)準(zhǔn)方法用Superscript II(GibcoBRL)將總RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA并用作隨后PCR的模板。PCR所用引物列于如下。
SL1GGTTTAATTACCAAGTTTGATco-Aspin TC41 Afor GAAGAGCAGGAAATCACCAAYTTAYGARAATco-Aspin TC41 Arev TTTTCGTAGTTGGTGATTTCYTGYTGYTCTco-Aspin TC41 lfor GGAGARGCTGARCARTTTco-Aspin TC41 lrev AAYTGYTCAGCYTCNCCTC41.sig.5.nde GATCGGCGCGCCATATGGCACCAAGACAGAACGCTco-Aspin TC41.not.3 GATCTGCGGCCGCATAGATCCTCGTGCAGAAGTTTco-Aspin.3.2.not GAATTCGCGGCCGCCTTCTTCTCAAACTCCTTCAACTCHc-Aspin 5.1ATGAAGTTGGTCGTRCTSTGCGTTCTGTGTGHO-Aspin 3.1ATAGATCCTTGTGCAAAAGTTGGGCHc-Aspin 3.RACE GCATGGTTCAGGGCAACAAGGTC
Hc.Aspin.5.Nde GATCGGCGCGCCATATGCTCACTGTGGGCACGATCTCCHc.Aspin.3.Not GATCTGCGGCCGCATAGATTCTCGTACAGAAGTTOc.Aspin.5.Nde GATCGGCGCGCCATATGCTTACTGTGGGCACAATCGCTOc.Aspin.3.Not GATCTGCGGCCGCATAGATCCTTGTGCAAAAGTTGPolyTA TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAPolyTC TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCPolyTG TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTG除了線蟲的經(jīng)剪接的前導(dǎo)引物(SL1)以外，用這些引物的多種組合進(jìn)行蛇形毛圓線蟲，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲和環(huán)紋奧斯特線蟲cDNA的PCR反應(yīng)。使用簡(jiǎn)并引物的PCR條件如下95℃2分鐘，之后95℃30秒，35℃45秒，+1.0℃每循環(huán)，72℃45秒共10個(gè)循環(huán)，之后95℃30秒，45℃45秒，+0.2℃每循環(huán)，72℃60秒，+2秒每循環(huán)共30個(gè)循環(huán)。使用蛇形毛圓線蟲cDNA，在用SL1和TC41Arev組合引物反應(yīng)后將產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳觀察到240bp的產(chǎn)物，而所有其他組合未產(chǎn)生可檢測(cè)的PCR產(chǎn)物。以環(huán)紋奧斯特線蟲cDNA為模板用SL1和HO-Aspin 3.1組合引物反應(yīng)后將產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳觀察到740bp的產(chǎn)物。以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲為模板用Hc-Aspin 5.1和HO-Aspin 3.1組合引物反應(yīng)后將產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳觀察到700bp的產(chǎn)物。用引物Hc-Aspin 3.RACE和PolyTG在以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲cDNA為模板的PCR反應(yīng)中產(chǎn)生捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Aspin的3′末端。將PCR產(chǎn)物用TA cloning(Invitrogen)克隆到pCR2.1，并用ABI 377自動(dòng)DNA測(cè)序儀(Waikato DNAsequencing facility)測(cè)序。蛇形毛圓線蟲序列的分析表明與多種線蟲蛋白酶(胃蛋白酶)抑制劑mRNA的5′末端的同源性。也注意到以前鑒定的EST克隆(未公開)與這些蛋白酶(胃蛋白酶)抑制劑在3′末端同源。從而可以合成Tco-Aspin特異性5′和3′引物，TC41.not3和TC41.sig.5.nde，其每個(gè)包含克隆進(jìn)入表達(dá)載體AY2-4所需的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。在以蛇形毛圓線蟲cDNA作為模板的PCR反應(yīng)中，這些引物被用于產(chǎn)生成熟的Tco-Aspin編碼序列。在以蛇形毛圓線蟲cDNA作為模板的PCR反應(yīng)中，所述引物TC41.sig.5.nde和Tco-Aspin.3.2.not被用于產(chǎn)生截短的Tco-Aspin(Aspin*)編碼序列。在以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲cDNA作為模板的PCR反應(yīng)中，所述引物Hc.Aspin.5.Nde和Hc.Aspin.3.Not被用于產(chǎn)生成熟的Hc-Aspin編碼序列。在以環(huán)紋奧斯特線蟲cDNA作為模板的PCR反應(yīng)中，所述引物Oc.Aspin.5.Nde和Oc.Aspin.3.Not被用于產(chǎn)生成熟的Oc-Aspin編碼序列。PCR之后，將所述產(chǎn)物用合適的限制性酶切割(restricted)并用凝膠純化(Qiagen)。將所得的DNA產(chǎn)物用合適的限制性酶消化，克隆到表達(dá)載體AY2-4然后測(cè)序所克隆的插入片段。
含有Tco-Aspin/AY2-4，Tco-Aspin*/AY2-4，Hc-Aspin/AY2-4或Oc-Aspin/AY2-4構(gòu)建體的細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中在37℃生長(zhǎng)到0.8的光密度(600nm)，此時(shí)通過加入0.2％的L(+)阿拉伯糖(BDH)誘導(dǎo)蛋白合成。在30℃誘導(dǎo)16小時(shí)，此時(shí)使所述細(xì)菌沉淀并在含有1mg/ml溶酶體的300mMNaCl/50mM PO4pH 8.0緩沖液中重懸，在冰上孵育1小時(shí)。超聲處理所述細(xì)菌并通過離心澄清(clarified)所述溶液來產(chǎn)生可溶性細(xì)菌級(jí)分。將重組蛋白固定在Ni-NTA樹脂(Qiagen)上，用含有20mM咪唑的300mM NaCl/50mM PO4pH 8.0緩沖液洗滌來去除污染的大腸桿菌蛋白，之后通過加入100mM咪唑洗脫所述重組蛋白。然后所述重組蛋白對(duì)300mM NaCl/50mM PO4pH 8.0緩沖液透析去除咪唑并確定蛋白濃度。也從不溶的包涵體級(jí)分純化重組Tco-Aspin。本例中，將裂解(lysed)的細(xì)菌離心后，將細(xì)菌在8M尿素，300mMNaCl/50mM PO4pH 8.0緩沖液中溶解，并上樣到用相同緩沖液平衡的Ni-NTA柱子。在用多個(gè)柱體積洗滌后，在無尿素的相同緩沖液中洗滌柱子，之后如上在咪唑中洗脫。
