專利名稱：增強骨礦化的nell－1的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及NELL-1的上調(diào)可以提高骨鈣化的發(fā)現(xiàn)。因此NELL-1為篩選骨鈣化調(diào)節(jié)劑提供了一個好的目標物。另外，NELL-1蛋白質(zhì)可以與骨生成蛋白類似的方法來促進骨修復。
背景技術：
每3000個嬰兒中就有1個受到先天性非綜合癥性顱縫閉合(CS)，即先天性的頭蓋骨縫閉合的影響，并且其是人類最常見的先天性顱面畸形之一(1)?？梢詫е骂^蓋畸形的先天性骨縫閉合或源于家族或為偶發(fā)。性別和種族都不能用來預測哪一個胎兒會受到影響。雖然與CS相關的綜合病癥的基因連接分析已經(jīng)提供出很多關于骨縫形成的分子控制、局部骨縫閉合的生物學、特別是綜合病癥的信息，但是非家族性CS的大部分仍然是未知的。
目前，已經(jīng)將超過85個可以產(chǎn)生不同家族性CS綜合病癥的人類突變定位于FGF受體基因FGFR1、FGFR2和FGFR3。所有的都是導致受體活性(1)增加的“功能獲得”突變。人類CS綜合病癥與FGF配體沒有關系；但是，有幾種CS的動物模型和FGF過度表達有關(2，3)。唯一描述的與CS(4)相關的MSX2突變也導致MSX2活性的增加(5-7)。這些候選基因不僅公知為在造骨細胞的增殖和分化過程中發(fā)揮重要的作用，其還在胎兒的形成過程中發(fā)揮著更廣泛的作用。因此，對帶有這些基因突變的轉(zhuǎn)基因鼠模型通常顯示出在CS病人上觀察不到的顱外畸形并不意外(1，2，8)。
人類CS先天性骨縫閉合可以分為兩個可能不同的過程頭蓋過度生長和骨融合。雖然頭蓋過度生長可能對為誘導骨融合而使兩個相反的骨質(zhì)前端接近有重要意義，但是頭蓋骨過度生產(chǎn)或重疊將會導致骨融合并不是必然的。因此，對先天性骨縫閉合機理的研究必須包括對頭蓋骨過度生長/重疊以及骨融合的研究。
最近，已經(jīng)通過CBFA1-媒介路徑在頭蓋骨縫融合中對FGF2和FGFR1進行暗示(8)。CBFA1的錯義突變和頭蓋發(fā)育異常有關，顯示為延遲的骨縫閉合(9)。因此，CbBfa1(Runx2)的檢查，也就是作為對骨形成非常重要的Fgfr1下游目標可能是理解CS信號流的關鍵。另外，在CS(5，6)的動物模型中，對Msx2，也就是作為在發(fā)展過程中帶有多向性的保存完好的Msx同源異形盒基因族中的一員進行了暗示。明確地，增強的骨質(zhì)細胞增殖被認為是Msx2-過度表達的轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)先天性骨縫閉合的機理，其表現(xiàn)為沒有骨縫融合的骨縫過度生長/重疊。
發(fā)明概述 為了闡明骨縫閉合的分子路徑，我們以前使用差異顯示來鑒別在非家族性、非綜合病癥CS病人中的反常融合骨縫中被特異性上調(diào)的基因。我們分離并且鑒別為Nel樣、類型1分子(一種在神經(jīng)組織中強烈表達的蛋白質(zhì)，編碼為EGF樣區(qū)域)的NELL-1(10-12)。Nell-1是一種分泌的蛋白質(zhì)。在結構上，Nell-1編碼一種分泌的信號肽序列，一個NH2-末端血小板凝血酶敏感蛋白-1(thrombospondin-1)-類的模塊，五個維勒布蘭德因子-如重復六個半胱氨酸殘基，和六個EGF樣區(qū)域。Nell-1還能在不同物種中得到高度地保留。例如，鼠Nell-1和人Nell-1之間存有93％的同源氨基酸。
Nell-1編碼一條分子重量為90kDa的多肽。當在COS細胞中過度表達時，在真核細胞中，糖基化形式與50-kDa醣類部分進行N-連接，以產(chǎn)生在細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的140-kDa形式。140-kDa蛋白質(zhì)進一步被加工為130-kDa蛋白質(zhì)。Nell-1蛋白質(zhì)被分泌為具有很大分子量(約400kDa)的三聚形式(13，14)。
最初的研究暗示優(yōu)先在顱蓋組織的顱面區(qū)域表達NELL-1(12-14)。通過骨質(zhì)區(qū)域的造骨細胞樣的過度表達程度使CS病人的先天性骨縫閉合很明顯。雖然NELL-1過度表達和先天性骨縫閉合可能是巧合，但是我們的數(shù)據(jù)顯示Nell-1可能是頭蓋骨縫閉合的一個局部調(diào)整因子。在研究中，我們進一步證實了Nell-1在CS中有重要作用。我們制作了一個顯示使Nell-1的過度表達泛化的轉(zhuǎn)基因鼠模型。Nell-1轉(zhuǎn)基因動物與帶有CS的人類有很多共性。它們顯示出顱蓋的過度生長/重疊和先天性骨縫閉合。被Nell-1腺病毒(adenoviral)構成物感染的造骨細胞顯示出Nell-1提高以及加快了造骨細胞的分化。另外，Nell-1下調(diào)抑止造骨細胞的分化。因此，Nell-1代表了產(chǎn)生頭蓋骨縫閉合的候選基因，以及為CS研究和顱面發(fā)展提供了新的視野。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種調(diào)節(jié)顱面造骨細胞分化和礦化的方法。所述方法包括改變Nell-1的表達或活性，其Nell-1增加的表達和活性會增加造骨細胞分化或礦化，Nell-1減少的表達和活性會減少造骨細胞分化或礦化?？梢酝ㄟ^任何方便的方法(例如，反-Nell-1反義分子，Nell-1特異性酶核(specific riibozyme)，nell-1特異性催化性DNA，Nell-1特異性RNAi，反-Nell-1胞內(nèi)抗體，和在特異性目標的細胞和/或組織中敲除Nell-1的基因治療方法)來抑止Nell-1的表達或活性。類似的，可以通過任何一種方便的方法(例如，通過用表達Nell-1的外源核酸轉(zhuǎn)染細胞，用Nell-1蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染細胞等)來提高Nell-1的表達和活性。哺乳動物可能是經(jīng)歷過反常頭蓋骨縫發(fā)育(例如先天性的頭蓋骨縫閉合(CS))的哺乳動物(人類或者非人類哺乳動物)。
本發(fā)明還提供一種促進哺乳動物體內(nèi)潛在TGF-β1活化的方法。該方法包括使哺乳動物服用外源Nell-1，或者增加所述哺乳動物體內(nèi)內(nèi)源Nell-1的表達活性。
本發(fā)明還提供一種活化或螯合哺乳動物體內(nèi)TGF-β超家族成員的方法。該方法包括使哺乳動物服用外源Nell-1，或者增加哺乳動物體內(nèi)內(nèi)源Nell-1的表達活性。
在另外一個實施方案中，本發(fā)明提供一種對調(diào)整造骨細胞分化的試劑進行篩選的方法。該方法包括使含有NELL-1基因的測試細胞和測試試劑接觸；并且檢測測試細胞中NELL-1基因表達水平或Nell-1基因活性的改變，將其與對照細胞中Nell-1基因的表達水平或活性進行比較，其中測試細胞和對照細胞中的NELL-1的表達水平或者Nell-1活性的差異顯示出所述藥劑調(diào)整骨礦化。在某些實施方案中，對照是在比測試細胞濃度低的情況下與測試試劑接觸(例如，半濃度，沒有試劑等)的陰性對照細胞。在某些實施方案中，對照是在比測試細胞濃度高的情況下與試劑接觸的陽性對照細胞。在不同的實施方案中，通過測量所述細胞中NELL-1mRNA水平來檢測nell-1的表達水平和/或如這里所描述的，通過測量生物細胞中NELL-1蛋白質(zhì)的表達水平來檢測NELL-1的水平。
在另外一個實施例中，本發(fā)明提供一種調(diào)整哺乳動物細胞內(nèi)Nell-1表達的方法。該方法包括變化Msx2和/或Cbfa1的表達或活性。在某些實施例中，上調(diào)Cbfa1的表達或活性來上調(diào)Nell-1的表達或活性。在某些實施例中，上調(diào)Msx2的表達或活性來下調(diào)Nell-1的表達或活性。
類似的，提供調(diào)節(jié)Nell-1表達或活性的試劑的篩選方法，所述方法包括使含有Msx2和/或Cbfa1基因的測試細胞和測試試劑接觸；并且檢測所述測試細胞中Cbfa1和/或Msx2基因表達水平或Cbfa1和/或Msx2基因活性的變化，將其與對照細胞中的Cbfa1和/或Msx2基因的表達水平或Cbfa1和/或Msx2基因的活性相對照，其測試細胞和對照細胞之間的Cbfa1和/或Msx2基因的表達水平或CBfa1和/或Msx2基因的活性的差異顯示出該藥劑調(diào)整Nell-1的表達或活性。
本發(fā)明還提供一種藥物配方，包括一種或者多種選自編碼Nell-1蛋白質(zhì)的核酸，Nell-1蛋白質(zhì)或改變Nell-1蛋白質(zhì)活性或表達的藥劑的活性劑；和藥學上可以接受的賦型劑。
在另外一個實施例中，本發(fā)明涉及由人類NELL-1基因編碼的多肽誘導骨鈣化以及因此為骨質(zhì)的發(fā)現(xiàn)。NELL-1基因和基因產(chǎn)品(例如mRNA，cDNA，蛋白質(zhì)等)為篩選NELL-1表達和/或活性調(diào)節(jié)劑、以及由此篩選骨鈣化調(diào)節(jié)劑提供了一個目標物。另外，可以將NELL-1用于與骨形成素蛋白質(zhì)(BMPS)類似的方法中來加速骨折修復，以及作為骨移植材料的成分。
如一個優(yōu)選實施方案所示，本發(fā)明提供一種用于篩選調(diào)節(jié)骨鈣化的試劑的方法。該方法包括使含有NELL-1基因的細胞和測試試劑接觸；并且檢測NELL-1基因表達水平的改變，以及將其與細胞中未與測試試劑接觸的NELL-1基因的表達相對比，與測試試劑接觸和未接觸的在細胞中的NELL-1表達水平的差異(例如普通DNA復制數(shù)量，mRNA水平，蛋白質(zhì)水平，蛋白質(zhì)活性等)顯示出所述試劑調(diào)整骨礦化。該方法可以進一步包括改變NELL-1活性調(diào)節(jié)器數(shù)據(jù)庫或骨礦化調(diào)節(jié)器數(shù)據(jù)庫中NELL-1核酸或NELL-1蛋白質(zhì)表達的測試試劑。在實施方案中，通過測量細胞中NELL-1mRNA的水平(例如，通過將所述的mRNA與和特異性NELL-1核酸雜交的探針雜交)來檢測NELL-1的表達水平。優(yōu)選的雜交方法包括但不限于Northern吸印雜交，使用從NELL-1RNA得到的Southern印跡雜交，雜交點陣，親合色譜法和原位雜交。本發(fā)明方法以點陣為基礎進行檢驗。因此，一些實施方案中，探針是形成探針點陣中多個探針中的一員。還可以通過核酸擴增反應(例如PCR)來測定NELL-1的表達水平。
在本發(fā)明的篩選系統(tǒng)的其他實施方案中，通過測定生物樣品中NELL-1蛋白質(zhì)(例如通過毛細管電泳，Western印跡，質(zhì)譜，ELISA，色譜，免疫層析法，免疫組織化學)的表達水平來檢測NELL-1表達。細胞可以是體外培養(yǎng)的或體內(nèi)或原位。一些實施例中，測試試劑不是抗體和/或蛋白質(zhì)和/或核酸。優(yōu)選的測試試劑是有機小分子。
本發(fā)明還提供一種預先篩選潛在的NELL-1表達和/或活性的調(diào)節(jié)劑的方法。該方法包括使NELL-1核酸或NELL-1蛋白質(zhì)與測試試劑接觸；并且檢測所述測試試劑與NELL-1蛋白質(zhì)或NELL-1核酸之間的特異性鍵。該方法進一步包括記錄和NELL-1活性候選調(diào)節(jié)器數(shù)據(jù)庫和/或骨礦化候選調(diào)節(jié)器數(shù)據(jù)庫中NELL-1核酸或NELL-1蛋白質(zhì)特異性結合的測試試劑。所述測試試劑可以直接與NELL-1蛋白質(zhì)或NELL-1核酸，或含有核酸或蛋白質(zhì)的細胞和/或組織和/或生物體(例如哺乳動物)接觸。當接觸細胞時，細胞可以在主要的或階段的培養(yǎng)物中。一些實施方案中，所述測試試劑不是抗體和/或不是蛋白質(zhì)和/或不是核酸。優(yōu)選的試劑是有機小分子。當測定測試試劑結合核酸的能力時，優(yōu)選采用Northern吸印雜交，使用DNA的Southern印跡雜交，雜交陣，親合色譜法或原位雜交。當測定測試試劑結合NELL-1蛋白質(zhì)的能力時，優(yōu)選采用毛細管電泳，Western印跡，質(zhì)譜，ELISA，免疫層析法或者免疫組織化學。) 在另外一個實施例中，本發(fā)明提供了一種增強骨礦化的方法。優(yōu)選的方法包括增加骨質(zhì)細胞(例如造骨細胞，間質(zhì)細胞，成纖維細胞，胎兒胚細胞，干細胞，骨髓細胞，硬腦膜細胞，軟骨細胞，成軟骨細胞等)中或發(fā)現(xiàn)該細胞的環(huán)境中的NELL-1基因產(chǎn)品的濃度。在一個優(yōu)選的實施方案中，通過上調(diào)NELL-1基因的表達增加NELL-1基因的濃度。這可以通過很多種方法來完成，包括但不限于上調(diào)內(nèi)源NELL-1基因的表達(例如通過修改內(nèi)源的調(diào)整區(qū)域，如啟動子)，或用含有表達NELL-1蛋白質(zhì)的載體轉(zhuǎn)染細胞。當其他優(yōu)選載體為可誘導時，某些優(yōu)選載體基本上表達NELL-1蛋白質(zhì)。在另外一個實施方案中，通過含有NELL-1多肽的骨來增加NELL-1基因產(chǎn)品的濃度。
本發(fā)明還提供一種促進骨折修復的方法。該方法包括增加骨折位置或其周圍NELL-1基因產(chǎn)品的濃度。優(yōu)選的實施方案中，增加骨折位置上或周圍的成骨質(zhì)或骨祖細胞中的NELL-1基因產(chǎn)品。該方法可以包括將過度表達NELL-1的成骨質(zhì)或骨祖細胞引入到骨折位置。在另一個實施例中，本發(fā)明包括增加原位成骨質(zhì)細胞或所述骨祖細胞的NELL-1基因濃度。可以通過這里的描述來實現(xiàn)NELL-1基因產(chǎn)品的上調(diào)。在另一個實施方案中，使細胞和/或骨折位置與NELL-1多肽接觸。
在修復骨折的另一方面中，使骨折位置與NELL-1蛋白質(zhì)接觸。可以通過細胞(例如通過引入過度表達NELL-1蛋白質(zhì)而引導的)和/或通過單獨服用蛋白質(zhì)或連同藥學賦型劑一起服用，和/或服用能夠表達NELL-1的“裸露DNA”載體來產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)。NELL-1蛋白質(zhì)可以作為骨修復/骨移植的材料成分和/或假肢器官裝置的一部分。一個優(yōu)選的移植材料在NELL-1蛋白質(zhì)和/或表達NELL-1蛋白質(zhì)的細胞以外還包括骨膠原和/或骨片段。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種能夠增強被移植動物的骨組織結構的骨移植材料。優(yōu)選的骨移植材料基本上包括生物適合的基質(zhì)和NELL-1蛋白質(zhì)。優(yōu)選的移植材料是可以重復吸收/生物降解的。此外，所述的基質(zhì)可以充滿NELL-1蛋白質(zhì)和/或表達NELL-1蛋白質(zhì)的細胞。優(yōu)選的骨移植材料包括含有(例如約65到約95重量百分比)充分均勻分散的再生骨膠原；和(例如約35到約5重量百分比)NELL-1蛋白質(zhì)和/或表達NELL-1蛋白質(zhì)的細胞的骨膠原軛合物。
定義 術語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在這里可替交地用來表示氨基酸殘基的聚合物。這些術語用于指代其中一個或多個氨基酸殘基是相應天然氨基酸的人造化學類似物，和天然存在的的氨基酸聚合物的氨基酸聚合物。