實(shí)施例9 對(duì)兔子進(jìn)行免疫接種用純化的有6-his標(biāo)記的重組蛋白來免疫新西蘭白兔。肌內(nèi)和皮下注射免疫制劑(Immunizing dose)，其由100μg的Tco-Aspin和以由6份Montanide5份水溶液組成的Montanide ISA50混合。四周后用相同途徑給藥按第一次的方法制備的第二次免疫制劑。第二次免疫的10天后，在麻醉的情況下心臟穿刺使兔子流血。在室溫凝血1小時(shí)后，在1300g離心血液15分鐘。收集血清并儲(chǔ)存在-20℃?zhèn)溆?。此血清被稱為抗Tco-Aspin。
實(shí)施例10 親和純化天然Tco-Aspin用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過蛋白G Sepharose親和力從經(jīng)過Tco-Aspin免疫的兔子的血清純化IgG。根據(jù)生產(chǎn)者方案，使所純化的抗體與NHS-活化的Sepharose(Amersham Pharmacia)結(jié)合。TcL3-homog以0.5-2.0ml/min流經(jīng)固定了兔抗體的柱子。用緩沖液(20mM磷酸鹽緩沖液，500mM NaCl，pH 7.0)洗滌所述柱子直到280nm的吸光度達(dá)到基線。用0.1M甘氨酸或甲酸pH 3.0洗脫所結(jié)合的Tco-Aspin。洗脫物用1M Tris或碳酸氫銨pH 8.0中和。真空干燥所洗脫的級(jí)分，之后用1-D電泳分析。
實(shí)施例11 重組蛋白特異性IgE和IgG1的酶免疫分析用ELISA如前述檢測(cè)抗原-特異性IgG1和IgE(Shaw等，1998a)。在IgE和IgG1分析中，用具有氨基酸序列SEQ ID NO.1的Tco-Aspin包被所述板時(shí)，可溶重組體的最適濃度分別被確定為0.2和5μg ml-1PBS溶液。為得到田野綿羊的抗體水平的指征(indication)，從AgResearch′s選擇性繁殖并選作高(易感的)或低(抵抗的)糞便線蟲卵計(jì)數(shù)的Romney綿羊品系(line)獲得血清樣本。同時(shí)也從未選擇的對(duì)照群體(flock)取樣。以O(shè).D.單位的吸光度均值表示結(jié)果。為進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)抗體O.D.值進(jìn)行l(wèi)oge轉(zhuǎn)化來校正分布。
特異性IgE免疫分析方法通過用500μl在蒸餾水中76％飽和的硫酸銨使500μl的血清沉淀來預(yù)處理血清樣本。渦旋震蕩(vortex)樣本10秒，在15分鐘后重復(fù)，然后30分鐘后在微量離心機(jī)中離心(13,000rpm 10分鐘)。收集上清并在蒸餾水加0.1％Tween 20中1∶1稀釋來做試驗(yàn)。在37℃用重組Tco-Aspin(0.2μgml-1，100μl)在PBS pH 7.2中的最適稀釋液將微滴板(Costar EIA/RIA plate(#9017)，Corning Incorporated，Corning，NY，USA)的孔包被2小時(shí)。板用0.05％(v/v)Tween 20的蒸餾水溶液(water-T20)洗滌3次后，用5％脫脂奶粉的PBS液封閉5分鐘。用water-T20洗滌板6次。然后用沉淀的血清上清(100μl每孔一式兩份)在室溫過夜溫育微滴板。在PBS-Tween 20中洗滌6次后，連續(xù)用小鼠抗羊IgE單克隆抗體(1/15培養(yǎng)物上清XB3/YD3，Shaw等，1998)，山羊抗小鼠gamma鏈特異性過氧化物酶偶聯(lián)物(Sigma，St.Louis，Mo，USA)溫育所述板。加入酶底物3，3′5，5′四甲基聯(lián)苯胺并溫育30分鐘。用2N H2SO4停止反應(yīng)。用450nm濾光片讀板。當(dāng)平均吸光度值超過試驗(yàn)空白孔均值的6倍加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差，綿羊被視為Tco-Aspin IgE陽性。
實(shí)施例12 皮試在AgResearch′s2002出生的選擇性繁殖的Romney綿羊品系進(jìn)行皮試。從斷奶直至羔羊約6月齡(2003年4月)進(jìn)行每月的皮試和血清抽樣。在大腿內(nèi)側(cè)的相對(duì)無毛區(qū)，或偶爾在背側(cè)(flank)(剪羊毛后)，皮內(nèi)注射綿羊。用26號(hào)針注射PBS中的天然或重組Tco-Aspin(0.1-10μg)。觀察到風(fēng)團(tuán)(Wheal)和潮紅(flare)反應(yīng)并且在約注射后30分鐘測(cè)量。對(duì)于大部分皮試，注射0.15-0.3μg的Tco-Aspin。位于后腿上部?jī)?nèi)側(cè)的注射區(qū)羊毛覆蓋最少，它有助于注射和評(píng)估反應(yīng)。用帶有26號(hào)×1/2英尺針的結(jié)核菌素注射器皮內(nèi)注射100μl含有Aspin的PBS。如果注射準(zhǔn)確，通常在注射位置會(huì)形成小的可辨別的泡(bubble)。記錄時(shí)間和綿羊標(biāo)記編號(hào)(sheep tag number)。在約20分鐘內(nèi)繼續(xù)注射其他動(dòng)物。根據(jù)注射順序讀出反應(yīng)。將綿羊定位(locate)，捕捉，翻身并找出其注射位置。將反應(yīng)計(jì)為0-4的計(jì)分等級(jí)(表1)。計(jì)分0或1被視為陰性。計(jì)分2或更高被視為陽性。
表1.用于評(píng)估皮試反應(yīng)的計(jì)分的值和描述

用游標(biāo)卡尺通過讀出以毫米計(jì)的反應(yīng)風(fēng)團(tuán)的最長(zhǎng)直徑及其橫切(transecting)直徑來測(cè)量反應(yīng)。將此兩個(gè)值相乘，計(jì)算皮試反應(yīng)面積(mm2)。
實(shí)施例13胃蛋白酶抑制試驗(yàn)用對(duì)豬胃蛋白酶血紅蛋白消化活性的抑制(Kageyama 1998)來確定天然和重組Tco-Aspin的活性。用胃蛋白酶抑制劑作為陽性對(duì)照。
結(jié)果和討論為鑒定變應(yīng)原蛋白，將TcL3-勻漿物電泳分離，電印跡并用親和純化羊IgE免疫染色。之前用1-D SDS-Page凝膠進(jìn)行的研究鑒定了在分子量12-14，20-21，27-31，31-32和42kDa的相應(yīng)蛋白帶，其與田野放牧的綿羊?qū)ι咝蚊珗A線蟲感染的變態(tài)免疫相關(guān)(圖1)。用2-D電泳技術(shù)，從考馬斯蘭染色的2-D凝膠(圖3)上切下對(duì)應(yīng)于Western印跡上分子量33,000、pI5.1的強(qiáng)IgE結(jié)合點(diǎn)(圖2)的蛋白點(diǎn)(Tco-Aspin)并分析確定氨基酸序列信息。用從33kDa/pI5.1的點(diǎn)獲得的肽質(zhì)量進(jìn)行肽質(zhì)量指紋分析，沒有獲得與已知蛋白的陽性匹配。從分離的點(diǎn)獲得2個(gè)經(jīng)胰蛋白酶消化的肽，可以進(jìn)行肽的從頭測(cè)序。這些分離的點(diǎn)是TC41A；884.9[M+2H]2+SASEQQE[L/I]TNYEK和TC41I；737.46[M+3K]3+GEAEQFL。在將33kDA/pI 5.1點(diǎn)轉(zhuǎn)移到PVDF濾膜(filter)后，用Edman降解該點(diǎn)獲得LTVGTI的N-末端序列。