術語“NELL-1 cDNA”和“NELL-1”基因組DNA指由Watanabe等人(1996)Genomics 38(3)273-276；汀等人(1999)J BoneMineral Res，1480-89；和GENBANK Accession Number U57523)中所公開的cDNA和基因組DNA。
NELL-1蛋白質(zhì)是指由NELL-1基因或cDNA表達的蛋白質(zhì)。NELL-1蛋白質(zhì)可以包括具有誘導骨礦化能力的蛋白質(zhì)片段。
這里使用的術語“抗體”包括各種形式的修正過或改變的抗體，如完整的免疫球蛋白，只含有輕鏈和重鏈可變區(qū)的Fv片段，通過二硫鍵結合的Fv片段(Brinkmann等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90547-551)，含有可變區(qū)和部分恒定區(qū)的Fab或(Fab)′2片段，單鏈抗體等(Bird等人(1988)Science 242424-426；Huston等人(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 855879-5883)?？贵w可以來自動物(特別是小鼠或大鼠)或者人或者是嵌合的(Morrison等人(1984)Proc Nat.Acad.Sci.USA 816851-6855)或人源化(Jones等人(1986)Nature 321522-525，和出版的英國專利#8707252)。
術語“結合部分”或“捕獲劑”或“結合對”成員是指和其他分子特異性結合以形成結合絡合物的分子，如抗體-抗原、外源凝集素-碳水化合物、核酸-核酸、生物素-抗生物素蛋白質(zhì)等。
當涉及到生物分子(例如蛋白質(zhì)，核酸，抗體等)時，這里使用的術語“特異性結合”是指對生物分子在不同種類的分子(例如蛋白質(zhì)和其他生物制劑)中的存在起決定作用的結合反應。因此，在給定的條件下(例如在有抗體情況下的免疫測定或在核酸存在條件下的嚴格雜交條件)，特異性的配體或抗體與特異性的“靶”分子結合，而不會大量的和樣品中存在的其他分子結合。
術語骨質(zhì)疏松癥指特征為骨質(zhì)降低和骨折的多種病癥。臨床上，骨質(zhì)疏松癥分為類型I和類型II。類型I骨質(zhì)疏松癥主要發(fā)生在中年婦女身上，以及其是與更年期缺少雌激素有關，而類型II骨質(zhì)疏松癥卻與年紀的增加有關。
成骨不全癥(OI)是指一組特征為骨和軟結締組織脆弱的與遺傳相關的組織病(Byers & Steiner(1992)Annu.Rev.Med.43269-289；Prockop(1990)J.Biol.CHEM.26515349-15352)。男女都會同樣地受影響，現(xiàn)在所估計的總發(fā)生率是每5,000-14,000個活產(chǎn)中會有1個。聽力損失，牙本質(zhì)發(fā)育不全，呼吸不足，嚴重脊柱側凸和肺氣腫只是與一種或者多種OI相關的一些情形而已。雖然無法得到準確的衛(wèi)生保健成本，但是與OI有關的發(fā)病率和死亡率肯定是由極端的骨折(OI類型I-IV)和根由骨折修復的反常骨變形(OI類型II-IV)導致的。
這里的術語“核酸”或者“寡核苷酸”或文義上的等同物指至少兩個共價連接在一起的核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明核酸是指單鏈或雙鏈并且通常包括磷酸二酯，雖然在下列的某些情況下可以改變主鏈的核酸類似物也被包括進來，該核酸類似物包括例如磷酰胺(Beaucage等人(1993)Tetrahedron 49(10)1925)及其參考；Letsinger(1970)J.Org.Chem.353800；Sprinzl等人(1977)Eur.J.Biochem.81579；Letsinger等人(1986)Nucl.Acids Res.143487；Sawai等人(1984)CHEM.Lett.805，Letsinger等人(1988)J.Am.Chem.Soc.1104470；和Pauwels等人(1986)Chemica Scripta 261419)，硫代磷酸酯(Mag等人(1991)NucleicAcids Res.191437；和U.S.專利No.5,644,048)，二硫代磷酸酯(Briu等人(1989)J.Am.Chem.Soc.1112321，O-methylphophoroamidite結合(參見Eckstein，Oligonucleotides and AnaloguesA Practical Approach，Oxford University Press)，和肽核酸主鏈和結合(參見Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.1141895；Meier等人(1992)Chem.Int.Ed.Engl.311008；Nielsen(1993)Nature，365566；Carlsson等人(1996)Nature 380207)。其他的核酸類似物包括那些陽性主鏈(Denpcy等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 926097；非離子主鏈(U.S.專利Nos.5,386,023，5,637,684，5,602,240，5,216,141和4,469,863；Angew.(1991)Chem.Intl.Ed.English 30423；Letsinger等人(1988)J.Am.Chem.Soc.1104470；Letsinger等人(1994)Nucleoside & Nucleotide 131597；第2和3章，ASCSymposium Series 580，″Carbohydrate Modifications in AntisenseResearch″，Ed.Y.S.Sanghui and P.Dan Cook；Mesmaeker等人(1994)，Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.4395；Jeffs等人(1994)J.Biomolecular NMR 3417；Tetrahedron Lett.37743(1996))和非核糖主鏈，包括U.S.專利No.5,235,033和5,034,506，和第6和第7章，ASCSymposium Series 580，Carbohydrate Modifications in Antisense Research，Ed Y.S.Sanghui and P.Dan Cook里面所描述的那些。含有一種或多種環(huán)碳糖的核酸也包括在核酸的定義中(參見Jenkins等人(1995)，Chem.Soc.Rev.169-176頁)。在Rawls，C & E News June 2，199735頁描述了幾種其他核酸類似物。對核糖磷酸主鏈的修正可能有助于額外的部分例如標記的增加，或來增加這些分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和半衰期。
這里使用的術語“特異性地雜交”和“特異性的雜交”和“選擇性雜交”，是指核酸分子，特別是在嚴格條件下的核苷酸序列的結合、轉(zhuǎn)嫁、雜交。術語“嚴格條件”是指在該條件下探針優(yōu)先與其目標序列雜交，很少或者根本不會和其他序列雜交。核酸雜交上下文中的嚴格雜交和嚴格雜交的沖洗條件是有順序可依的，并且在不同的環(huán)境參數(shù)下不同。關于核酸雜交的廣泛的指導可以在，例如Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I，chapt 2，，Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays，Elsevier，NY(Tijssen)中可以找到。通常來說，高度嚴格雜交和沖洗條件選擇為對特異性序列而言在確定的離子強度和pH下低于熔點(Tm)5℃。Tm是指(在確定的離子強度和pH下)有50％的目標序列和優(yōu)選的合適探針雜交時的溫度。特別嚴格條件選擇為和特異性探針Tm相同的溫度。使用標準的雜交方法的互補核酸雜交的嚴格雜交條件的一個例子是42℃，該互補核酸在點陣或者Southern或Northern印跡過濾器上有超過100個互補殘基(參見例如Sambrook(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd Ed.)Vol.1-3，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，NY，和以下詳細的討論)，及雜交過程是在晚上完成的。高度嚴格沖洗條件的例子是在72℃下以0.15M的NaCl沖洗15分鐘。嚴格沖洗條件的例子是在65℃下以0.2x SSC沖洗15分鐘(參見例如Sambrook supra.)關于SSC緩沖器的描述)。通常，高度嚴格沖洗先通過低度嚴格沖洗來除去背景探針信號。對例如超過100個核苷酸的雙鏈的中度嚴格條件沖洗的例子是在45℃下以1x SSC沖洗15分鐘。對例如超過100個核苷酸的雙鏈的低度嚴格條件沖洗的例子是在40℃下以4x-6x SSC沖洗15分鐘。
“成骨質(zhì)細胞”是指具有礦化能力的細胞。成骨質(zhì)細胞包括造骨細胞、造骨樣細胞、間質(zhì)細胞、成纖維細胞、胎兒胚胎細胞、干細胞、骨髓細胞、硬腦膜細胞、軟骨細胞(chrondrocyes)和成軟骨細胞。
術語“測試試劑”是指在這里描述的一種或多種方法中篩選的試劑。這些試劑本質(zhì)上可能是任何化合物。其可以以單一的獨立化合物或者作為化學庫(例如組合的)的一個成員而存在。在特別優(yōu)選的實施方案中，試劑是有機小分子。
術語“有機小分子”是指尺寸可以與藥學上通常使用的有機分子相配的分子。術語不包括生物大分子(例如蛋白質(zhì)，核酸等)。優(yōu)選的有機小分子的尺寸最多約為5000Da，更優(yōu)選的是最多為2000Da，最優(yōu)選的最多為1000Da。
術語數(shù)據(jù)庫是指一種記錄和檢索信息的工具。在優(yōu)選的實施方案中，數(shù)據(jù)庫還對儲存的信息提供分類和/或搜索的方法。數(shù)據(jù)庫可以包括任何方便的媒體，包括但不限于紙系統(tǒng)、卡系統(tǒng)，機械系統(tǒng)、電子系統(tǒng)、光系統(tǒng)、磁系統(tǒng)或其混合。優(yōu)選的數(shù)據(jù)庫包括電子數(shù)據(jù)庫(例如以計算機為基礎的)。在本領域是公知的用于儲存和處理數(shù)據(jù)庫的計算機系統(tǒng)包括但不限于“個人計算機系統(tǒng)”，主機系統(tǒng)，分布在英特爾網(wǎng)/內(nèi)部網(wǎng)上的網(wǎng)點，儲存在特定硬件(例如微芯片)中的數(shù)據(jù)或數(shù)據(jù)庫。


圖1A顯示的是NELL-1在E-14大鼠顱蓋細胞原始培養(yǎng)物中的過度表達，其是以帶有β-牛乳糖的腺病毒作為對照。圖1B顯示的是NELL-1和β-牛乳糖分別處理后以時間為函數(shù)的礦化示意圖。試驗進行三次。進行了T檢驗。從統(tǒng)計上看，帶有NELL-1的礦化比帶有β-牛乳糖的礦化對照高，*P＜0.001。
圖2顯示的是Nell-1轉(zhuǎn)基因小鼠和其沒有轉(zhuǎn)基因的同窩出生仔畜的比較。(圖2A)轉(zhuǎn)基因復制數(shù)。奠基者(FA and FB)及其后裔(TF2A1，TF2A2，和TF2B1)的復制數(shù)從50到100。TF2A1和TF2A2來自奠基者A系列。TF2B1，TF2B2，和TF2B3來自奠基者B系列。(圖2B)在兩個奠基者中的Nell-1 RNA表達的RT-PCR分析。C，對照Nell-1質(zhì)粒；M，肌肉；H，心臟；B，骨；K，腎；L，肝臟。(圖2C)新生后裔整個身體(沒有頭)的RNA。TF2A1和TF2A2表達不同水平的Nell-1。當TF2B2和TF2B3沒有表達Nell-1時，TF2B1表達Nell-1很微弱。(圖2D)左邊，在新生的NF2上皮細胞、肌肉、和顱蓋骨中Nell-1蛋白質(zhì)的免疫定位。除了顱蓋骨中的一些染色外沒有檢測到Nell-1表達(褐變顯示Nell-1的存在)。右邊，Nell-1蛋白質(zhì)在TF2A2上皮細胞、肌肉、和顱蓋骨中的免疫定位。豐富的Nell-1表達遍及存在于軟組織和骨中。Bar代表50μm。
圖3為Nell-1轉(zhuǎn)基因小鼠的表現(xiàn)型分析。(a和b)左邊顯示的是新生的Nell-1表現(xiàn)型-陽性(TF2A1)小鼠。注意額頂區(qū)域的突出(箭頭)。右邊顯示的是NF2同窩出生仔畜。(c)左邊，去掉頭皮的TF2A2小鼠。矢狀的(黃箭頭)和PF(黑箭頭)骨縫是關閉的。右邊，帶有顯著的矢狀(黃箭頭)和PF(黑箭頭)骨縫以及顯著的骨縫下面的脈管系統(tǒng)的NF2同窩出生仔畜的頭骨。(d)帶有嚴重的CS、顱發(fā)育不良的嬰兒。(e)TF2A1小鼠(左)和NF2同窩出生仔畜(右)的頭部MRI。注意，與NF2同窩出生仔畜相比(箭頭，右)，TF2A1小鼠(箭頭，左)完全缺少腦室，意味著提高了頭顱壓力。(f)新生的Nell-1顯型陽性TF2A1(左)和NF2(右)同窩出生仔畜的MCT-改造頭骨三維圖。箭頭顯示矢狀和PF骨縫位置。在TF2A1小鼠中，矢狀和PF骨縫大部分閉合并且被反常的脊代替。在NF2同窩出生仔畜中，矢狀和PF骨縫都很明顯。完整的不透明與大于50mg/cc的礦化相對應。背景中的垂直柱是與50，100，150，和200mg/cc礦化密度(從左到右)相對應的幻影參考柱。(g)顯示的是f中TF2A1(左)和NF2同窩出生仔畜(右)的連續(xù)軸向MCT的截面。黃色箭頭顯示的是頭蓋骨的變形。綠色箭頭顯示的是TF2A小鼠(箭頭，右)增強礦化的頭蓋骨。
圖4是Nell-1轉(zhuǎn)基因小鼠的組織和免疫組織分析。(塊a)Nell-1顯型-陽性TF2A1小鼠矢狀骨縫的蘇木精和曙紅染色。通過顱蓋邊緣(黑箭頭)和閉合的成骨質(zhì)前方(紅箭頭)的重疊，顯示骨縫閉合。左下方顯示的是馮科薩氏(von Kossa)染色。注意閉合接近于礦化的顱蓋骨邊緣。(塊b)NF2同窩出生仔畜矢狀骨縫的蘇木精和曙紅染色。注意在明顯骨縫位置上兩個顱蓋骨邊緣(黑箭頭)分開的大距離，以及徙前(advancing)的成骨質(zhì)前額(紅箭頭)。左下方顯示的是馮科薩氏染色。黑色表示礦化。(塊c)TF2A1小鼠堿性磷酸酶(ALP)的免疫定位。布朗染色顯示的是堿性磷酸酶的存在(箭頭)。下方表示在低擴增倍數(shù)下的骨橋蛋白質(zhì)免疫定位。(塊d)上方顯示的是新生的NF2頭蓋骨縫中堿性磷酸酶的免疫定位。下方表示在低擴增倍數(shù)下的骨橋蛋白質(zhì)(OP)免疫定位。Bar表示50μm。(塊e)TF2矢狀骨縫的BrdU染色。增殖細胞的核被染成棕色(黑箭頭)。相對于d中顯示的NF2而言，增殖細胞明顯減少。(塊f)新生NF2小鼠矢狀骨縫的BrdU染色。很多染成棕色的細胞是沿開放骨縫的顱蓋邊緣和沿提高的成骨質(zhì)前方(紅箭頭)增殖的。H&E，蘇木精和曙紅。(塊g)每塊中增殖細胞的數(shù)量。
圖5是Nell-1轉(zhuǎn)基因TF2B1小鼠和非轉(zhuǎn)基因同窩出生仔畜的比較。(a)左，去掉頭皮的新生TF2B1小鼠。注意的是枕骨區(qū)域的反常凸起和相對較窄寬度的頭蓋骨。右，NF2同窩出生仔畜。在TF2B1轉(zhuǎn)基因動物中，矢狀骨縫和幾個其他骨縫是閉合的。(b)TF2B1矢狀骨縫的蘇木精和曙紅染色。骨縫的提前閉合顯示在顱蓋邊緣的嚴重重疊區(qū)(紅箭頭)。為了RNA分析已經(jīng)切除了下面的腦組織。(c)TF2B1小鼠(左)的三維MCT改造及其NF2同窩出生仔畜(右)。注意的是TF2B1小鼠(箭頭，左)的提前中線骨縫閉合區(qū)域。
圖6顯示的是Nell-1在礦化和骨標記上的過度表達效果。(圖6A)用20pfu/細胞的AdNell-1感染FRCC培養(yǎng)物，用馮科薩氏染色。用Adβ-gal感染對照細胞。進行三次試驗。將礦化點染成黑色。(圖6B)礦化區(qū)域的數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析。Ad Nell-1-感染的培養(yǎng)物顯示出相對Adβ-gal對照而言極大的礦化。(圖6C)AdNell-1-感染的MC3T3細胞在沒有抗壞血酸下生長。顯示出典型的微點形狀。右方表示的是堿性磷酸酶染色的微點。(圖6D-F)AdNell-1-感染的MC3T3細胞分別感染6，9，和12天后的微點陣。通過使用標準的看家基因(HKGs)來使基因表達強度規(guī)格化。y軸代表AdNell-1-感染細胞的雜交強度，x軸代表Adβ-gal感染細胞的雜交強度。HKGs r2表示兩個樣品之間看家基因(填充的方塊)的相互關系。ECMs r2表示兩個樣品之間的候選基因表達(空的方塊)的相互關系。每個圖形的左上角附有微點陣閱讀的照片。紅色表示二重或者更多的上調(diào)，而二重或者更多的下調(diào)用綠色(g)來表示。表格總結了有在AdNell-1感染后為二重高或者低的表達差異的基因，。根據(jù)Nell-1/β-Gal.Col，Collagen來計算該比率。
圖7顯示的是Nell-1在堿性磷酸酶上表達和骨標記上表達的下調(diào)效果。(圖7A)大鼠FRCCs內(nèi)用20pfu/細胞AdAntiNell-1或Adβ-Gal對照感染后的Nell-1 Western印跡分析。觀察到約60％的下調(diào)。(圖7B)FRCCs的堿性磷酸酶染色(紅色)。AdAntiNell-1-感染的細胞明顯比對照和AdNell-1-感染細胞染色少很多。(圖7C)感染后3，6，9，和12天后FRCCs的Northern分析。AdAntiNell-l-感染的細胞表達骨鈣素(osteocalcin)和骨橋蛋白很少。(圖7D)通過磷光顯像分析儀測定并且通過GAPDH規(guī)格化骨鈣素(osteocalcin)(OC)和骨橋蛋白(osteopontin)(OP)的表達。
圖8顯示的是提前骨縫閉合中Nell-1功能的假想模型，虛線表示潛在的調(diào)節(jié)。
具體實施例方式本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種可以促進組織(例如骨)礦化的NELL-1基因產(chǎn)品。不依據(jù)特異性的理論，預計通過與TGFβ超家族成員結合，NELL-1蛋白質(zhì)可以執(zhí)行其功能。
根據(jù)這里的描述已經(jīng)認識到NELL-1可以調(diào)節(jié)組織的礦化，NELL-1核酸和/或NELL-1蛋白質(zhì)為篩選骨礦化調(diào)節(jié)劑提供了一個方便的目標。因此，抑止NELL-1表達和/或蛋白質(zhì)活性和/或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互作用的試劑可以減少骨的礦化。相反，上調(diào)NELL-1表達和/或蛋白質(zhì)活性和/或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互作用的試劑可以增加骨的礦化。這樣的NELL-1“激動劑”預計可以用于很多情況，包括但不限于治療骨質(zhì)疏松癥、骨折復原、治療成骨不全、骨改造等。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種鑒定用來調(diào)整(例如上調(diào)或下調(diào))NELL-1表達的試劑的方法。該方法包括與NELL-1核酸，和/或含有NELL-1核酸的細胞，和/或含有NELL-1核酸的組織或生物體接觸，并且檢測NELL-1轉(zhuǎn)錄(例如mRNA)和/或NELL-1蛋白質(zhì)表達水平的變化。在一個實施方案中，通過結合方法“預篩選”來鑒定用于檢測的候選試劑。該結合方法包括預先篩選具有特異性結合NELL-1核酸和/或NELL-1蛋白質(zhì)能力的試劑。通過這些方法鑒定的可以上調(diào)NELL-1表達的試劑可用于骨質(zhì)疏松癥和骨折的治療中。
另外，以使用骨形成素蛋白質(zhì)(例如BMP-1到BMP-24)類似的方法，在自然康復很有限或者不存在的情況下，NELL-1多肽可以用來加速骨折的修復或誘導骨修復或復位。通常，這些方法包括在骨折位置增加NELL-1基因產(chǎn)品的數(shù)量?？梢酝ㄟ^一種或多種方法來增加NELL-1基因產(chǎn)品的濃度。在一種方法中，誘導骨折位置或其周圍的細胞來表達提高水平的NELL-1。例如，這些可以通過使用NELL-1表達調(diào)節(jié)劑，改變NELL-1啟動子，或通過轉(zhuǎn)染含有表達NELL-1結構的細胞來實現(xiàn)。這個也可以在細胞體內(nèi)完成，或者，在其他的實施方案中，通過修正這樣的細胞在體外過度表達NELL-1來，然后將其引回宿主生物體(例如骨折位置或其周圍)。
可以將表達或者過度表達NELL-1的細胞合并到骨移植材料中和/或可以將NELL-1多肽合并到所述骨移植材料中。這些移植材料可以用來治療骨折或促進修復術或骨移植的復位/康復。
I.對調(diào)節(jié)NELL-1表達試劑的分析 如上所述，本發(fā)明一方面以NELL-1調(diào)節(jié)骨礦化這一發(fā)現(xiàn)為前提，由此為調(diào)整骨礦化的新試劑提供了一個好的目標物。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于調(diào)整NELL-1表達及骨礦化的試劑的篩選方法。該方法包括在討論試劑存在的情況下檢測NELL-1基因或基因產(chǎn)品(例如NELL-1蛋白質(zhì))的表達水平和/或活性水平。在試劑存在的情況下，與沒有或低濃度試劑的陰性對照比較，提高的NELL-1表達水平或活性顯示出試劑可以上調(diào)NELL-1的活性或表達。相反，在試劑存在的情況下，與沒有或低濃度試劑的陰性對照比較，降低的NELL-1表達水平或活性顯示出試劑可以下調(diào)NELL-1的活性或表達。
可以通過改變基因產(chǎn)品的轉(zhuǎn)錄(例如mRNA的轉(zhuǎn)錄)和/或改變基因產(chǎn)品的轉(zhuǎn)譯(例如蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯)和/或轉(zhuǎn)譯后的修正(例如蛋白質(zhì)折疊，糖基化等)來調(diào)整基因表達水平。因此本發(fā)明優(yōu)選的方法包括測定轉(zhuǎn)錄mRNA(或其他來自NELL-1基因的核酸)的水平，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯水平，轉(zhuǎn)譯蛋白質(zhì)的活性等。這些方法的例子如下所述。
A)核酸基礎分析1)目標分子 通過對從mRNA和/或從mRNA(例如逆轉(zhuǎn)錄的cDNA等)得到的核酸的變化進行測定來檢測表達水平的變化。為了測定NELL-1表達水平，需要為該分析提供一種核酸樣品。在優(yōu)選的實施方案中，核酸是從生物樣品中發(fā)現(xiàn)的或來自生物樣品。這里使用的術語“生物樣品”是指來自有機體或有機體部分(例如細胞)的樣品。樣品可以是任何生物組織或液體。生物樣品還可以包括如用于組織目的的凍結切片的器官或組織切片。
在某些優(yōu)選實施方案中，可以按照本領域公知的任何一種方法從樣品中分離核酸(例如，來自mRNA的mRNA核酸)。分離mRNA的方法對于本領域人員來說是公知的。例如，Tijssen ed.，(1993)Chapter3 of Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization With Nucleic Acid Probes，Part L Theory and Nucleic AcidPreparation，Elsevier，N.Y.and Tijssen ed里面所描寫的核酸分離和純化方法。
優(yōu)選實施方案中，使用例如酸性的胍鹽-苯酚-氯仿萃取法對給定樣品進行分離得到“總”核酸，通過低(oligo)dT色譜柱或使用(dT)n磁珠(參見例如Sambrook等人，Molecular CloningALaboratory Manual(2nd ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，(1989)，或Current Protocols in Molecular Biology，F(xiàn).Ausubel等人，ed.Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1987))分離聚A+mRNA。
通常，在對表達水平進行分析之前需要對核酸樣品進行擴增。擴增核酸的方法在本領域是公知的，包括但不限于聚合酶鏈反應(PCR，參見例如INNIS等人，(1990)PCR Protocols.A guide to Methodsand Application.Academic Press，Inc.San Diego，)，連接酶鏈反應(參見Wu and Wallace(1989)Genomics 4560，Landegren等人(1988)Science2411077，和Barringer等人(1990)Gene 89117，轉(zhuǎn)錄擴增(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA_861173)，自主序列復制系統(tǒng)(Guatelli等人(1990)Proc.NAT.Acad.Sci.USA 871874)，點PCR，和連接接頭擴增方法，等等)。
在特別優(yōu)選實施方案中，需要對樣品中NELL-1的轉(zhuǎn)錄水平(從而是表達水平)進行量化，核酸樣品中的NELL-1mRNA轉(zhuǎn)錄濃度或來自NELL-1mRNA轉(zhuǎn)錄的核酸的濃度，與所述基因的轉(zhuǎn)錄水平(從而是表達水平)成比例關系。類似的，優(yōu)選雜交信號強度和雜交核酸數(shù)量成比例。然而，當優(yōu)選比例關系是相對嚴格時(例如雙倍的轉(zhuǎn)錄速率導致樣品核酸庫中mRNA的雙倍和雜交信號的雙倍)，采用更松散的以及甚至非線形的比例技術是很有用的。這樣，例如目標mRNA濃度中5倍的差異而導致雜交強度3-6倍的差異的方法對大部分目的來說是足夠的。
當需要進行更準確的量化時，需要進行適當?shù)目刂苼韺Π凑者@里所述的樣品制備和雜交導致的變動進行修正。另外，可以根據(jù)本領域公知方法，使用“標準”目標核酸(例如mRNA)的連續(xù)稀釋法來制備校準曲線。當然，當需要樣品檢測或沒有轉(zhuǎn)錄或核酸濃度變化有較大不同時，并不需要細心控制或校準。
在最簡單的實施方案中，含有NELL-1的核酸樣品是分離的和/或來自生物樣品的所有mRNA或cDNA?？梢愿鶕?jù)上述本領域公知的任何一種方法來從樣品中分離核酸。
2)雜交基礎分析 使用已知的NELL-1序列(參見例如(SEQ ID NO1)檢測和/或量化NELL-1轉(zhuǎn)錄，通過使用核酸雜交技術(參見例如Sambrook等人supra)可以順利完成該過程。例如，一種分析NELL-1逆轉(zhuǎn)錄cDNA的存在，缺乏或量化的方法包括“Southern印跡”。在Southern印跡中，在電泳凝膠中典型為片段和分離的DNA(例如逆轉(zhuǎn)錄mRNA)與NELL-1特異性探針雜交。通過對帶有“控制”探針(例如“看家基因”探針)的NELL-1探針的雜交強度信號的比較，可以對目標核酸的相關表達水平進行評估。
可選的，可以通過Northern印跡直接量化NELL-1mRNA。簡而言之，使用例如酸性的胍鹽-苯酚-氯仿萃取法從給定的細胞樣品中分離mRNA。然后通過電泳mRNA來對不同種類mRNA進行分離，并且將mRNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。Southern印跡中，用標記探針來鑒定和/或量化目標NELL-1mRNA。適當?shù)目刂?例如看家基因探針)為分析相關表達水平提供參考。
一種可選的測定NELL-1表達水平的方法是原位雜交。原位雜交是公知的(例如Angerer(1987)Meth.Enzymol 152649)。通常來說，原位雜交包括如下步驟(1)固定需分析的組織或生物結構；(2)生物結構的再次雜交處理，以增強目標DNA的可接近性并減少非特定性結合；(3)將核酸混合物與生物結構或組織中的核酸雜交；(4)雜交后洗去在雜交中沒有結合的核酸片段和(5)檢測雜交的核酸片段。根據(jù)特定的應用，在這些步驟和條件中采用的試劑是不同的。
在一些應用中，有必要阻止重復序列的雜交能力。在一些實施方案中，使用tRNA，人類基因組DNA，或者Cot-1 DNA來阻止非特異性雜交。
3)擴增基礎分析 在另一個實施方案中，擴增分析可以用來對NELL-1表達(轉(zhuǎn)錄)水平進行測定。在所述的擴增分析中，目標核酸序列(也就是NELL-1)作為擴增反應的模板(例如聚合酶鏈反應(PCR)或反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR))。在定量擴增中，擴增產(chǎn)品的數(shù)量和原始樣品中模板(也就是NELL-1mRNA)的數(shù)量成比例。與適當(如未對測試試劑暴露的健康組織或細胞)對照的比較提供出對NELL-1轉(zhuǎn)錄水平的測定。
“定量”擴增方法對本領域人員來說是公知的。例如，定量PCR包括使用相同的引物對已知數(shù)量的對照序列進行同時共同擴增。這提供了一個可以用于校準PCR反應的內(nèi)在標準。在Innis等人的(1990)PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications，Academic Press，Inc.N.Y.中提供出定量PCR的詳細描述。例如，一種包括使用那些與用來擴增目標相同的引物對已知數(shù)量的對照序列進行同時共同擴增。這提供了一個可以用于校準PCR反應的內(nèi)在標準。
一個優(yōu)選的內(nèi)在標準是合成的AW106 cRNA。按照本領域公知的標準方法，將AW106 cRNA和從樣品中分離的RNA結合。然后使用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄來提供復制DNA。然后使用標記引物擴增cDNA序列(通過例如PCR)。典型地通過電泳分離擴增產(chǎn)品，測定標記核酸(與擴增產(chǎn)品的數(shù)量成比例)的數(shù)量。通過與已知AW106 RNA標準產(chǎn)生的信號比較，計算出樣品中mRNA的數(shù)量。PCR Protocols，AGuide to Methods and Applications，Innis等人(1990)Academic Press，Inc.N.Y.提供了關于定量PCR的詳細資料。已知的NELL-1核酸序列足以順利的選擇引物來對該基因的任何部分進行擴增。
4)雜交形式和雜交的優(yōu)化a)點陣雜交形式 實施例中，本發(fā)明方法可以采用點陣雜交形式。點陣是一個附在一個或多個表面(例如固體、膜或凝膠)的不同的“探針”或“目標”核酸的多重態(tài)。在一個優(yōu)選的實施方案中，將各種核酸(或其他部分)的多重態(tài)附著到單獨的相連表面或者互相并列的各種表面上。