制備重組天冬氨酰蛋白酶抑制劑(Tco-Aspin)從內(nèi)部肽序列設(shè)計(jì)正向和反向簡(jiǎn)并寡核苷酸引物，并彼此結(jié)合或與對(duì)應(yīng)于線蟲剪接前導(dǎo)序列和polyT的引物結(jié)合用于PCR。用引物TC41Arev和SL1獲得蛇形毛圓線蟲cDNA的PCR產(chǎn)物。將此產(chǎn)物經(jīng)TA(InVitroGen)克隆到質(zhì)粒pCR2.1并且測(cè)序所述插入片段。分析所述序列表明此cDNA與蛇形毛圓線蟲cDNA文庫(未公開)在先測(cè)序的部分cDNA克隆來自相同基因。重疊的組合的(combined)cDNA編碼與天冬氨酰蛋白酶抑制劑家族的蛋白具有強(qiáng)同源性的蛋白(Tco-Aspin)，該蛋白包含測(cè)序33kDa/pI 5.1的點(diǎn)(見下)所鑒定的肽?；赥co-Aspin編碼區(qū)的氨基和羧基末端DNA序列合成引物TC41.sig.5.nde和TC41.not.3。這些引物被用于以蛇形毛圓線蟲cDNA為模板通過PCR獲得編碼Tco-Aspin的DNA的完整拷貝。對(duì)所得PCR產(chǎn)物測(cè)序，并將其克隆到含有阿拉伯糖啟動(dòng)子，polyHis區(qū)，和單克隆表位標(biāo)簽的表達(dá)載體AY2-4。將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大腸桿菌，用氨芐青霉素抗性鑒定成功的轉(zhuǎn)化子。重組細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并用阿拉伯糖誘導(dǎo)Tco-Aspin表達(dá)。誘導(dǎo)后在可溶蛋白級(jí)分和不可溶的包涵體級(jí)分中發(fā)現(xiàn)重組Tco-Aspin。將可溶的Tco-Aspin用固相金屬親和層析(IMAC)直接純化。將不可溶級(jí)分溶解在促溶劑(chaotropic agent)中然后用IMAC純化。
天冬氨酰蛋白酶抑制劑(Tco-Aspin)684個(gè)堿基對(duì)的cDNA序列(SEQ ID NO.2)編碼228個(gè)氨基酸(SEQ IDNO.1)的蛋白，其分子量預(yù)計(jì)為25,414Da并且計(jì)算的pI為5.31。N-末端氨基酸序列包含公認(rèn)的信號(hào)肽(SignalP V1.1；http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/index.html)，建議的斷裂位點(diǎn)在殘基15和16之間(丙氨酸-丙氨酸)。N-末端測(cè)序顯示成熟蛋白的N-末端是LTVGTI，表明進(jìn)一步加工去除了氨基酸APRQKR。公認(rèn)的215個(gè)氨基酸的成熟蛋白不含信號(hào)序列和氨基酸APRQKR，預(yù)計(jì)分子量為23056.77Da并且pI為4.93。所述序列不包含預(yù)計(jì)的N-糖基化位點(diǎn)。
用預(yù)期的氨基酸序列進(jìn)行的計(jì)算機(jī)檢索顯示，與如下的天冬氨酰蛋白酶抑制劑有顯著同源性奧氏奧斯特線蟲(CAD10783)(％同一性/％類似性)(86％/90％)，Parelaphostrongylus tenuis(AAG50205)(71％/83％)，秀麗隱桿線蟲(AAC46663)(50％/68％)，Acanthocheilonema viteae(S23229)(40％/59％)，犬惡絲蟲(AAA70419)(42％/57％)，旋盤尾絲蟲(AAA29419)(42％/60％)。Tco-Aspin與其他公認(rèn)的天冬氨酰蛋白酶抑制劑家族成員的成群的序列對(duì)比見圖4所示。這些蛋白與小腸線蟲豬蛔蟲(Ascaris suum)的已知天冬氨酰蛋白酶抑制劑有更遠(yuǎn)的同源性(Martzen等，1990)。與線蟲Aspin的共同結(jié)構(gòu)特征包括存在信號(hào)肽序列和在成熟蛋白中所有四個(gè)半胱氨酸殘基保守。在多種絲蟲性線蟲抑制劑中提示具有關(guān)鍵功能重要性的YVRDLT序列基序(Willenbucher J等，1993)在Tco-API-1中保守性不好，因?yàn)榇说鞍字辉诘韧恢帽Ａ袅丝s短的RDL基序。旋盤尾絲蟲，Ov33(Tume等，1997)和豬蛔蟲，PI-3(Martzen等，1990，Kageyama 1998)的相關(guān)抑制劑抑制了天冬氨酰蛋白酶如胃蛋白酶和組織蛋白酶E的體外活性。我們能夠用豬的胃蛋白酶證實(shí)與親和純化天然Tco-Aspin類似的抑制活性。
將兔抗重組Tco-Aspin血清上樣到TcL3和Tc-成蟲勻漿物(圖5)的1-D印跡。這鑒定了TcL3勻漿物在31和22kDa的強(qiáng)染色帶。在成蟲勻漿物見到了明顯弱一些的相同分子量的帶。將兔產(chǎn)生的抗Tco-Aspin血清上樣到TcL3勻漿物的2-D印跡，鑒定了一系列32.2-34.5kDa且pI 4.9-5.7的緊密排列的點(diǎn)(圖6)。這些在位置上對(duì)應(yīng)于作氨基酸測(cè)序的原始點(diǎn)。在58.8kDa，pI 5.6的點(diǎn)被認(rèn)為是非特異性結(jié)合的。另外在22.9kDa，pI 5.7的點(diǎn)被兔抗Tco-Aspin抗血清染色，它被認(rèn)為是Tco-Aspin的降解產(chǎn)物。
親和純化從粗制TcL3-勻漿物分離的天然Tco-Aspin，并在1-D SDS-Page凝膠上泳動(dòng)(圖7)，跑出2條分子量31.3和21.8kDa的帶。
22kDa抗原通過探測(cè)粗制TcL3-勻漿物的2-D印跡而鑒定、并從相同材料用兔抗Tco-Aspin抗體親和純化，該抗原可能是Tco-Aspin的截短產(chǎn)物。用氨基酸測(cè)序技術(shù)試圖鑒定此點(diǎn)(見圖3和4正方形)沒有產(chǎn)生結(jié)果，因?yàn)槟z中蛋白量不足。對(duì)2-D凝膠上22kDa的Tco-Aspin截短產(chǎn)物位置下面的足量(abundant)鄰接蛋白作氨基酸測(cè)序。測(cè)序編碼此蛋白的蛇形毛圓線蟲DNA后，顯示它與假設(shè)的秀麗隱桿線蟲蛋白Y5F2A.1同源。此蛋白的重組形式經(jīng)證實(shí)無顯著IgE結(jié)合。濃縮約40μg親和純化的天然Tco-Aspin并上樣到1-D SDS-page凝膠。將所述凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF并染色來鑒定親和純化產(chǎn)物(圖8)。除了31和22kDa的蛋白帶，也鑒定出第三條分子量較低的帶。將這三條帶都切割下來，進(jìn)行N-末端測(cè)序。Edman測(cè)序顯示每條帶都有相同的N-末端氨基酸序列LTVGTI。這表明這些蛋白是Tco-Aspin的截短產(chǎn)物，它們很可能是通過在C-末端蛋白水解產(chǎn)生的，并且Tco-Aspin的N-末端沒有降解。所以我們得出結(jié)論通過篩選對(duì)線蟲感染發(fā)生免疫的綿羊所鑒定的所述20-21kDa的帶(圖1)是Tco-Aspin的截短產(chǎn)物。