在點陣形式中，基本上可以“平行”進行大量的不同雜交反應。對一個單獨的“試驗”中的很多雜交提供了快速、基本上同時的分析。進行點陣形式雜交反應的方法對本領域來說是公知的(參見例如Pastinen(1997)Genome Res.7606-614；Jackson(1996)NatureBiotechnology 141685；Chee(1995)Science 274610；WO 96/17958，Pinkel等人(1998)Nature Genetics 20207-211)。
根據(jù)很多本領域公知的方法可以產(chǎn)生點陣、特別是核酸點陣。例如，在一個簡單的實施方案中，通過測定不同核酸在固體支持物(例如玻璃表面、膜等)上不同位置的點位(例如通過手工使用移液管)來簡單的獲得“低密度”點陣。
已經(jīng)自動地通過這些簡單測定點位方法來獲得高密度點陣(參見例如U.S.專利No5,807,522)。這個專利描寫了自動系統(tǒng)點擊表面上微毛細管來積累小容量生物樣品的用途。重復這個過程來獲得高密度點陣。
還可以使用寡核苷酸合成技術來制備點陣。因此，例如，US專利No.5,143,854和PCT專利No.WO 90/15070和92/10092說明了合成高密度寡核苷酸點陣中光引導組合的使用。US專利5,744,305、5,800,992和5,445,934中也描寫了高密度點陣的合成。
B)其他雜交形式 如上所述，對本領域來說多種核酸雜交形式都是公知的。例如，普通的形式包括三明治(sandwich)測定和競爭(competition)測定或取代(displacement)測定。這些點陣形式通常在Hames和Higgins(1985)Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRLPress；Gall和Pardue(1969)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63378-383；和John等人(1969)Nature 223582-587中有所描述。
三明治測定是用來檢測或分離核酸序列的商用雜交測定。此測定利用共價固定在固體支持物上的“捕獲”核酸和溶液中的標記“信號”核酸。樣品提供目標核酸?！安东@”核酸和“信號”核酸探針與目標核酸雜交形成″三明治″雜交絡合物。為了使效果最好，信號核酸不應該與捕獲的核酸雜交。
典型地，標記信號核酸用來檢測雜交?？梢允褂玫湫陀脕頇z測雜交多核苷酸存在的幾種方法中任何一種標記互補核酸或信號核酸。最普通的檢測方法是采用帶有3H，125I，35S，14C或32P標記等的自動射線照相術。其他的標記包括與標記抗體結合的配體，熒光團，化學發(fā)光劑，酶和可以作為標記配體的特異性結合對成員的抗體。
雜交絡合物的檢測可能需要產(chǎn)生與目標和探針多聚核苷酸或核酸的雙鏈絡合的信號的結合。典型地，通過配體和反配體的相互作用，如在與配體結合的探針和與信號結合的反配體之間，發(fā)生所述結合。
通過使用增加被檢測的目標核酸的核酸擴增系統(tǒng)提高雜交分析的靈敏度。這些系統(tǒng)的例子包括聚合酶鏈式反應(PCR)系統(tǒng)和連接酶鏈式反應(LCR)系統(tǒng)。本領域最近描述的其他方法是依賴核酸序列的擴增(NASBAO，Cangene，Mississauga，Ontario)和Q Beta復制酶系統(tǒng)。
c)雜交條件的優(yōu)化 在探針及其互補目標可以通過互補堿基對形成穩(wěn)定雜合雙鏈的條件下，核酸雜交簡單包括提供一種變性探針和目標核酸。然后典型地通過附帶的可檢測標記的檢測來將沒有形成雜交鏈的核酸洗去，留下要接受檢測的雜交核酸。通常認為，通過升高溫度或者降低含有核酸的緩沖液鹽濃度，或加入化學試劑或增加pH值使核酸變性。在低的嚴格條件(例如低溫和/或高鹽和/或高目標濃度)下，即使退火序列不是十分互補也將會形成雜交雙鏈(例如DNA:DNA，RNA:RNA或RNA:DNA)。因此，在較低的嚴格條件下，降低了雜交的特異性。相反，在高度嚴格(例如高溫或低鹽)的條件下，成功的雜交需要較少的錯配。
本領域的技術人員將會察覺到可以選擇雜交條件來提供任何的嚴格度。在優(yōu)選的實施方案中，雜交在低度嚴格條件下進行以保證雜交，然后在高度嚴格下洗滌序列以除去錯配的雜交雙鏈?？梢栽诓粩嘣黾拥母叨葒栏?例如在37℃到70℃下以低于0.25X SSPE)下，連續(xù)進行洗滌直到獲得所需水平的雜交特異性。還可以通過加入例如甲酰胺的試劑來增加嚴格度?？梢酝ㄟ^將試驗探針雜交與存在的不同對照雜交進行比較，來分析雜交的特異性。
通常，在雜交特異性(嚴格度)和信號強度之間進行一個交換。因此，在優(yōu)選實施方案中，在高度嚴格下進行洗滌以產(chǎn)生一致的結果，并且提供約比背景強度大10％的信號強度。因此，在優(yōu)選實施方案中，可以在連續(xù)的高度嚴格溶液中洗滌雜交點陣并且在每次洗滌之間讀取數(shù)據(jù)。這樣獲得的對數(shù)據(jù)組的分析將會揭示出沖洗的嚴格度，在該嚴格度之上不能改變雜交模式，并且該嚴格度可為感興趣的特異性探針提供足夠的信號。
在優(yōu)選的實施方案中，在雜交過程中通過使用的抑制劑(例如tRNA，精子DNA，cot-1 DNA等)來減少背景信號以降低非特異性的結合。在雜交中使用抑制劑對于本領域而言是公知的技術(參見例如P.Tijssen，supra.的第八章)。
優(yōu)化雜交條件的方法對于本領域而言是公知的技術(參見例如Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology，Vol.24Hybridization With Nucleic Acid Probes，Elsevier，N.Y.)。
理想的條件還是用于物質(zhì)類型不同結合的標記檢測(例如熒光)的靈敏度、熒光染料、激發(fā)、發(fā)射譜帶、光點直徑等的函數(shù)?？梢允褂玫蜔晒獗尘氨砻?參見例如Chu(1992)Electrophoresis13105-114)?？梢酝ㄟ^例如熒光化末端標記DNA片段來測量候選表面上不同直徑的點(“目標因子”)的檢測靈敏度。然后使用常規(guī)的熒光顯微鏡來顯示這些點。然后可以測量來自熒光染料和固體表面不同結合的靈敏度、線形和動態(tài)范圍。還可以分析已知相關部分的熒光染料對的連續(xù)稀釋。這決定了熒光比例測量的靈敏度，其反應了超出將探針固定在其上的物質(zhì)的熒光和檢測器允許的動態(tài)范圍的實際的熒光比例。
d)核酸的標記和檢測 這里使用的用于檢測NELL-1表達水平的探針可以是NELL-1mRNA的完整長度或比其短的長度。以經(jīng)驗來說，短探針用于特異性。優(yōu)選的探針是足夠長以至在嚴格條件下可以特異性地與NELL-1目標核酸進行雜交。優(yōu)選的尺寸范圍是從約20個堿基到NELL-1mRNA的整個長度，更優(yōu)選的是從約30個堿基到NELL-1mRNA的整個長度，最優(yōu)選的是從約40個堿基到NELL-1mRNA的整個長度。
典型地，用可檢測得到的標記來標記探針。適合于本發(fā)明的檢測標記包括可以通過分光鏡、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學方法檢測得到的任何組合物。本發(fā)明中有用的標記包括用標記的抗生物素蛋白結合染色的生物素、磁珠(例如DynabeadsTM)、熒光染料(例如熒光素、德克薩斯紅、玫瑰精、綠色熒光蛋白，參見例如Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)、放射性標記(例如3H，125I，35S，14C或32P)、酶(例如辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶和ELISA中常用的其他種類)、和例如膠體金的比色標記(例如散發(fā)高效綠光的40-80nm直徑尺寸范圍的金顆粒)或者有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、橡膠等)珠子。說明使用這些標記的專利包括US專利Nos.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241。
優(yōu)選熒光標記，因為其在弱背景下可以提供很強的信號。在高分辨率和靈敏度下，通過快速掃描程序可檢測到該熒光標記?？梢杂脝我坏臉擞?，例如單一的熒光標記，對所有的核酸樣品進行標記?？蛇x地，在其他實施方案中，帶有不同標記的不同的核酸樣品可以同時雜交。例如，一個目標用綠色熒光標記而第二個目標用紅色標記。掃描步驟可以將綠色熒光標記結合的位置與紅色標記結合的位置區(qū)分開。每個核酸樣品(目標核酸)都可以單獨進行分析。
可以采用的合適色原包括那些在特定波長范圍內(nèi)吸收光以觀察到其顏色，或可選的，當用特定波長的射線照射時可以發(fā)出光的分子和化合物，例如熒光劑。
理想地，熒光標記應該吸收約300nm以上，優(yōu)選約350nm以上，和更優(yōu)選400nm以上的光，通常在比吸收的光波長大約10nm的波長上發(fā)出。值得注意的是，結合染料(bound dye)和非結合染料(unbound dye)的發(fā)出和吸收特性不同。因此，當涉及到染料的不同波長范圍和特性時，應該指明任一溶液中使用的染料以及沒有結合和特征化的染料。
通常優(yōu)選熒光劑是因為當用光照射熒光劑時，其可以吸收很多光。因此，單一的標記可以提供很多可以測量的結果。
化學發(fā)光和生物發(fā)光源同樣可以提供可檢測信號?；瘜W發(fā)光源包括通過化學反應激化電子，從而發(fā)出可以作為檢測信號的光，或?qū)晒饨邮掌魈峁┠芰康幕衔?。可選地，蟲熒光素可以和熒光素酶或光澤精聯(lián)合使用來提供生物發(fā)光。
帶有不成對電子自旋的報道分子提供自旋標記物，其可以通過電子白旋共振(ESR)光譜檢測到。示范的自旋標記物包括有機自由基，過渡金屬絡合物，特別地釩，銅，鐵，和錳等等。示范的自旋標記物包括硝基氧自由基。
在雜交前或后可以向目標“樣品”核酸中加入標記。稱為“直接標記”的是雜交前直接附著或引入到目標“樣品”核酸中的可檢測到的標記。相反，稱為“間接標記”的是雜交后與雜交雙鏈結合的。通常，間接標記在雜交前與已經(jīng)和目標核酸結合的部分結合。因此，例如在雜交前目標核酸可以是生物素。雜交后，和抗生物素蛋白共扼的熒光團與帶有提供易于檢測到的標記的雜種雙鏈的生物素結合。關于標記核酸和檢測雜交核酸標記的方法的詳細說明，可以參考Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol.24Hybridization With Nucleic Acid Probes，P.Tijssen，ed.Elsevier，NY.，(1993))。
在體外的轉(zhuǎn)錄反應中，易于加入熒光標記。因此，例如用UTP和CTP標記的熒光團可以加入到體外轉(zhuǎn)錄中產(chǎn)生的RNA中。
可以直接或者通過連接部分附著標記。通常，標記或連接器標記附著的位置不受任何特定的位置的限制。例如，可以在檢測或所需雜交干擾不到的任何位置上，將標記附著到核苷、核苷酸、或其類似物上。例如，某些來自Clontech(Palo Alto，CA)的可標記試劑可用來在寡聚核苷酸的整個磷酸鹽主鏈上分散標記以及在3′和5′末端終止標記。如這里的例子所示，可以將標記附著到核糖環(huán)或可以修正甚至如需要可除去的核糖上。一些有用的標記試劑的堿基部分可以包括天然存在的或以不干擾其放置目的的修正的那些堿基部分。修正的堿基包括但不限于7-deaza A和G，7-deaza-8-aza A和G，以及其他雜環(huán)部分。
應該認識到熒光標記并不限于單一種類的有機分子，而是包括無機分子，有機和/或無機多分子混合物、晶體、非均相聚合物等。因此，例如包覆在硅土外殼中的CdSe-CdS核心-外殼納米晶體易于和生物分子偶合(Bruchez等人(1998)Science，2812013-2016)。類似的，將高熒光量點(硫化鋅封端的硒化鎘)與生物分子共價偶合，用來進行超靈敏度的生物檢測(Warren and Nie(1998)Science，2812016-2018)。
B)多肽基礎測定1)測定形式 另外，或者可選的，可以通過檢測和/或計算轉(zhuǎn)譯NELL-1多肽的數(shù)量和/或活性來檢測或計算NELL-1核酸表達水平，NELL-1表達的變化。
2)表達蛋白質(zhì)的檢測 可以通過本領域公知的很多方法的任一種對由NELL-1編碼的多肽進行測量和定量。這些方法包括分析的生物化學方法如電泳，毛細管電泳、高效液相色譜(HPLC)、薄層色譜(TLC)、過度擴散色譜(hyperdiffusion chromatography)等等，或各種免疫學方法如液體或凝膠沉淀素反應、免疫擴散(單或雙)、免疫電泳、放射免疫測定(RIA)、酶標免疫吸附技術(ELISAs)、熒光免疫檢測、Western印跡等等。
優(yōu)選的實施方案中，通過電泳蛋白質(zhì)分離(例如1-或2-維電泳)來對NELL-1多肽進行測定和量化。采用電泳技術測定蛋白質(zhì)的方法對本領域來說是公知的(通常參考R.Scopes(1982)ProteinPurification，Springer-Verlag，N.Y.；Deutscher，(1990)Methods inEnzymology Vol.182Guide to Protein Purification，Academic Press，Inc.，N.Y.)。
在優(yōu)選的實施方案中，采用Western印跡(免疫印跡)分析對本發(fā)明樣品中多肽的存在進行測量和量化。這種技術通常包括根據(jù)分子重量通過凝膠電泳分離蛋白質(zhì)樣品，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到合適的固體支持物上，(例如硝化纖維過濾器，尼龍過濾器或衍生尼龍過濾器)，和用與目標多肽特異性結合的抗體孵化樣品。
抗體和目標多肽特異性結合并且可以直接標記，或可選地在隨后可以使用與抗體特異性區(qū)域結合的標記抗體(標記的羊反鼠抗體)進行檢測。
優(yōu)選實施方案中，通過免疫測定檢測NELL-1多肽。如這里所用的免疫測定是一種利用抗體與被分析物(例如目標多肽)特異性結合的方法。因此，免疫測定的特征在于檢測本發(fā)明多肽與抗體的特異性結合，該抗體不能使用其他理化性質(zhì)來進行分離、瞄準和定量分析物。
很多認為很好的免疫學結合測定(參見例如U.S.專利4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168)都適用于這里鑒定的多肽的檢測或量化。關于免疫方法通常還可以參考Asai(1993)Methods InCell Biology Volume 37Antibodies in Cell Biology，Academic Press，Inc.New York；Stites & Terr(1991)Basic and Clinical Immunology 7thEdition。
免疫學結合測定(或免疫測定)通常利用“捕獲劑”來進行特異性結合并且固定被分析物(NELL-1多肽)。優(yōu)選的實施方案中，捕獲劑是抗體。
免疫測定也常常利用標記物來進行特異性結合并且標記由捕獲劑和被分析物形成的結合絡合物。標記物本身可以是包含抗體/被分析物絡合物之一。因此，標記物可以是標記的多肽或者是標記的抗體，其可以特異性識別已經(jīng)結合的目標多肽?？蛇x的，標記物可以是與捕獲劑/多肽絡合物特異性結合的第三部分，例如另一個抗體。
能夠特異性結合免疫球蛋白恒定區(qū)的其他蛋白質(zhì)，如蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G也可以用作標記物。這些蛋白質(zhì)是鏈球菌細胞膜的常規(guī)要素。其顯示出對免疫球蛋白恒定區(qū)強烈的非免疫原反應(通常參見Kronval等人(1973)J.Immunol.，1111401-1406，和Akerstrom(1985)J.Immunol.，1352589-2542)。