通過努力制備20-21kDa的截短Tco-Aspin(Tco-Aspin*)的重組形式，產(chǎn)生了表達(dá)Tco-Aspin肽、但缺失該蛋白序列164-165位的雙賴氨酸的C-末端65個(gè)氨基酸的表達(dá)載體。此肽的分子量與天然Tco-Aspin的截短產(chǎn)物(20-21kDa)成比例。
在開發(fā)Tco-Aspin的ELISA時(shí)，用可溶Tco-Aspin或，還原(reduction)后用可溶和不可溶的形式，都可獲得與從免疫綿羊純化的IgE的最大反應(yīng)性。發(fā)現(xiàn)用可溶Tco-Aspin時(shí)，包被微滴板的最適蛋白濃度在特異性IgE試驗(yàn)中為0.2μg ml-1，在特異性IgG1試驗(yàn)為2.5μg ml-1。也生產(chǎn)了環(huán)紋奧斯特線蟲(Oc-Aspin)(SEQ ID NO.5)，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Hc-Aspin)(SEQ ID NO.7)和截短的Tco-Aspin*(SEQ ID NO.3)的重組Aspin。發(fā)現(xiàn)在特異性IgE試驗(yàn)中，Oc-Aspin和Tco-Aspin*的最適蛋白濃度為0.25μg ml-1，Hc-Aspin的為5μgml-1。
選擇品系綿羊?qū)χ亟M變應(yīng)原的免疫反應(yīng)性線蟲感染的綿羊中對(duì)Tco-Aspin的特異性IgE反應(yīng)測(cè)量了羊羔對(duì)重組Tco-Aspin的IgE和IgG1反應(yīng)，所述羊羔來自在AgResearch′s Wallaceville Animal Research Centre選擇性繁殖對(duì)于線蟲寄生蟲感染有抗性(R)或易感(S)的羔羊品系(Morris等，2000)。也維持了未選擇的對(duì)照(C)系。來自所有三個(gè)系的羊羔一起在感染了蠕蟲的牧場(chǎng)放牧。表2顯示在一月和三月羊羔約為4和6月齡時(shí)得到的血清樣本中，R-系羊羔的抗Tco-Aspin IgE水平明顯高于S-或C-系羊羔。與此相對(duì)，只有R和S系綿羊的抗Tco-Aspin IgG1水平明顯不同。這些結(jié)果顯示，羊羔早在4月齡就有對(duì)所述線蟲變應(yīng)原Tco-Aspin的特異性IgE反應(yīng)性，可以利用此反應(yīng)性來鑒定更能發(fā)展對(duì)線蟲蠕蟲的有效免疫的動(dòng)物。49％的R-系綿羊在一月為Tco-AspinIgE陽性并且截至三月增加到58％。與此相比，3％的S-系羊羔和18％的對(duì)照系在一月，以及5％的S-系羊羔和28％的對(duì)照系在三月分別為陽性。R-系樣本對(duì)天然Tco-Aspin進(jìn)行試驗(yàn)獲得了極為類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示)。
表2 2001年生的Wallaceville選擇系雄性羊羔在一月或三月的平均特異性抗體結(jié)果(光密度值，逆轉(zhuǎn)化(back-transformed))。

測(cè)試與抵抗-系綿羊的系差別，其中aP＜0.001；bP＜0.05；NS無顯著性。
與表2的選擇系(selection-line)差別一致，發(fā)現(xiàn)log轉(zhuǎn)化的Tco-Aspin(IgE)和log轉(zhuǎn)化的糞便卵計(jì)數(shù)(FEC)之間的遺傳相關(guān)性為強(qiáng)陰性(表3)。例如，logeTco-Aspin一月(IgE+1)和loge(FEC一月+100)的遺傳相關(guān)性為0.44(s.e.0.12；P＜0.001)，和loge(FEC三月+100)的遺傳相關(guān)性為0.51(s.e.0.12；P＜0.001)。(所述遺傳相關(guān)性指示，控制動(dòng)物中一種性狀度量(performancemeasure)的表達(dá)的基因與另一性狀度量的表達(dá)相關(guān)的程度)。對(duì)Aspin的特異性IgE反應(yīng)和dag計(jì)分之間無明顯遺傳相關(guān)性，并且發(fā)現(xiàn)4或6月齡抗Tco-Aspin IgG1水平和FEC之間，或抗Tco-Asp IgG1水平和dag計(jì)分之間無明顯遺傳相關(guān)性(未示)。
表3所測(cè)的抗體性質(zhì)，皮試性質(zhì)和loge糞便卵計(jì)數(shù)(FEC)，臀部(breech)污染計(jì)分(dag計(jì)分)或活重增加(斷奶到一月，或一月到四月)的遺傳相關(guān)性

aP＜0.001NS_無顯著性然后假設(shè)Tco-Asp，可能還有來自其他胃腸道線蟲的天冬氨酰蛋白酶抑制劑，可在迅速鑒定易于在田野條件下發(fā)展對(duì)線蟲的免疫抗性的綿羊而進(jìn)行的皮內(nèi)皮試中，可能具有效力。表4顯示，皮試評(píng)估218只選擇系的動(dòng)物，無論是測(cè)量變態(tài)面積、用0-4計(jì)分，還是用陰性/陽性標(biāo)準(zhǔn)確定變態(tài)反應(yīng)，R、C和S系中的那些對(duì)皮試反應(yīng)都明顯不同。這三種度量也與在六月齡動(dòng)物中測(cè)量的FEC顯著不相關(guān)(對(duì)于面積，P＜0.063，至少對(duì)試驗(yàn)計(jì)分(0-4)和陰性/陽性試驗(yàn)結(jié)果，P＜0.005)。表4也顯示R系動(dòng)物與復(fù)原(resilient)系羊羔的反應(yīng)并非顯著不同(繁殖后者是因?yàn)樗鼈兙哂性诿媾R嚴(yán)重線蟲攻擊時(shí)持續(xù)生長(zhǎng)而不需驅(qū)線蟲治療的能力)。
表4用面積測(cè)量，試驗(yàn)計(jì)分和陰性/陽性反應(yīng)，對(duì)母羊羔的皮試性質(zhì)做最小二乘分析(least squares analysis)

*僅僅在2，81，和82系的log(FEC2)相關(guān)性(協(xié)方差(covariance))**P＜0.01；***P＜0.001.
這些結(jié)果對(duì)以前的工作作了擴(kuò)展，過去我們報(bào)道在放牧R-和S-系羊羔并暴露于線蟲攻擊時(shí)，F(xiàn)EC和IgE反應(yīng)間的遺傳相關(guān)性是陰性的(Shaw等，1999)。以前的工作顯示，對(duì)TcL3 ES抗原粗制混合物的特異性IgE與三月的臀部污染(breech soiling)水平(“dag計(jì)分”)的遺傳相關(guān)性是陽性的，但本研究中Tco-Aspin特異性IgE和dag計(jì)分中沒有此類相關(guān)性。這提示根據(jù)Tco-Aspin特異性IgE水平的增加來選擇對(duì)寄生蟲感染抵抗的綿羊，應(yīng)不會(huì)同時(shí)造成臀部污染增加。臀部的dag的形成由腹瀉造成，一般認(rèn)為這種腹瀉與對(duì)線蟲感染的炎癥反應(yīng)相關(guān)，這種dag形成在一些抵抗-系綿羊中特別明顯(Bisset等，2001)。因此我們確認(rèn)除了ELISA以外，有可能建立更實(shí)用的測(cè)試來測(cè)量針對(duì)指定變應(yīng)原的特異性IgE水平，并且這些可被有效用作選擇性繁殖計(jì)劃的一部分。