用于檢測目標多肽的優(yōu)選免疫測定可以是競爭性或非競爭性的。非競爭性免疫測定法是指捕獲分析物的數(shù)量可以直接測量的方法。在優(yōu)選的“三明治(Sandwish)測定中，例如捕獲物(抗體)可以直接和固定的固體物結合。然后這些固定的抗體捕獲存在于試樣中的目標多肽。然后，用標記試劑，如帶有標記的第二抗體結合固定的目標多肽。
在競爭性測定中，通過捕獲劑(抗體)所附加的(外源的)分析物的含量間接測量存在于試樣中分析物(NELL-1多肽)的含量，該分析物在捕獲劑(抗體)中被存在于樣品中的分析物代替(或競爭趕走)。在競爭性的測定中，將已知含量的的標記多肽加入到樣品中，然后使樣品與捕獲劑結合。與抗體結合的標記多肽和樣品中目標多肽的濃度成反比。
在特別優(yōu)選的實施方案中，抗體固定在固體底物上?；蛲ㄟ^測定多肽/抗體絡合物中存在的目標多肽的數(shù)量，或可選地通過測定殘余的沒有絡合的多肽數(shù)量，來測定與抗體結合的目標多肽的含量。
本發(fā)明的免疫測定法包括酶學免疫測定(EIA)，其根據(jù)具體使用的方案，利用與NELL-1多肽結合的多克隆或單克隆抗體或抗體片段或抗體單鏈的標記或未標記(例如酶標)衍生物，可使用其單體或混合物。當與NELL-1結合的抗體沒有標記時，可以使用不同的檢測指示劑，例如具有與和NELL-1多肽結合的單克隆抗體可以結合的能力的酶標抗體。也可以使用任何一種已知的修正EIA，例如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。如上所述，本發(fā)明預計還可以采用免疫沉淀技術，如利用酶學檢測系統(tǒng)的Western印跡。
本發(fā)明免疫方法還可以是其他的公知免疫方法，例如采用熒光物質(zhì)，例如熒光素或玫瑰精，抗體或抗原粒子包覆的乳膠粒子粘合的乳膠，帶有抗體包覆或抗原包覆的紅血球的血凝反應，采用抗生物素-生物素或鏈鎖狀球菌抗生物素—生物素檢測系統(tǒng)，等等的抗體或抗原共軛化物的熒光免疫。
根據(jù)不同的因素，如樣品中的抗原濃度、樣品的性質(zhì)、采用的免疫測定類型等，本發(fā)明免疫測定的特定參數(shù)可以變化很大。本領域人員可以容易地建立最優(yōu)條件。某些實施方案中，在沒有樣品時，和NELL-1多肽結合的抗體數(shù)量通常選擇50％的檢測指示劑結合。如果將純化抗體用作抗體源，通常每一測定法應用的抗體量為1ng到100ng。典型的條件為約4℃至約45℃的溫度，優(yōu)選約25℃至約37℃，最優(yōu)選的溫度為約25℃，PH值通常在約5至9，優(yōu)選為約7，離子強度為約0.2M的氯化鈉蒸餾水，優(yōu)選為0.15M的氯化鈉蒸餾水。根據(jù)試驗的性質(zhì)，時間可以變化很大，通常在約0.1分鐘到約24小時之間?？梢杂貌煌瑵舛鹊木彌_液，如PBS溶液，其他的試劑如鹽來提高離子強度，可以使用蛋白質(zhì)如血清白蛋白，穩(wěn)定劑，殺蟲劑和非離子洗滌劑。
根據(jù)本領域人員公知的標準方法來對發(fā)明測定進行評定(作為陽性，陰性或定量目標多肽)。對特異性方法的評定是根據(jù)試驗形式以及標記的選擇。例如，可以根據(jù)酶標記產(chǎn)生的可視有色產(chǎn)物評定Western印跡。在合適的分子重量上，可評定清晰有色條帶或點來作為陽性結果，而將缺乏清晰的有色條帶或點作為陰性結果。條帶或點的強度可以定量檢測目標多肽濃度。
這里描述的不同的免疫檢測中使用的抗體，可以是通過商業(yè)獲得的或按照下面描述的方法制備的。
3)NELL-1多肽抗體 本發(fā)明這里描述的免疫檢測法中可以采用單克隆或多克隆抗體。單克隆抗體優(yōu)選將充分純度的多肽或抗原多肽多重注射(如皮下或肌肉注射)到合適的非人類哺乳動物?？梢酝ㄟ^常規(guī)技術測量目標肽的抗原性來確定已經(jīng)用該肽免疫的動物對抗體的反應大小。通常，本發(fā)明方法中用來提高抗體的肽應該是那些可以誘導帶有對NELL-1編碼的目標多肽具有相對高親合性的高滴定量抗體產(chǎn)生的肽。
如需要，可以采用公知技術通過結合將免疫肽與運載蛋白偶合。通常使用的和肽化學偶合的載體包括匙孔血藍蛋白(KLH)，甲狀腺球蛋白，牛血清蛋白(BSA)，破傷風類毒素。然后偶合多肽用來使動物(例如鼠或兔)具有免疫性。
然后，從哺乳動物的血樣品中獲得抗體。用來產(chǎn)生多克隆抗體的技術在本領域是公知的(參見例如Methods of Enzymology，″Production of Antisera With Small Doses of ImmunogenMultipleINTRADERMAL Injections″，Langone，等人.eds.(Acad.Press，1981))。動物產(chǎn)生的多克隆抗體可以進一步純化，例如通過和基質(zhì)結合并洗提基質(zhì)，將從抗體中洗脫的肽與所述基質(zhì)結合。本領域人員所知多克隆抗體以及單克隆抗體的純化和/或濃縮的免疫學的不同技術參見，例如Coligan等人(1991)Unit 9，Current Protocols in Immunology，WileyInterscience)。
但是，優(yōu)選地，產(chǎn)生的抗體是單克隆抗體(″mAb′s″)。制備單克隆抗體，優(yōu)選小鼠或大白鼠免疫法。本發(fā)明中使用的術語“抗體”包括完整的分子及其碎片，例如Fab和F(ab′)2′，和/或具有與異位決定因子(epitopic determinant)結合能力的單鏈抗體(例如scFv)。同時，文中術語“本發(fā)明的mab′s”是指具有NELL-1多肽編碼的多肽特異性的抗體。
制備分泌mAbs雜交瘤的通用方法是公知的(Kohler andMilstein(1975)Nature，256495)。簡單地說，如Kohler和Milstein所述，該技術包括從五個分別患有黑素瘤，畸胎癌，子宮頸癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤癌或肺癌(樣品來自外科標本)的局部排泄淋巴結中分離淋巴細胞，匯集所述細胞并且將其與SHFP-1融合。篩選用于產(chǎn)生與癌細胞系結合的抗體的雜交瘤。通過使用相對常規(guī)的篩選技術(例如酶聯(lián)免疫吸收法或“ELISA”)完成mAb′s中特異性的確定來檢測感興趣的mAb的基本反應模式。
還可以通過噬菌體顯示技術制備/選擇抗體片段，例如單鏈抗體(scFv或其他)。在可以轉(zhuǎn)染細菌(抗菌素或噬菌體)的病毒表面表達抗體片段的能力有可能使單一的結合抗體片段，從例如比1010更大的非結合克隆庫中分離出來。為了在噬菌體表面表達抗體片段(噬菌體顯示)，將抗體片段基因插入到編碼噬菌體表面蛋白(pIII)的基因中，以及在噬菌體表面顯示抗體片段-pIII融和蛋白質(zhì)(McCafferty等人(1990)Nature，348552-554；Hoogenboom等人(1991)Nucleic Acids Res.194133-4137)。
由于噬菌體表面的抗體片段是功能性的，所以可以通過抗原親和色譜來將含有結合抗體片段的噬菌體從非結合噬菌體中分離出來(McCafferty等人(1990)Nature，348552-554)。根據(jù)抗體片段的親合性，可以為單一輪的親合性選擇得到20倍-1,000,000倍的富積因子。然而，通過用洗脫的噬菌體感染細菌，使更多的噬菌體生長并且用于另一輪的選擇。通過這種方法，一輪中的1000倍富積可以變?yōu)閮奢嗊x擇中的1,000,000倍富積(McCafferty等人(1990)Nature，348552-554)。因此，即使富積很低(Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222581-597)，多輪的親合性選擇也可以導致罕見的噬菌體分離。由于噬菌體抗體庫對抗原的選擇導致富積，在如三到四輪選擇的這樣少之后，克隆的主要部分與抗原結合。因此，只有相對少數(shù)的克隆(幾百)需要與抗原結合來進行分析。
不需要預先免疫，可以通過在噬菌體上顯示出很大和多樣V-基因的全部組成成分(repertoires)，產(chǎn)生人類抗體(Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222581-597)。在一個實施方案中，通過PCR將人體周圍血液的淋巴細胞中自然VH和VL的全部組成成分從沒有免疫的捐贈人中分離出來。使用PCR隨機地將V-基因的全部組成成分固定在一起，來產(chǎn)生scFv基因的全部組成成分，將scFv基因克隆到噬菌體載體中來產(chǎn)生3000萬噬菌體抗體庫(Id.)。使用這種簡單“幼稚”的噬菌體抗體庫，可以從超過17個不同的抗原中分離出結合抗體片段，包括半抗原、多聚糖和蛋白質(zhì)(Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222581-597；Marks等人(1993).Bio/Technology.10779-783；Griffiths等人(1993)EMBO J.12725-734；Clackson等人(1991)Nature.352624-628)。將對抗自身蛋白質(zhì)的抗體制備出來，包括人甲狀腺球蛋白、免疫球蛋白、腫瘤壞死因子和CEA(Griffiths等人(1993)EMBO J.12725-734)。還有可能通過直接選擇完整細胞來分離對抗細胞表面的抗體?？贵w片段對用來選擇的抗原是高度特異性的，并且具有在1M到100nM范圍內(nèi)的親合性(Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222581-597；Griffiths等人(1993)EMBOJ.12725-734)。更大的噬菌體抗體庫導致更多抗體的分離，該抗體對更高比例的抗原具有高度結合親合性。
還可以通過許多商業(yè)性服務制備抗體(例如Berkeleyantibody laboratories，Bethyl Laboratories，Anawa，Eurogenetec等)。
C)方法優(yōu)化 本發(fā)明方法在篩選調(diào)節(jié)細胞、組織或生物體中NELL-1表達的試劑中有著直接應用?？梢愿鶕?jù)例如生物樣品的來源和/或性質(zhì)和/或特定的試劑，和/或可以得到的分析結構，在具體的情況下優(yōu)化本發(fā)明的方法。因此，例如，優(yōu)化可以包括測定結合方法的優(yōu)化條件，最合適的樣品處理條件(例如優(yōu)選的PCR條件)，使信噪比最大化的雜交條件，提高產(chǎn)出的方法等等。另外，可以根據(jù)獲得的設備和/或試劑來選擇和/或最優(yōu)化方法的格式。因此，例如，當可以獲得商業(yè)性抗體或ELISA全套時，需要測定蛋白濃度。相反，當需要篩選改變NELL-1基因的調(diào)節(jié)器的時候，優(yōu)選以核酸為基礎的方法。
對本領域人員而言，方法格式的常規(guī)選擇和優(yōu)化是公知的。
II.結合NELL-1的試劑的預篩選 一些實施方案中，需要對具有與NELL-1核酸或多肽交互作用(例如特異性結合)能力的測試試劑進行預篩選。特異性結合測試試劑更易于與NELL-1表達和/或活性進行交互作用，因此調(diào)整NELL-1的表達和/或活性。因此，在一些優(yōu)選實施方案中，在進行上述更復雜測定之前，為了與NELL-1核酸或NELL-1蛋白質(zhì)結合，預先對試劑進行篩選。
在一個實施方案中，采用單一結合的方法完成所述預篩選。測定核酸或蛋白特異性結合或?qū)μ禺愋耘潴w的親和結合方法，對本領域人員而言是公知的。在優(yōu)選的實施方案中，NELL-1蛋白或核酸是固定的并且暴露在測試試劑中(可以是標記的)，或可選地，測試試劑是固定的并且暴露在NELL-1蛋白或NELL-1核酸中(可以是標記的)。然后洗滌固定部分來除去任何沒有結合的材料，并且檢測結合的測試試劑或結合的NELL-1核酸或NELL-1蛋白(例如通過對結合分子上附著的標記進行檢測)。固定標記的數(shù)量和NELL-1蛋白質(zhì)或核酸與測試試劑之間的結合程度成比例。
III.用于篩選的試劑 雖然在一個實施方案中，上面描述的的方法用于檢測NELL-1存在、沒有或定量的表達，但是同樣的方法可以用于篩選調(diào)節(jié)MT-SP1絲氨酸蛋白酶表達和/或活性的試劑。為了篩選潛在的調(diào)節(jié)劑，在一種或多種測試試劑存在的情況下或使用來自暴露于一種或多種測試試劑中的細胞和/或組織和/或器官和/或生物體的生物樣品來進行上述測定。測定MT-SP1活性和/或表達水平，并且在優(yōu)選實施方案中，與“對照”測定(沒有試劑的同樣的測定)中觀察到的活性水平進行比較。“測試”測定和對照測定之間的MT-SP1水平和/或活性的差異顯示出測試試劑是SP1表達或活性的調(diào)節(jié)劑。
在優(yōu)選實施方案中，當測定的蛋白質(zhì)或核酸水平或蛋白質(zhì)活性高于測定的或已知的對照樣品(例如或是相同種類的正常健康細胞、組織或哺乳動物生物體的、沒有與假定調(diào)節(jié)劑接觸的已知測定水平，或同一個體在不同組織和/或不同時間測定的“基線/參考”水平)時，本發(fā)明被認為是陽性結果，例如提高的表達和/或MT-SP1活性，基因。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，當樣品和“對照”之間具有統(tǒng)計學意義的差異(例如在85％或更大、優(yōu)選90％或更大、更優(yōu)選95％或更大、最優(yōu)選98％或更大可信度)時，該測定被認為是陽性結果。
IV.高通量篩選 本發(fā)明的方法也包括“高通量”篩選的方法。傳統(tǒng)地，通過確定具有所需特性或活性的化學化合物(稱之為“前藥”)，生產(chǎn)多種此類“前藥”，以及對這些化學化合物的特性和活性進行評估來產(chǎn)生具有有效特性(比如，調(diào)節(jié)NELL-1表達和活性)的新化學物質(zhì)。然而，最近的趨勢是縮短藥物發(fā)明各步驟的時間。因為其具有可以快速有效地檢測大量樣本，所以高通量篩選方法已經(jīng)取代了傳統(tǒng)“前藥”的鑒定方法。
在優(yōu)選實施方案中，高通量篩選方法包括提供一個含有大量潛在的具有所需活性的化合物(候選化合物)的庫。然后采用這里描述的一種或多種方法對所述“組合化學庫”進行篩選，從而鑒定出那些顯示出所需特征活性的庫成員(特異性的化學品種或亞類)。這樣，鑒定出來的化合物用作通常的“前藥”或?qū)⑵浔旧碛米鳚撛诘幕驅(qū)嶋H的治療劑。
A)組合化學庫 最近，注意力集中在組合化學庫上來輔助新化合物主旨的產(chǎn)生。組合化學庫是由化學合成或生物合成，通過結合很多化學“構建模塊”，如試劑產(chǎn)生的不同種類化合物的集合。例如，由一組給定化合物長度、也就是稱為氨基酸的構建模塊(即多肽化合物中氨基酸數(shù)量)，通過各種可能的方式連接形成線性組合化學庫，如多肽。通過組合化學構建模塊混合物可以合成數(shù)以萬計的化合物。例如，評論員觀察到，在合成理論上，100個相互改變的化學構建模塊的系統(tǒng)組合混合物可以使100百萬四聚化合物或10億五聚化合物合成(Gallop等人(1994)37(9)1233-1250)。