用于本研究中表2-4的動(dòng)物的來源表2(最小二乘分析)137只2001年生的抵抗系(R)，易感系(S)和對(duì)照系(C)公羊羔。
表3(來自ASREML分析的遺傳相關(guān)性)第1和2行89-91年生(n＝709)的后代試驗(yàn)(Progeny-Test)的羊羔，加上2001年生(n＝592)的羊羔的ELISA結(jié)果，以及Wallaceville自1979-2001的所有FEC和Dag計(jì)分?jǐn)?shù)據(jù)。(N.B.對(duì)于89生后代試驗(yàn)的羊羔無Aspin IgE(Jan)；只有三月的)第3-5行2002年生羊羔的皮試結(jié)果(來自Wallaceville所有系的母羊羔的223只母羊羔(第2，22，42，81，82和85系)，加上42只R-系公羊羔，以及自1979-2002年的所有FEC值)。
表4(最小二乘分析)R，S，C和復(fù)原系的218只母羊羔。
比較Tco-Aspin皮試和特異性IgE ELISA計(jì)分與ELISA的相關(guān)性用Chi平方試驗(yàn)確定皮試計(jì)分，陰性(計(jì)分0-1)或陽性(計(jì)分2-4)和ELISA陰性或陽性(當(dāng)樣本吸光度均值比試驗(yàn)空白孔均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差還要大時(shí)，判為(rated)IgE陽性)的相關(guān)性。
表5a 公羊羔的計(jì)分Neg/Pos和ELISA在不同閾值的相關(guān)顯著性(試驗(yàn)空白孔均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Bkgd)的1-10倍)

aP＜0.05表5b.母羊羔的計(jì)分Neg/Pos和ELISA在不同閾值的相關(guān)顯著性(試驗(yàn)空白孔均值加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Bkgd)的1-10倍)

aP＜0.05除了斷奶時(shí)(十二月份)，這些結(jié)果提示比ELISA的背景均值加兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差高四倍的ELISA值會(huì)與陽性皮試反應(yīng)明顯相關(guān)。
落入ASP IgE(三月)等級(jí)排列(rank list)的上一半比下一半(the top vsbottom half)中的計(jì)分(陰性比陽性)的chi-平方為61.5(即P＜0.0001)。表6顯示在取自母羊或約6月齡羊羔的樣本中，log(ELISA IgE)和log(皮試)是緊密相關(guān)的(P＜0.0001)。
面積與ELISA的相關(guān)性分析前，計(jì)算loge(面積測(cè)量值+100)和loge(校正的ELISA值+1)。用最小二乘分析皮試測(cè)量值，以性別作為固定效果(fixedeffect)且將相關(guān)日期的loge(ELISAIgE)作為共變(covariate)。
表6.log(ELISA IgE)和log(皮試面積(mm2)+100)的相關(guān)性檢驗(yàn)(顯著性檢驗(yàn))

我們得出結(jié)論，ELISA IgE和皮試反應(yīng)面積明顯相關(guān)。
2002年生的羊羔(抵抗的比易感的)對(duì)Aspin IgE一月和三月的選擇系差別是高度顯著的(P＜0.0001)。選擇系的面積差別是顯著的(P＜0.001)。
Aspin特異性IgE ELISA和皮試的可遺傳性表7

這些結(jié)果顯示ELISA和皮試都是可遺傳性狀。
比較不同的線蟲Aspin獲得環(huán)紋奧斯特線蟲(環(huán)紋背帶線蟲)和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的Aspin的編碼序列并表達(dá)重組蛋白。將編碼DNA插入細(xì)菌表達(dá)載體，產(chǎn)生相應(yīng)的重組蛋白，按照上文中關(guān)于Tco-Aspin的描述來進(jìn)行純化。此三種Aspin的氨基酸序列很類似。環(huán)紋奧斯特線蟲和Tco-Aspin的同源性是(％同一性/％類似性)(87.1％/89.8％)，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲和Tco-Aspin的同源性是(84.9％/87.6％)。
用2001年生的抵抗系公羊羔的血清樣本比較IgE對(duì)多種天然和重組Aspin制備物的反應(yīng)性(表8)。
表8.2001年生的抵抗系公羊羔(N＝48)在2001年三月對(duì)多種Aspin制備物的特異性IgE反應(yīng)性

天然和重組Tco-Aspin鑒定了約58-60％的抵抗系公羊羔為Aspin IgE陽性。在那些對(duì)天然Aspin陽性的血清樣本中，重組Tco-Aspin和Oc-Aspin鑒定出96.4％，Hc-Aspin鑒定出42.9％。Oc-Aspin還鑒定出27.1％的血清樣本為Aspin IgE陽性。Tco-Aspin的截短形式(Tco-Aspin*)鑒定出45.8％的抵抗系公羊羔，天然Tco-Aspin鑒定出那些動(dòng)物的71.4％。Tco-Aspin和Tco-Aspin*之間的比較提示，大多數(shù)IgE表位出現(xiàn)在Tco-Aspin的截短形式上。我們得出結(jié)論，重組Tco-Aspin在鑒定Aspin IgE陽性動(dòng)物時(shí)象天然蛇形毛圓線蟲Aspin一樣有效。重組環(huán)紋奧斯特線蟲可以更有用，因?yàn)樗鼘⒏鄶?shù)量的綿羊鑒定為Aspin陽性動(dòng)物。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Aspin在鑒定Aspin陽性動(dòng)物方面不太有用。
本發(fā)明的各方面僅通過例子來描述，并且應(yīng)該理解可對(duì)其作修改和添加而不偏離權(quán)利要求的范圍。
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序列表<110>奧維塔有限公司(Ovita Limited)理查德.J.肖(Shaw，Richard John)瑪格麗特.M.麥克尼爾(McNeill，Margaret Mary)戴維.R.馬斯(Maass，David Richard)查爾斯.B.休梅克(Shoemaker，Charles Bix)<120>作為線蟲變應(yīng)原的天冬氨酰蛋白酶抑制劑<130>31230<140>521434<141>2002-09-13<150>NZ 523777<151>2003-01-24<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>228<212>PRT<213>蛇形毛圓線蟲(Trichostrongylus colubriformis)<400>1Met Lys Leu Ile Glu Leu Cys Val Leu Cys Ala Ile Ala Phe Ala Ala1 5 10 15Pro Arg Gln Lys Arg Leu Thr Val Gly Thr Ile Ala Val Thr Gly Gly20 25 30Val Gly Gly Ala Ser Gly Cys Val Val Thr Gly Asn Val Leu Tyr Ala35 40 45Asn Gly Phe Arg Leu Arg Glu Leu Ser Ala Ser Glu Gln Gln Glu Leu50 55 60Thr Asn Tyr Glu Lys Gln Val Ala Glu Tyr Lys Ala Ser Val Lys Gln65 70 75 80Ile Leu Lys Glu Arg Gln Glu Lys Leu Lys Ser Arg Met Ser Gly Lys85 90 95Lys Glu Glu Lys Ala Ala Val Thr Ser Thr Lys Asp Glu Asp Leu Pro100 105 110Lys Pro Pro Gln Lys Pro Ser Phe Cys Thr Glu Asp Asp Thr Thr Gln115 120 125Phe Tyr Phe Asp Gly Cys Met Val Gln Gly Asn Lys Val Tyr Val Gly130 135 140Asn Thr Phe Ala Arg Asp Leu Asp Gln Asn Glu Ile Glu Glu Leu Lys145 150 155 160
Glu Phe Glu Lys Lys Gln Thr Val Tyr Gln Glu Tyr Val Gln Lys Gln165 170 175Ile Gln Gln Gln Val Ser Asn Leu Phe Gly Gly Ala Asp Phe Phe Ser180 185 190Ser Phe Phe Gly Asp Ala Lys Asp Gln Thr Thr Thr Thr Val Ala Pro195 200 205Val Leu Pro Glu Asp Ala Pro Glu Gln Pro Ala Val Pro Asn Phe Cys210 215 220Thr Arg Ile Tyr225<210>2<211>684<212>DNA<213>蛇形毛圓線蟲(Trichostrongylus colubriformis)<400>2atgaagttga tcgagctgtg tgttctgtgt gcaatcgctt ttgctgcacc aagacagaaa 60cgccttactg tgggcacgat tgctgtcacc ggaggggtcg gcggagcatc aggctgtgta120gttactggaa atgttctcta tgcaaatggt ttccgccttc gcgagctcag cgcatcggag180cagcaggaac tgacgaacta cgagaagcag gtggctgaat ataaagcgtc tgtgaagcaa240atactcaagg agcgccagga aaaactgaag tctcgtatgt ccggtaagaa agaggagaag300gctgccgtaa cttccacgaa ggacgaggac ttgccgaaac caccacaaaa gccctcattc360tgcactgagg acgatacgac acaattctac tttgatggat gcatggttca gggcaacaag420gtctacgttg gcaacacatt cgcccgtgat ctggaccaga atgaaattga agagttgaag480gagtttgaga agaagcagac tgtctatcag gagtacgtcc agaagcaaat ccaacagcaa540gtaagcaacc tcttcggtgg tgctgacttc ttctcatcat tctttggaga tgccaaggat600cagactacca caactgtggc ccctgttctc cctgaagatg ccccagaaca accagctgta660ccgaacttct gcacgaggat ctat 684<210>3<211>145<212>PRT<213>蛇形毛圓線蟲(Trichostrongylus colubriformis)<400>3Met Leu Thr Val Gly Thr Ile Ala Val Thr Gly Gly Val Gly Gly Ala1 5 10 15Ser Gly Cys Val Val Thr Gly Asn Val Leu Tyr Ala Asn Gly Phe Arg20 25 30Leu Arg Glu Leu Ser Ala Ser Glu Gln Gln Glu Leu Thr Asn Tyr Glu35 40 45Lys Gln Val Ala Glu Tyr Lys Ala Ser Val Lys Gln Ile Leu Lys Glu50 55 60
Arg Gln Glu Lys Leu Lys Ser Arg Met Ser Gly Lys Lys Glu Glu Lys65 70 75 80Ala Ala Val Thr Ser Thr Lys Asp Glu Asp Leu Pro Lys Pro Pro Gln85 90 95Lys Pro Ser Phe Cys Thr Glu Asp Asp Thr Thr Gln Phe Tyr Phe Asp100 105 110Gly Cys Met Val Gln Gly Asn Lys Val Tyr Val Gly Asn Thr Phe Ala115 120 125Arg Asp Leu Asp Gln Asn Glu Ile Glu Glu Leu Lys Glu Phe Glu Lys130 135 140Lys145<210>4<211>435<212>DNA<213>蛇形毛圓線蟲(Trichostrongylus colubriformis)<400>4atgcttactg tgggcacgat tgctgtcacc ggaggggtcg gcggagcatc aggctgtgta 60gttactggaa atgttctcta tgcaaatggt ttccgccttc gcgagctcag cgcatcggag120cagcaggaac tgacgaacta cgagaagcag gtggctgaat ataaagcgtc tgtgaagcaa180atactcaagg agcgccagga aaaactgaag tctcgtatgt ccggtaagaa agaggagaag240gctgccgtaa cttccacgaa ggacgaggac ttgccgaaac caccacaaaa gccctcattc300tgcactgagg acgatacgac acaattctac tttgatggat gcatggttca gggcaacaag360gtctacgttg gcaacacatt cgcccgtgat ctggaccaga atgaaattga agagttgaag420gagtttgaga agaag 435<210>5<211>227<212>PRT<213>環(huán)紋奧斯特線蟲(Ostertagia circumcincta)<400>5Met Lys Leu Val Val Leu Cys Val Leu Cys Gly Ile Ala Leu Ala Ala1 5 10 15Pro Arg Gln Lys Arg Leu Thr Val Gly Thr Ile Ala Val Thr Gly Gly20 25 30Val Gly Gly Ser Thr Gly Cys Val Val Thr Gly Asn Val Leu Tyr Ala35 40 45Asn Gly Phe Arg Leu Arg Glu Leu Asn Pro Ser Glu Gln Gln Glu Leu50 55 60Val Asn Tyr Glu Lys Gln Val Ala Asp Tyr Lys Ala Ala Val Lys Gln