組合化學庫的制備和篩選對本領域人員而言是公知的。這些組合化學庫包括但不限于肽庫(參見例如U.S.專利5,010,175,Furka(1991)Int.J.Pept.Prot.Res.，37487-493，Houghton等人(1991)Nature，35484-88)。肽合成決不是本發(fā)明看到和準備使用的唯一方法。也可以采用其他的產(chǎn)生化學多樣性庫的化學過程。這些化學過程包括但不限于肽(PCT出版物No WO 91/19735，26 Dec.1991)，編碼的肽(PCT出版物WO 93/20242，14 Oct.1993)，隨機生物寡聚體(PCT出版物WO 92/00091，9 Jan.1992)，苯并二氮平類(U.S.專利.No.5,288,514)，diversomers如乙內(nèi)酰尿類，苯并二氮平類和二肽(Hobbs等人(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 906909-6913)，vinylogous多肽(Hagihara等人(1992)J.Amer.Chem.Soc.1146568)，帶有β-D-葡萄糖腳手架的非肽的肽類似物(Hirschmann等人，(1992)J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218)，小化合物庫的類似有機合成(Chen等人(1994)J.Amer.Chem.Soc.1162661)，寡氨基甲酸鹽(Cho等人(1993)Science 2611303)，和/或縮氨酸磷酸酯(Campbell等人(1994)J.Org.Chers.59658)。通常參考Gordon等人(1994)J.Med.Chem.371385，核酸庫(參考例如Strategene，Corp.)，核酸肽庫(參見例如U.S.專利5,539,083)抗體庫(參見例如Vaughn等人(1996)Nature Biotechnology，14(3)309-314)和PCT/US96/10287)，糖庫(參見例如Liang等人(1996)Science，2741520-1522和U.S.專利5,593,853)，和有機小分子庫(參見例如benzodiazepines，Baum(1993)C&EN，Jan 18，page 33，類異戊二烯U.S.專利5,569,588，噻唑啉酮和metathiazanone U.S.專利5,549,974，吡咯烷U.S.專利5,525,735和5,519,134，嗎啉化合物U.S.專利5,506,337，苯并二氮平類5,288,514等等)。
制備組合庫的設備可以通過商業(yè)渠道獲得(參見例如357MPS，390 MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，WOBURN，MA，433A Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。
已經(jīng)發(fā)展了的很多公知的用于液相式化學的機器人系統(tǒng)。這些系統(tǒng)包括自動工作站如由Takeda Chemical Industries，LTD.(Osaka，Japan)開發(fā)的自動合成設備和利用機器臂的很多機器人系統(tǒng)(ZymateII，Zymark Corporation，Hopkinton，Mass.；Orca，Hewlett-Packard，PaloAlto，Calif.)來模仿化學家人工合成操作。上述任何一種設備都適用于本發(fā)明。為了使其可以按照這里的描述進行操作，相關領域的人員清楚對這些設備修改(如果有)的性質(zhì)和安裝。另外，大量組合庫本身也可以通過商業(yè)渠道獲得(參見例如ComGenex，Princeton，N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，INC.，St.Louis，MO，ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3DPharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD，等等)。
B)化學庫的高通量方法 任何調(diào)整NELL-1表達或改變NELL-1多肽的特異性結合和/或活性的方法都可以采用高通量篩選。如上所述，已經(jīng)測定出NELL-1表達和骨礦化有關，很有可能是抑止或增強骨礦化的調(diào)節(jié)劑。因此，通過測試化合物，優(yōu)選的測定對轉(zhuǎn)錄的抑制(也就是對mRNA產(chǎn)品的抑制)，基因(也就是gDNA或cDNA)或基因產(chǎn)品(也就是mRNA或表達的蛋白質(zhì))的結合進行檢測?？蛇x地，該測定可以檢測NELL-1多肽特征活性的抑制。
對特異性核酸或蛋白質(zhì)產(chǎn)品的存在、沒有或定量的高通量測定，對本領域人員而言是公知的。類似的，結合測定也是類似公知的。因此，例如U.S.專利5,559,410公開了蛋白質(zhì)的高通量篩選方法，U.S.專利5,585,639公開了核酸結合(也就是點陣)的高通量篩選方法，還有U.S.專利5,576,220和5,541,061公開了篩選配體/抗體結合的高通量方法。
另外還可以從商業(yè)渠道獲得高通量篩選系統(tǒng)(參見例如Zymark Corp.，Hopkinton，MA；Air Technical Industries，Mentor，OH；Beckman Instruments，Inc.Fullerton，CA；Precision Systems，Inc.，Natick，MA，等等)。典型地，這些系統(tǒng)將整個過程自動化，包括對本測定適用的所有樣品和試劑的移液，液體配制，時間孵化和測定微量板進行最后的記錄。這些結構系統(tǒng)提供了高通量和快啟動以及高度的靈活性和自動化。這些系統(tǒng)的生產(chǎn)商提供不同高通量的詳細的方案。因此，例如Zymark公司提供描述用于檢測基因轉(zhuǎn)錄，配體結合等等調(diào)節(jié)的篩選系統(tǒng)技術公報。
V.使用NELL-1核酸和/或多肽來增加骨的礦化 在另一個實施方案中，本發(fā)明提供增強骨生長的方法和組合物。這在上下文中是很有用的，包括但不限于骨重建，如用于創(chuàng)傷后發(fā)生的重建缺陷，發(fā)育中的癌外科或錯誤，成骨不全、骨質(zhì)疏松的治療以及大小骨折的康復。
該方法大體包括增加骨或其周圍或者骨祖細胞或其中，和/或與NELL-1多肽或編碼NELL-1多肽的載體接觸的細胞(例如骨祖細胞)的NELL-1蛋白質(zhì)濃度。其可以通過改變骨祖細胞來實現(xiàn)，以使其表達了提高水平的內(nèi)源NELL-1或來自外源轉(zhuǎn)染NELL-1核酸的NELL-1，或使骨、骨折位置、骨祖細胞與NELL-1蛋白或局部或NELL-1蛋白的系統(tǒng)給藥接觸。
這里使用的術語“骨祖細胞”是指那些具有最終形成或促使形成新的骨組織的任何或所有細胞。其包括不同分化階段的各種細胞，如例如干細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、血管細胞、造骨細胞、成軟骨細胞、破骨細胞等等。骨祖細胞還包括那些體外分離或操作的例如受過試劑刺激的細胞，如細胞活素類或生長因子甚至是遺傳工程細胞。使用本發(fā)明方法和化合物刺激的骨祖細胞的特異性種類或種類并不重要，只要所述細胞在以其被激活的方法來激活，以及在具體的體內(nèi)實施方案中最終產(chǎn)生新的骨組織。
術語“骨祖細胞”還用來特指那些位于骨祖組織內(nèi)、與其接觸或向其移動(也就是″home to″)那些細胞，其細胞直接或間接的刺激成熟骨的形成。像這樣，源祖細胞也可以是那些最終分化成成熟的骨細胞本身的細胞，也就是“直接”形成新的骨組織的細胞。那些經(jīng)過刺激可以吸引更多源祖細胞或促進附近細胞分化成骨形成細胞(例如成為成骨細胞、骨細胞和/或破骨細胞)的細胞也被認為是本公開上下文中的骨祖細胞-因為其的刺激“間接”導致骨的修復或再生。間接影響骨形成的細胞可能通過不同生長因子或細胞因子的加工，或通過其與其他類型細胞的物理交互作用來做這些。在實施本發(fā)明中不必考慮骨細胞刺激骨修復的直接或間接機制。骨祖細胞和骨祖組織可以是在自然環(huán)境中可以到達活性骨生長、修復或再生區(qū)域的細胞和組織。骨祖細胞這個術語還可以是那些吸引或補充到這些區(qū)域的細胞。這些細胞可以是位于動物模型中人工制造的截骨術中的細胞。骨祖細胞還可以是從人或動物組織中分離并且保存在體外環(huán)境中。獲取骨祖細胞的合適的軀體區(qū)域是如骨折或其他骨骼缺陷(不管是否是人為創(chuàng)造的位置)周圍的骨組織或液體，或確實來自骨髓的區(qū)域?？梢允褂眠@里公開的方法和化合物來刺激分離的細胞，以及如需要，可以將其送回到動物中骨修復被刺激的合適位置。在這些例子中，含有核酸的細胞本身就是一種治療制劑的形式。這樣的體內(nèi)方案對本領域人員都是公知的。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，骨祖細胞和組織將是那些位于需要治療的骨折或損傷區(qū)域的細胞和組織。因此，在治療實施方案中，沒有與將治療組合物應用在其上的合適目標源祖細胞的鑒定有關的困難。在這些例子中，足以獲取這里所公開的適當刺激的組合物(例如NELL-1多肽)并且足以使所述組合物與骨折或損傷位置接觸。在沒有實施者進一步靶向或細胞鑒定的情況下，這個生物環(huán)境的性質(zhì)將變?yōu)榛钚浴?br> A)增加NELL-1產(chǎn)品的細胞變換 在更優(yōu)選的實施方案中，將NELL-1表達核酸(例如cDNA)克隆到可以在體內(nèi)和/或體外轉(zhuǎn)染細胞(例如人類或其他哺乳動物細胞)的基因治療載體中。
可以采用很多方法來將核酸導入細胞體內(nèi)，體外和生物體外。這些包括脂類或脂質(zhì)體的基因運送(WO 96/18372；WO 93/24640；Mannino and Gould-Fogerite(1988)BioTechniques 6(7)682-691；RoseU.S.專利No.5,279,833；WO 91/06309；和Felgner等人(1987)Proc.Natl.Acad.SCI.USA 847413-7414)和保護作為逆轉(zhuǎn)錄基因組一個部分的治療性聚核苷酸序列的復制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄載體(參見例如Miller等人(1990)Mol.Cell.Biol.104239(1990)；Kolberg(1992)J.NIH Res.443，和Cornetta等人(1991)Hum.Gene Ther.2215)。
關于基因治療程序，參考例如Anderson，Science(1992)256808-813；Nabel and Felgner(1993)TIBTECH 11211-217；Mitani andCaskey(1993)TIBTECH 11162-166；Mulligan(1993)Science，926-932；Dillon(1993)TIBTECH 11167-175；Miller(1992)Nature 357455-460；Van Brunt(1988)Biotechnology 6(10)1149-1154；Vigne(1995)RestorativeNeurology and Neuroscience 835-36；Kremer and Perricaudet(1995)British Medical Bulletin 51(1)31-44；Haddada等人(1995)in CurrentTopics in Microbiology and Immunology，Doerfler and BHM(eds)Springer-Verlag，Heidelberg Germany；and Yu等人(1994)Gene Therapy，113-26。
廣泛使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括以鼠白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、類人猿免疫缺乏病毒(SIV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)為基礎的載體及其混合，參考例如Buchscher等人(1992)J.Virol.66(5)2731-2739；Johann等人(1992)J.Virol.66(5)1635-1640(1992)；SOMMERFELT等人，(1990)Virol.17658-59；Wilson等人(1989)J.Virol.632374-2378；Miller等人，J.Virol.652220-2224(1991)；Wong-Staal等人，PCT/US94/05700，和Rosenburg andFauci(1993)in Fundamental Immunology，Third Edition Paul(ed)RavenPress，Ltd.，New York及其參考書，和Yu等人，Gene Therapy(1994)supra)。載體為可選擇的假類型(pseudotyped)以使載體的主體范圍擴展到?jīng)]有被與載體對應的逆病毒感染的細胞中。小泡狀口腔炎病毒包裝糖蛋白(VSV-G)用來構建VSV-G-pseudotyped HIV載體，其可以轉(zhuǎn)染造血干細胞(Naldini等人(1996)Science 272263，和Akkina等人(1996)J Virol.702581)。
以腺-伴隨病毒(AAV)為基礎的載體也可以用來導入帶有目標核酸的細胞，例如在核酸和肽的體外產(chǎn)品，以及體內(nèi)和體外基因治療程序中。關于AAV載體，參見West等人(1987)Virology 16038-47；Carter等人(1989)U.S.專利No.4,797,368；Carter等人WO 93/24641(1993)；Kotin(1994)Human Gene Therapy 5793-801；Muzyczka(1994)J.Clin.Invest.941351。很多出版物描述了AAV載體重組的構建，包括Lebkowski，U.S.專利No.5,173,414；Tratschin等人(1985)Mol.Cell.Biol.5(11)3251-3260；Tratschin等人(1984)Mol.Cell.Biol.，42072-2081；Hermonat and Muzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816466-6470；McLaughlin等人(1988)and Samulski等人(1989)J.Virol.，6303822-3828?？梢杂蓃AAV變換的細胞系的描述包括Lebkowski等人(1988)Mol.Cell.Biol.，83988-3996。其他合適的病毒載體包括皰疹病毒和痘苗病毒。
U.S.專利5,942,496和5,763,416公開了將核酸原位轉(zhuǎn)移到骨細胞和/或刺激骨祖細胞的方法、組合物、全套工具和設備(也參見Evansand Robbins(1995)J.Bone and Joint Surgery，77-A(7)1103-11l4，Wolff等人(1992)J.Cell Sci.，1031249-1259)。
B)外源產(chǎn)生的NELL-1的給藥1)NELL-1蛋白質(zhì)到目標細胞的運送 本發(fā)明NELL-1蛋白(或其生物活性片段)對靜脈、腸胃外、局部、口服、或局部給藥(例如通過氣溶膠、或經(jīng)皮地)都是有用的。特別優(yōu)選的給藥模式包括動脈內(nèi)注射，注射到骨折位置或用生物降解的基質(zhì)運送。NELL-1蛋白試劑通常和藥學上可以接受的載體(賦型劑)結合形成藥物組合物。藥學上可以接受的載體包括生理上可以接受的成分，例如增強藥劑的穩(wěn)定性或吸收。生理上可以接受的成分包括例如如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖的糖類，如維生素C或谷光甘肽的抗氧化劑，絡合劑，低分子量蛋白，降低抗有絲分裂劑清除率或水解的成分，或賦型劑或其他的穩(wěn)定劑和/或緩沖劑。