65 70 75 80Ala Leu Lys Glu Arg Gln Glu Ser Leu Lys Ser Arg Met Ala Gly Lys85 90 95Lys Glu Lys Ala Val Thr Pro Lys Glu Glu Asp Leu Pro Lys Ala Pro100 105 110Gln Lys Pro Ser Phe Cys Thr Glu Glu Asp Thr Thr Gln Phe Tyr Phe115 120 125Asp Gly Cys Met Val Gln Gly Asn Lys Val Tyr Val Gly Asn Thr Phe130 135 140Ala Arg Asp Leu Asp Gln Asn Glu Ile Gln Glu Leu Lys Glu Phe Glu145 150 155 160Lys Lys Gln Thr Val Tyr Gln Glu Tyr Val Gln Lys Gln Ile Gln Ala165 170 175Gln Val Ser Asn Leu Phe Gly Gly Ala Asp Phe Phe Ser Thr Phe Phe180 185 190Asn Gly Gly Ser Glu Lys Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ala Ala Pro Val195 200 205Leu Pro Asp Asp Ala Pro Glu Gln Pro Ala Val Pro Asn Phe Cys Thr210 215 220Arg Ile Tyr225<210>6<211>681<212>DNA<213>環(huán)紋奧斯特線蟲(Ostertagia circumcincta)<400>6atgaagttgg tcgtactgtg cgttctgtgt ggaatcgctc tcgctgcccc aagacagaaa 60cgccttactg tgggcacaat cgctgtcacc ggaggagtcg gcggatccac agggtgtgtg120gtgactggaa atgtgctcta tgcaaacggt ttccgccttc gtgagctcaa cccatcagag180cagcaggaac tcgtgaacta tgagaagcaa gtggccgact acaaagcggc tgtgaagcaa240gccctgaagg aacgccagga gagcctgaaa tcgcgtatgg ctggtaagaa ggagaaggct300gtaactccca aagaggaaga cctaccaaaa gctccacaga agccctcatt ctgcactgag360gaagacacca ctcaattcta ttttgatgga tgcatggttc agggcaacaa ggtctacgtt420ggcaacacct tcgcgcgtga tttggaccag aacgagattc aagagttgaa ggagtttgag480aagaagcaga ctgtctacca ggaatacgtc cagaagcaga ttcaagcgca agtgagcaat540ctgttcggcg gtgccgactt cttctcgacg ttcttcaatg gcggatctga gaaaggctct600tccaccacca ccgcagctcc agtacttccc gatgatgcac cagaacaacc agctgtgccc660aacttttgca caaggatcta t 681<210>7<211>226<212>PRT
<213>捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)<400>7Met Lys Leu Val Val Leu Cys Val Leu Cys Gly Ile Ala Phe Ala Ala1 5 10 15Pro Arg Gln Lys Arg Leu Thr Val Gly Thr Ile Ser Val Thr Gly Gly20 25 30Val Gly Gly Ser Thr Gly Cys Val Val Thr Gly Asn Val Leu Tyr Ala35 40 45Asn Gly Phe Arg Leu Arg Glu Leu Thr Ser Ser Glu Gln Gln Glu Leu50 55 60Val Asn Tyr Gly Lys Gln Val Ala Asp Tyr Lys Glu Ala Val Lys Lys65 70 75 80Ala Leu Lys Glu Arg Gln Glu Ser Leu Lys Ala Arg Met Ala Gly Lys85 90 95Lys Glu Lys Ala Val Thr Pro Lys Glu Glu Asp Leu Pro Lys Ala Pro100 105 110Glu Lys Pro Ser Phe Cys Thr Glu Asp Asp Thr Thr Gln Phe Tyr Phe115 120 125Asp Gly Cys Met Val Gln Ser Asn Lys Val Tyr Val Gly Asn Thr Phe130 135 140Ala Arg Asp Leu Asp His Asn Glu Ile Gln Glu Leu Lys Glu Phe Glu145 150 155 160Lys Lys Gln Thr Val Tyr Gln Glu Tyr Val Gln Lys Gln Ile Gln Gln165 170 175Gln Val Thr Asn Leu Phe Gly Gly Ala Asp Phe Phe Ser Ser Leu Phe180 185 190Asn Gly Ala Ser Lys Asp Ala Thr Thr Thr Thr Val Ala Pro Ala Leu195 200 205Pro Asp Asp Ala Pro Glu Gln Pro Pro Val Pro Asn Phe Cys Thr Arg210 215 220Ile Tyr225<210>8<211>678<212>DNA<213>捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)<400>8atgaagttgg tcgtgctctg cgttctgtgt ggaatcgctt ttgcagcacc cagacagaag 60cgcctcactg tgggcacgat ctccgttact ggaggagttg gtggttccac aggatgtgta120gtaactggta atgtgcttta cgcaaatgga ttccgcctac gtgagcttac ttcatcggaa180cagcaggaat tggtaaacta tgggaagcag gtggctgatt ataaagaggc tgtgaagaag240
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權(quán)利要求
1.分離的多肽，其包含a)SEQ ID NO.1，3，5或7任一的氨基酸序列；或b)上述a)的多肽的功能片段或變體，其中所述片段或變體在動(dòng)物中激發(fā)體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)，并且所述反應(yīng)的特征類似如上所述的多肽所產(chǎn)生的那些。
2.權(quán)利要求1所述的分離的多肽，其中所述功能片段或變體摻入了所述多肽的B細(xì)胞或T細(xì)胞表位。
3.分離的核酸分子，其中所述分子a)包含SEQ ID NO.2，4，6或8任一的核苷酸序列；b)是a)的分子的功能片段或變體；或c)能在嚴(yán)格條件下與a)或b)的分子雜交；或d)是a)，b)或c)限定的分子的互補(bǔ)體；或e)是對(duì)應(yīng)于a)-d)的任一序列的反義序列。
4.分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求1或2所述的多肽。
5.載體或構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求4所述的核酸分子。
6.宿主細(xì)胞，其已經(jīng)用權(quán)利要求5所述的載體或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。
7.分離的配體，其結(jié)合權(quán)利要求1或2所述的多肽。
8.探針，其能夠在嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求3或4所述的核酸分子雜交。
9.探針，其針對(duì)權(quán)利要求1或2所述的多肽。
10.探針，其針對(duì)權(quán)利要求7的配體，并且該配體為在與所述多肽結(jié)合時(shí)的配體。
11.確定動(dòng)物對(duì)線蟲感染的免疫狀態(tài)的方法，其特征在于如下步驟a)從所述動(dòng)物獲得血液或血清樣本；b)制備步驟a)中樣本的IgE富集或IgG耗竭的制備物；c)使步驟a)的樣本接觸包含SEQ ID NO.1，3，5或7任一的氨基酸序列或其功能片段或變體的多肽；d)使步驟c)的制備物接觸探針，該探針針對(duì)IgE和所述多肽形成的免疫復(fù)合物；e)檢測(cè)所述探針，通過所述探針的存在與否來鑒定所述動(dòng)物的免疫狀態(tài)。
12.確定動(dòng)物對(duì)線蟲感染的免疫狀態(tài)的方法，其特征在于如下步驟a)從所述動(dòng)物獲得血液或血清樣本；b)制備步驟a)中樣本的IgE富集或IgG耗竭的制備物；c)使步驟b)的制備物暴露于包含SEQ ID NO.1，3，5或7任一的氨基酸序列或其功能片段或變體的多肽；d)洗滌步驟c)的制備物以便去除任何未結(jié)合的IgE(即未結(jié)合所述多肽的IgE)；e)用抗IgE的單克隆抗體檢測(cè)所述多肽和IgE在步驟c)形成的免疫復(fù)合物；f)用合適標(biāo)記的抗-抗體檢測(cè)IgE。
13.確定動(dòng)物的免疫狀態(tài)的方法，其包含如下步驟a)使所述動(dòng)物皮膚的一部分暴露于包含SEQ ID NO.1，3，5或7的氨基酸序列或其功能片段或變體的多肽；b)通過免疫反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)存在與否來確定免疫狀態(tài)。
14.選擇性繁殖抵抗線蟲感染的動(dòng)物的方法，其特征在于如下步驟a)確定雄性和雌性動(dòng)物的免疫狀態(tài)；b)選擇易于發(fā)展對(duì)線蟲的免疫抗性的雄性和雌性；c)使用所選擇的動(dòng)物來繁殖抵抗所述感染的后代。
15.權(quán)利要求1或2所述的分離的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO.5的功能片段或變體，其與SEQ ID NO.5至少90％同源。
16.權(quán)利要求3所述的分離的多肽，其中所述分子是SEQ ID NO.6的功能片段或變體，其與SEQ ID NO.6至少94％同源。
17.權(quán)利要求1或2所述的分離的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO.1的功能片段或變體，其與SEQ ID NO.1至少基本75％同源。
18.權(quán)利要求3所述的分離的多肽，其中所述分子是SEQ ID NO.2的功能片段或變體，其與SEQ ID NO.2至少基本70％同源。
19.權(quán)利要求1或2所述的分離的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO.3的功能片段或變體，其與SEQ ID NO.3至少80％同源。
20.權(quán)利要求3所述的分離的多肽，其中所述分子是SEQID NO.4的功能片段或變體，其與SEQ ID NO.4至少基本70％同源。
21.權(quán)利要求1或2所述的分離的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO.7的功能片段或變體，其與SEQ ID NO.7至少80％同源。
22.權(quán)利要求3所述的分離的多肽，其中所述分子是SEQ ID NO.8的功能片段或變體，其與SEQ ID NO.8至少75％同源。
全文摘要
本發(fā)明廣泛涉及新的線蟲變應(yīng)原(多肽)和相關(guān)的氨基酸和核苷酸序列包括其功能片段和變體，來鑒定能夠變成天然抵抗線蟲的動(dòng)物。特別是本發(fā)明涉及這些分子在選擇性繁殖能夠變成天然抵抗線蟲感染的動(dòng)物中的輔助用途。更特別的是，本發(fā)明涉及核酸分子和多肽在鑒定先天對(duì)線蟲更易感的動(dòng)物中的用途，所述核酸分子和多肽與如下天冬氨酰蛋白酶抑制劑相同或是其功能變體蛇形毛圓線蟲的(Tco－Aspin)；和/或環(huán)紋奧斯特線蟲的(Oc－Aspin)；和/或捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的(Hc－Aspin)。
文檔編號(hào)C12NGK1714152SQ03825111
公開日2005年12月28日 申請(qǐng)日期2003年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月13日
發(fā)明者瑪格麗特·M·麥克尼爾, 理查德·J·肖, 戴維·R·馬斯, 查爾斯·B·休梅克 申請(qǐng)人:奧維塔有限公司