其他生理上可以接受的成分包括濕潤劑、乳化劑、分散劑或特別用來防止微生物生長或活動的防腐劑。不同種類的防腐劑是公知的，包括例如酚、維生素C。本領域人員可以選擇藥學上可以接受的載體，包括根據(jù)例如抗有絲分裂劑的給藥和抗有絲分裂劑的特定生理化學性質(zhì)選擇生理上可以接受的成分。U.S.專利5,385,887對優(yōu)選的骨形成蛋白(BMPs)運送的配方有所描述。
根據(jù)給藥方法，施用不同劑量單位的藥劑。例如，單位劑量形成合適的口服給藥，包括散劑、片劑、丸劑、膠囊和錠劑。公認地，如果口服給藥，必須保護NELL-1蛋白不被消化。典型地，其可以通過將蛋白與使其抗酸和水解的組合物絡合或?qū)⒌鞍装b在如脂質(zhì)體的合適穩(wěn)定載體中來實現(xiàn)。保護成分不被消化的方法對本領域是公知的(參見例如U.S.專利5,391,377描述用作口服治療劑的脂類成分)。
本發(fā)明藥物組合物對局部給藥特別有用，例如在外科傷口治療中促進骨復原和/或修復。在另外一個實施方案中，組合物對腸胃外給藥，例如靜脈給藥或者體腔或組織腔給藥是有用的。所給藥的組合物大體包括溶解在藥學上可以接受的載體中的NELL-1蛋白質(zhì)，優(yōu)選水溶蛋白質(zhì)的水載體?？梢允褂煤芏喾N類的載體，例如緩沖生理鹽水等。溶液是滅菌的并且通常不含有不需的物質(zhì)?？梢酝ㄟ^公知的滅菌技術來對這些組合物進行滅菌。所述組合物可以包括藥學上可以接受的輔助物質(zhì)，該物質(zhì)需要接近生理條件，如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑，毒性調(diào)節(jié)劑等等，例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。
這些配方中的NELL-1蛋白的濃度可以相差很大，以及根據(jù)選擇的特定給藥模式和病人的需要，可以主要以液體體積、粘度、體重等為基礎。典型地，以藥學上可以接受的溶液形式(包括來自凍干形式的重建)使用NELL-1蛋白。成骨質(zhì)蛋白的濃度在約1mg/ml為理想，更優(yōu)選的是2到8mg/ml，以使在沒有過度的成為必要的載體存在的情況下，可以運送藥學上有效量的蛋白質(zhì)。在一些應用中，可能需要2mg/ml以上的濃度。
如上所述，根據(jù)編址的臨床適應癥和不同病人的可變參數(shù)(例如重量、年齡、性別)以及臨床表現(xiàn)(例如損傷的程度、位置等)來決定劑量。通常來說，成骨質(zhì)蛋白的劑量在1到約10000μg的范圍內(nèi)，優(yōu)選約10到1000μg，更優(yōu)選約10到100μg。
2)骨移植材料 骨損傷以及其他很多損傷模型，會開始釋放一種對損傷康復過程很關鍵的生物活性劑。在骨中自然產(chǎn)生的骨形成素蛋白(BMP)，一旦從損傷處釋放出來就會刺激骨誘導并且重新產(chǎn)生丟失或損壞的骨組織。這種純化形式的相同蛋白質(zhì)可以用來刺激不管是在正常骨骼范圍之內(nèi)還是之外的骨的人工制作中可生物降解的基質(zhì)上的骨生長。不受特定理論的限制，可以相信以骨形成蛋白質(zhì)類似的方式來用NELL-1蛋白質(zhì)刺激骨頭的重新礦化。
根據(jù)上面的討論，可以系統(tǒng)地給藥NELL-1蛋白。另外，或可選地，可以直接將NELL-1蛋白應用到骨或骨折位置。其可以在外科中(例如當設置復雜的骨折，當重建骨，當進行骨移植時)進行或直接通過注射完成。
在某些優(yōu)選實施方案中，特別是進行外科骨重建或修復時，需要使用持續(xù)的運送“載體”給藥NELL-1蛋白。持續(xù)的運送載體包括但不限于生物降解運送載體。優(yōu)選的生物降解運送載體是更好的多孔。
在開發(fā)生物降解多孔運送載體中，已經(jīng)作了很多工作來控制物質(zhì)的釋放，同時為細胞附加和引導組織再生提供定位。生物降解材料通常分為兩類1)親水的；2)疏水的。親水材料(去除礦物質(zhì)的凍干骨，陶瓷，纖維蛋白，明膠等)對在材料內(nèi)部空隙中易于引入水溶的Nell-1蛋白質(zhì)的水具有高度親和性。疏水材料(L-聚乳酸，D，L-聚乳酸，聚-羥乙酸等)雖然在空隙范圍、總尺寸、形狀和機械特性中具有潛在的無限性，但較難“滲入”水溶液。為了增加這些材料內(nèi)部表面的溶液沉積，通常將疏水材料用蛋白質(zhì)或用表面活性劑飽和來增加蛋白質(zhì)(例如NELL-1)的注入。
包括如纖維蛋白原、聚乳酸、多孔陶土、明膠、瓊脂等等材料的各種可生物降解運送材料可以在例如U.S.專利Nos5,736,160，4,181,983，4,186,448，3,902,497，4,442,655，4,563,489，4,596,574，4,609,551，4,620,327和5,041,138中找到。
其他的運送載體包括但不限于骨移植材料。骨移植材料可以來自自然材料(例如移植的骨或骨片段)、合成材料(例如各種聚合物和/或陶瓷)或兩者的混合。典型地，骨移植材料可以用來填補或者取代丟失的骨組織。這樣的骨移植材料還經(jīng)常作為假肢器官裝置(例如骨替代或支持裝置)的組成部分，來促進與活骨的緊密結合/修復性的調(diào)整。
使用生物活性玻璃和磷酸鈣、膠原、混合物等的骨移植物具有好的生物相容性，并且在一些例子中引起骨組織的形成和合并?？梢曰蛘邌为毣蛘邽榱嘶謴湍康呐c丙烯酸聚合類、和其他的聚合物合并來使用很多不同的玻璃、玻璃-陶瓷和晶體相材料。這些材料包括羥磷灰石、氟磷灰石、氧磷灰石、硅灰石、鈣長石、氟化鈣、氟硅鈣鈉石(agrellite)、失透石、硅堿鈣石、金云母、三斜磷鈣石、磷酸氫鈣、磷酸八鈣、白磷礦石、磷酸四鈣、堇青石和塊磷鋁礦。描寫這些用途的代表性專利包括U.S.專利No.3,981,736，4,652,534，4,643,982，4,775,646，5,236,458，2,920,971，5,336,642，and 2,920,971。額外的參考包括日本專利No.87-010939和德國專利OS 2,208,236。其他的參考可以在W.F.Brown，″Solubilities of Phosphate & Other Sparingly SolubleCompounds，″Environmental Phosphorous Handbook，Ch.10(1973)中找到。除上述以外，來自動物的包括珊瑚和珍珠的某一材料，也可以作為增強的目的用在生物材料中。
其他的骨移植材料包括用15到75％重量的生物活性玻璃和1到10％重量的玻璃體礦物纖維強化的柔軟、模壓的丙烯酸基骨膠接劑(U.S.專利No.4,239,113)，如磷酸三鈣的骨填料和添加到可通過如混合胺的過氧化苯甲酰過氧化物系統(tǒng)聚合的雙酚-A-縮水甘油基異丁烯酸鹽(bis GMA)的生物陶瓷A2，(Vuillemin等人(1987)Arch.Otolygol.Head Neck Surg.113836-840)?？赏ㄟ^氫化鈣接合劑反應固化的兩種成分，含有水楊酸鹽和丙烯酸酯的樹脂合成物在U.S.專利No.4,886,843中有所描述。U.S.專利No.5,145,520和5,238,491公開了裝填物和接合劑?？梢灾谱魃鲜霾牧蟻硪隢ELL-1蛋白質(zhì)。
另外，包括骨形成蛋白質(zhì)的移植材料是已知的。因此，例如U.S.專利4,394,370描述了在適合骨缺陷體內(nèi)移植的棉球上制造重組膠原質(zhì)和去礦化骨顆?；蛑亟M膠原質(zhì)和溶解的骨形成蛋白質(zhì)的絡合物。類似的，US專利5,824,084描述了由生物相容的、可植入的，優(yōu)選帶有電荷的表面的移植材料制成的物質(zhì)。生物相容的、可植入的移植材料的例子包括，含有磷酸鈣的合成陶瓷、一些聚合物，去礦化骨基質(zhì)或礦化骨基質(zhì)。這些材料可以另外含有結合到物質(zhì)表面的細胞粘附分子。術語“細胞粘附分子”是指層粘連蛋白、纖維連接蛋白、玻璃粘連蛋白、脈管細胞粘附分子(V-CAM)和細胞間粘附分子(I-CAM)以及膠原質(zhì)。特別合適的移植材料包括，例如分離的礦物化多孔骨片段，礦物化骨粉末或顆粒，胍-鹽酸萃取的去礦化骨基質(zhì)，燒結的皮層或多孔骨，Interpore出售的商品名稱為Interpore 500的珊瑚羥磷灰石和例如Zimmer出售的合并到骨移植代替品Collagraft的粒狀陶瓷，或Orquest以膠原質(zhì)為原料制作的絲狀棉球。NELL-1蛋白可以引入到任何一種骨移植材料或取代骨形成蛋白。
VII.試劑盒 在另一實施方案中，本發(fā)明提供實現(xiàn)這里所述測定和組合物用途的試劑盒。在優(yōu)選實施方案中，試劑盒包括一個或多個含有抗體和/或核酸探針和/或適合檢測NELL-1表達和/或活性水平的物質(zhì)的容器。試劑盒可以選擇性地包括有助于實現(xiàn)這里所述方法的任何試劑和/或設備。這樣的試劑包括但不限于緩沖劑、標記，標記的抗體，標記的核酸。用于可視熒光標記的過濾裝置，印跡膜等等。
在另外一個實施方案中，試劑盒包括含有NELL-1蛋白或編碼NELL-1的載體和/或含有編碼NELL-1蛋白質(zhì)載體的細胞的容器。
另外，試劑盒可以包括含有對實現(xiàn)本發(fā)明方法或這里所述組合物給藥與外殼的指導(例如方案)的說明材料。雖然這些說明材料通常包括不限于此的書面或印刷材料。具有儲存這些指導和與使用者之間的溝通能力的任何媒介都在本發(fā)明預期之內(nèi)。這些媒介包括但不限于電子儲存媒體(磁盤、磁帶、卡帶、盒式磁帶、芯片)，光媒體(例如CD ROM)等等。這些媒體包括提供這些說明材料的英特爾網(wǎng)址。
實施例 下述實施例是為了解釋而不是為了限制本發(fā)明的。
實施例1NELL-1促進胎兒顱蓋成骨細胞的礦化 下述的NELL-1基因的核酸序列全長cDNA與小雞的Nel基因具有61％的同源性，因此命名為人類NELL-1基因(Watanabe等人(1996)Genomics.38(3)，273-276).NELL-1蛋白質(zhì)包括一個信號肽，一個NH2-末端血小板反應蛋白(TSP)-樣模塊 and Bier(1995)Cell.80(1)19-20)，5個維勒布蘭德因子C結構域和6個EGF-樣結構域。
人類NELL-1基因表達主要定位在骨前端、沿著側骨縫骨邊緣的間質(zhì)細胞和成骨細胞和新形成骨的凝集間質(zhì)細胞中。人類多器官組織mRNA印跡測定顯示在胎兒腦部，而不在胎兒肺臟、腎臟和肝臟中特異性表達人類NELL-1。我們也發(fā)現(xiàn)，在大鼠的顱骨骨原細胞，而不在大鼠的脛骨和培養(yǎng)的基質(zhì)細胞、成纖維母細胞中表達NELL-1。我們的資料證實主要在頭蓋膜內(nèi)骨和神經(jīng)組織(神經(jīng)脊器官)中表達NELL-1基因。
A)材料和方法 對妊娠第7、11、14、17天的小鼠胚胎進行全套RNA分析。構建帶有NELL-1cDNA的腺病毒(敲除E1-A并帶有MCV啟動子的AD5)，并用其感染大鼠胚胎顱骨原細胞和MC3T3細胞系。按下述方法構建病毒用10mgPJM17(包含有缺陷腺病毒基因組)和pAC-CMV-based質(zhì)粒(含有使用CaPO4的有義或反義大鼠NELL-1)共轉(zhuǎn)染293個細胞，來在10-14天中產(chǎn)生表達大鼠NELL-1基因的重組腺病毒載體。噬菌斑純化病毒并且進行Southern印跡方法來確認NELL-1基因的并入。用包含有β-牛乳糖基因的腺病毒作為對照，來檢測不同細胞感染的有效性。在MC3T3細胞和NIH3T3細胞中觀察到感染的有效性約為80-90％。
在感染后的14，17，21天，進行馮科薩氏染色。用ImagePro系統(tǒng)定量礦化的區(qū)域。用雙側t檢驗進行統(tǒng)計分析。認為*p＜0.01的統(tǒng)計上P值是有意義的。抽提過量表達NELL-1細胞的RNA，并且進行小鼠cDNA的序列分析。用磷屏成像儀定量雜交信號。
B)結果 從妊娠14天開始微弱地表達NELL-1mRNA，并在妊娠周期中有少量的增加。妊娠14天是顱骨開始礦化的時間點。培養(yǎng)的第一代大鼠胚胎顱骨細胞與過度表達NELL-1的MC3T3細胞顯示出比對照的β-牛乳糖增加的礦化。與對照組相比，在妊娠后第17天，NELL-1過量表達在顱蓋成骨原細胞培養(yǎng)物中的礦化作用增強近30倍。根據(jù)馮科薩氏染色和IMAGEPRO軟件定量分析得到上述結果。上述增加礦化作用在妊娠的21天減弱2倍。NELL-1轉(zhuǎn)染的MC3T3細胞得到的小鼠cDNA序列分析顯示與對照組相比，BMP-7基因表達下調(diào)20％，以及分手和腳基因(Split Hand and Foot gene)表達上調(diào)3倍。這兩種基因與骨形成和顱面發(fā)育有密切關系。
C)討論和結論 這個研究中，我們清楚的證實了NELL-1與骨形成有密切的關系及其增加了顱骨成骨樣細胞的礦化。清楚的鑒定出一些下游效應因子在骨形成和胚胎發(fā)育中起到的重要作用。顱骨早閉，也就是CS，可能與顱骨的過度形成有關，因此很可能與NELL-1分子的過度表達有關。這些結果以及NELL-1蛋白質(zhì)功能的初步分析早期表明NELL-1蛋白質(zhì)是生物學相關蛋白質(zhì)。NELL-1蛋白質(zhì)可能作為一種與其他的生長因子相互作用的調(diào)節(jié)器。最近發(fā)現(xiàn)，TSP-1是TGFβ-1的主要激活因子 and Bier(1995)Cell.80(1)19-20)。TGFβ-1在多數(shù)細胞中是以不與細胞受體結合的非活性形式分泌的。TGFβ-1最初與稱為潛伏結合蛋白(LAP)的其NH2-末端的二聚體，通過非共價結合而隱藏其活性。在細胞外激活TGFβ-l，使TSP-1與LAP的NH2-末端相互作用，形成三分子絡合物。在絡合物中，發(fā)生構像的改變，使其可以與受體結合。在原腸胚形成中隱藏具有四個vWF C結構域(大概是同三聚體)的高度同源性分子如脊索蛋白(chordin)，而在非洲蟾蜍屬腹背模式中起重要作用(Crawford等人(1998)Cell.93(7)1159-1170)。最近發(fā)現(xiàn)脊索蛋白直接與腹部的BMP-4(骨形成蛋白4，TGFβ超家族成員之一)結合，并且中和BMP-4的活性(Piccolo等人(1996)Cell，86(4)589-598)。上述結果顯示，在細胞外NELL-1蛋白質(zhì)可能是通過與一些TGFβ超家族成員的相互作用來進行其未知功能。因為TGFβ-1是一個已知的調(diào)節(jié)骨形成的因子，NELL-1的促進礦化作用可以與其和TGF蛋白質(zhì)超家族的相互作用有關。
實施例2過度表達Nell-1的轉(zhuǎn)基因小鼠中的顱縫早閉 前述我們報道了在顱縫早閉(CS)患者顱縫早閉過程中，作為新型分子過度表達的Nell-1，顱縫早閉是常見的先天性顱骨畸形之一。這里我們描述了過度表達Nell-1轉(zhuǎn)基因小鼠的制作和分析。Nell-1轉(zhuǎn)基因動物表現(xiàn)出，從簡單到復雜骨性結合的CS樣表形。在組織學上，這些動物骨前端的非正常閉合/顱縫閉合說明顱骨的過度生長和交疊是與成骨細胞的分化加速和增值減少同時發(fā)生的。此外，盡管Nell-1的廣義，非組織特異性的過度表達，異常僅發(fā)生于顱骨。在體外，常規(guī)的細胞培養(yǎng)中，Nell-1過度表達可以加速顱骨成骨細胞的分化和礦化。并且成骨細胞中的Nell-1過度表達足以促進堿性磷酸酶的表達和小結節(jié)的形成。相反地，在體外Nell-1的下調(diào)抑制成骨細胞的分化?？偟膩碚f，Nell-1過度表達誘導顱骨過度生長，導致嚙齒類動物模型的骨縫提前閉合。因此Nell-1在CS發(fā)生中具有重要作用，可能是導致顱縫早閉復合鏈中的一個環(huán)節(jié)。在一定細胞水平上，Nell-1的表達可以調(diào)節(jié)成骨細胞的分化，并且對于成骨細胞的分化，其是必須和重要的。
方法過度表達Nell-1轉(zhuǎn)基因小鼠的制備 應用CMV啟動子和SV40多聚腺苷位點將大鼠Nell-1 cDNA從pTM-70(13，14)亞克隆至pCDNA1.1(Invitrogen，Carlsbad，California，USA)。首先將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MC3T3細胞(一種小鼠的顱骨細胞系)來證實正確的蛋白質(zhì)表達(資料未顯示)。包含有CMV啟動子，Nell-1基因和SV40多聚腺苷位點的4.76-kb DNA片段用于卵母細胞的微注射。用標準方案制備轉(zhuǎn)基因的B6C3小鼠(15)。奠基者(The founder)與其非轉(zhuǎn)基因的同窩出生仔畜交配，建立轉(zhuǎn)基因系。
轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)量分析 應用PCR和Southern印跡分析測定轉(zhuǎn)基因數(shù)量。從http://www.med.umich.edu/tamc/spike.html(16)獲得測定轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)量的PCR方案?；诩俣ú溉閯游锘蚪M單倍體容量是3□109bp并且其需要10□g DNA來阻止，計算作為N bp轉(zhuǎn)基因DNA/3□109基因組DNA的每5□g基因組DNA中的轉(zhuǎn)基因DNA數(shù)量。插入尺寸是4.76kb，一個復制規(guī)格是7.933pg每10□g基因組DNA。進行30個周期的PCR，用溴乙錠電泳分離產(chǎn)物。用鷹眼II方法計算強度(Stratagene，La Jolla，California，USA)。
免疫組織化學 制備Nell-1抗體的詳細方法見Kuroda等人的文獻(13，14)?？贵w識別Nell-1的COOH-末端(CSVDLECIENN)。使用從Nell-1轉(zhuǎn)染的NIH3T3細胞中抽提的蛋白質(zhì)，通過Western印跡鑒定抗體的特異性。將標準的生物素抗生物素絡合物/免疫過氧化酶方案(Vector EliteKit；Vector Laboratories INC.，Burlingame，California，USA)與1∶100抗體稀釋液一起使用。二氨基聯(lián)苯胺過氧化酶基質(zhì)和3-氨基-9-乙基咔唑用于顯色，用蘇木素復染片段。
磁共振成像 使用Bruker Biospec磁共振成像儀(Bruker BioSpin GmbH，Rheinstetten，Germany)將福爾馬林保存的樣本進行磁共振成像(MRI)，磁共振成像儀帶有7.0-T，18-cm的清晰孔磁體，并裝有微成像梯度組和35-mm內(nèi)徑的鳥籠射頻圈。通過使用帶有如下參數(shù)的梯度回波過濾像恒定脈沖序列得到腦和顱蓋的軸位和矢形圖象TR/TE，229.3/64.1ms；回轉(zhuǎn)角，30°；視野，2.3cm；矩陣，256×256；薄片厚度，1mm；和激發(fā)次數(shù)，8。平面空間分辨率約為90μm。
微型計算機的體層掃描 在30kVp和750mA下收集所有數(shù)據(jù)。使用MicroCat掃描儀(Oak Ridge National Laboratory，Oak Ridge，Tennessee，USA)提供的錐形束運算法則對這些數(shù)據(jù)進行重建。矩陣是256×256×256，產(chǎn)生140μm的等方性分辨率。定量程序包括含有0，50，250和750mg/cc羥磷灰石骨幻影(圖像中的長棒)的布置。通過使用MetaMorph(二維)(Universal Imaging Corp.，West Chester，Pennsylvania，USA)和Amira(三維)(Indeed-Visual Concepts GmbH，Berlin，Germany)得到可視數(shù)據(jù)。
體內(nèi)增值分析 新生小鼠注射100ug/g的BrdU。注射2小時后動物死亡。固定動物并用BrdU抗體(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，USA)進行免疫染色。將轉(zhuǎn)基因動物的顱骨骨縫，腦，脛骨與其同窩出生仔畜相比較。
隱藏Nell-1(AdNell-1)和反義Nell-1(AdAntiNell-1)的重組缺陷腺病毒載體 將大鼠Nell-1 cDNA雙向插入到人類CMV IE1啟動子和側面與Ad5病毒的1到454和3,334到6,231核苷酸序列連接的SV40縫接/多腺苷酸位置上。得到的質(zhì)粒，pAdCMV-Nell-1，轉(zhuǎn)錄相對于Ad5標準圖左側的Nell-1。pAdCMV-Nell-1和pJM17(MICROBIX BiosystemsInc.，Toronto，Canada)共同轉(zhuǎn)染293細胞，來分離重組的腺病毒(Ad)(AdNell-1)，致使載體EL-A基因的缺陷。噬菌斑純化，并用Southern印跡分析證實重組病毒的克隆。當通過CsCl軟墊和再次CsCl連續(xù)梯度時，AdNell-1和AdLacZ都長至高滴度和純度。根據(jù)293細胞上的噬菌斑格式測定，結果材料是5×109pfu/ml。進行Northern印跡和Western印跡以確認Nell-1基因的插入和蛋白質(zhì)表達及其表達量。
大鼠顱骨細胞原細胞培養(yǎng)物(FRCCs) 按前述的方法分離胚胎第18天(E18)的大鼠顱骨成骨細胞(12)。將從老化四、五、六收集的細胞組成庫并且平鋪為2.5×104/cm2。使用階段二中的細胞。成骨細胞的腺病毒感染。為了觀察Nell-1的過度表達效果，在六孔盤中培養(yǎng)來自不同世系的成骨細胞至80％的融合。培養(yǎng)物是透氣的并且將感染劑量(1ml沒有血清的培養(yǎng)基中20pfu/細胞)加入到培養(yǎng)物中。使用五組AdNell-1，AdAntiNell-1，和帶有β-半乳糖苷酶(Adβ-Gal)的對照Ad。感染12，15和21天后進行馮科薩氏染色。用Pro Plus成像系統(tǒng)(Media Cybernetics，Silver Spring，Maryland，USA)分析礦化的百分比。采用t檢驗進行大鼠間的比較。為了觀察Nell-1下調(diào)的效應，按前述的方法在胎鼠顱骨的培養(yǎng)細胞(FRCC)中加入AdAntiNell-1。
微點陣分析 在感染后的第6，9和12天，對來自AdNell-1-和Adβ-Gal-感染的MC3T3細胞的RNA進行微點陣分析。I.Nishimura和CaliforniaLos Angeles大學微點陣磁心器件人員已經(jīng)開發(fā)了與骨有關的微點陣。該微點陣包括帶有多于十個內(nèi)部對照基因的超過37個基因。確認指示劑包括骨基質(zhì)蛋白質(zhì)(骨橋接素，骨連接素，骨鈣素，骨唾液蛋白)；受體(a2-整合素，維生素D受體，甲狀旁腺受體，雌激素受體)；造骨細胞指示劑(堿性磷酸酶，Cbfa1)；吸附蛋白(纖維結合素，硫酸軟骨素蛋白多糖1，核心蛋白多糖，細胞粘合素，syndecan，層粘連蛋白)；金屬蛋白酶(基質(zhì)金屬蛋白酶1和2)；生長因子(Bmp2，Bmp7)；原纖維膠原蛋白(膠原蛋白1A1，1A2，3A1，5A2和11A1)；其他膠原蛋白(膠原蛋白4A1，6A1，7A1，10A1和15A1)，和帶有不規(guī)則三股螺旋的原纖維-連接膠原蛋白(FACITs)(膠原蛋白9A1，9A2，12，14，16和19)。用隨機的六個引物和Cy3-或CY5-dUTP標記RNA(用于Cy3的30ug總RNA和用于Cy5的60LLG)。逆轉(zhuǎn)錄酶標記的探針在點陣上雜交。用418點陣掃描儀(Affymetrix Inc.，Santa Clara，California，USA)進行多重激光掃描，來提供有用讀數(shù)和標準差以驗證該方法的可重復性。計算所有內(nèi)部對照的均值并且使用IPLAB 3.2版本微點陣組(Scanalytics Inc.，F(xiàn)airfax，Virginia，USA)來使雜交強度規(guī)格化。所有造骨細胞指示劑的關系作為一組進行計算并且在AdNell-1-感染的細胞和Adβ-Gal-感染的對照細胞之間進行比較。使用RT-PCR.DNase處理的總RNA。通過高-循環(huán)PCR對基因片段表達進行最初證實后，用另外低-循環(huán)PCR來對相關的基因表達進行定量(12)。對于每個候選分子，我們測定最可能通過連續(xù)的減少循環(huán)數(shù)量(范圍，15-35循環(huán))落入線形擴增范圍內(nèi)的循環(huán)數(shù)量。進行電泳并且與標記為wit P32的探針特異性序列雜交。使用磷屏成像儀(Molecular Dynamics，Sunnyvale，California，USA)來測定強度。用Gapdh值對每個樣品的光密度值進行分組(在20個循環(huán)時進行)并且規(guī)格化。引物序列如下。Msx2前，5′-CCT CGG TCA AGT CGG AAA ATT C-3′(SEQ ID NO2)；逆，5′-TGGACA GGT ACT GTT TCT GGC G-3′(SEQ ID NO3)；探針，5′-GAG CACCGT GGA TAC AGG AG-3′(SEQ ID NO4)；(退火溫度，68℃)。Cbfa1前，5′-CTG TGT GGC TCC TAA CAA GTG TG-3′(SEQ ID NO5)；逆，5′-GGA TTC TGG CAA TCA CAA GCT GTC-3′(SEQ ID NO6)；探針，5′-CCT ACT CAC TGT CCG GGG AGT CCT GC-3′(SEQ ID NO7)(退火溫度，66℃)。骨鈣素前，5′-ATG AGG ACC CTC TCT CTG CTC-3′(SEQID NO8)；逆，5′-GTG GTG CCA TAG ATG CGC TTG-3′(SEQ ID NO9)，探針5′-CAT GTC AAG CAG GGA GGG CA-3′(SEQ ID NO10)，(退火溫度，66℃)。骨橋蛋白前，5′-AGC AGG AAT ACT AAC TGC-3′(SEQ IDNO11)；逆，5′-GAT TAT AGT GAC ACA GAC-3′(SEQ ID NO12)探針5′-GCC CTG AGC TTA GTT CGT TG-3′(SEQ ID NO13)，(退火溫度66℃).Nell-1(12)。
流式血細胞計數(shù)分析 將細胞以5×105細胞/盤接種到60-mm盤。在AdNell-1和Adβ-Gal感染后24，36，48，和72小時得到細胞。使用一百萬個細胞來做流式血細胞計數(shù)，重復該程序三次。為了進行流式血細胞計數(shù)，在細胞中加入用含有碘化丙啶(propidium iodide)的低滲性DNA染色緩沖液。
結果CMV啟動子/Nell-1轉(zhuǎn)基因小鼠的構建 為了研究廣義上Nell-1在體內(nèi)的過度表達，制備轉(zhuǎn)基因小鼠，在CMV啟動子的控制下表達轉(zhuǎn)基因小鼠中的Nell-1。通過Southern印跡和PCR(圖2A)來驗證復制數(shù)量。RNA分析(圖2B)和免疫組織化學(資料未顯示)進一步驗證了奠基者(founders)中Nell-1的表達。Nell-1-過度表達的奠基者和沒有轉(zhuǎn)基因的同窩出生仔畜交叉，并且對F2后代進行了全面分析。由于大多數(shù)人類CS顯型易于表現(xiàn)在新生兒上，所以檢測了來自兩個世系的代表六窩的42只新生小鼠。對這些小鼠的形態(tài)進行包括骨縫閉合的發(fā)育異常分析。隨后對這些小鼠進行基因分類。通過骨縫下面的可見血管的不存在(顯示骨縫閉合)或存在(顯示骨縫明顯)來檢測骨縫的開放。通過解剖顯微鏡進一步驗證骨縫閉合。檢測六窩中的兩窩，代表20個后代，沒有產(chǎn)生任何帶有明顯顱面缺陷的新生小鼠，而Nell-1轉(zhuǎn)基因的則有。這些窩沒有進行進一步的檢測。剩余四窩中的每窩中帶有顱面缺陷的后代得到了恢復。這四窩后代(退火溫度，66℃)。骨鈣素前，5′-ATG AGG ACC CTC TCT CTG CTC-3′(SEQID NO14)；逆，5′-GTG GTG CCA TAG ATG CGC TTG-3′(SEQ ID NO15)，探針5′-CAT GTC AAG CAG GGA GGG CA-3′(SEQ ID NO16)，(退火溫度，66°C)。骨橋蛋白前，5’-AGC AGG AAT ACT AAC TGC-3′(SEQ ID NO17)；逆，5′-GAT TAT AGT GAC ACA GAC-3′(SEQ IDNO18)探針5′-GCC CTG AGC TTA GTT CGT TG-3′(SEQ ID NO19)，(退火溫度，66℃)。Nell-1(12)。進一步分析(22只小鼠)。這種快速篩選方法的局限性在于可能檢測不到只帶有骨縫閉合焦點的輕微CS，因此Nell-1過度表達可能出現(xiàn)低外顯率。
22只新生小鼠中有13只(60％)是轉(zhuǎn)基因小鼠，其基因復制數(shù)與奠基者Nell-1小鼠相似(預計為50％)。檢測13只Nell-1 DNA陽性(F2)小鼠(TF2)的Nell-1 RNA水平。8只(62％)小鼠的Nell-1RNA表達為陽性。但是表達水平各異(圖表2C)。雖然有些小鼠具有高的基因復制，而Nell-1表達水平低或幾乎不表達Nell-1的原因尚不明確，但是外源性因素如插入?yún)^(qū)周圍異染色質(zhì)形成可以在轉(zhuǎn)基因表達的高度異質(zhì)性中起重要作用(17)。從同一窩中分離出來的不同組織的RNA水平不同。Liu等用CMV啟動子過度表達Msx2也發(fā)現(xiàn)了這種多樣性(5，6)。因此Nell-1轉(zhuǎn)基因的表達與其復制基因數(shù)不一定相關，并且還可能根據(jù)細胞類型變化。為確定轉(zhuǎn)基因模型中的過度表達Nell-1是否與生理作用有關，我們比較了3個輕微CS表型的TF2子代和非轉(zhuǎn)基因正常同窩出生仔畜(NF2小鼠)的Nell-1 RNA表達水平。TF2小鼠的Nell-1表達增加四倍(資料未給出)。這與觀察到的CS患者的NELL-1表達水平升高2-4倍相似(12)。這表明我們模型的Nell-1過度表達的水平在臨床上是適當?shù)亩浅淼摹?br> Nell-1轉(zhuǎn)基因小鼠的表形分析 8只Nell-1 RNA陽性的TF2小鼠中的3只有嚴重的顱面異常，于出生后不久死亡(見圖3A-3C和圖)。這些小鼠的全身mRNA都可以檢測出Nell-1轉(zhuǎn)基因的表達(圖2C)，并且通過皮膚，肝臟和顱骨的免疫染色進行證實(圖2D)。
對受到最嚴重影響的TF2小鼠之一的形態(tài)學檢查表明在頂骨區(qū)域有一個帶有完全閉合的矢狀面和后前額(PF)骨縫以及局部閉合冠狀面骨縫的大突出(圖3A-3C)。
在臨床上，其與顱骨異常，也就是帶有就是矢狀面，額狀面及冠狀面的，并伴有次額骨隆起和腦膨出的過早骨縫閉合的一種人類CS表型非常相似(圖3D)(1)。這種TF2小鼠的腦MRI顯示出腦室的明顯減小以及增加的腦實質(zhì)水腫，此兩者都說明顱內(nèi)壓的增高(圖表3E)。在顱縫早閉的顱骨內(nèi)腦組織的持續(xù)生長會造成未經(jīng)治療的CS患者的顱壓升高。微型計算機斷層(MCT)掃描和磁共振分析也顯示出上述TF2小鼠的顱骨結構異常(圖3F和3G)。
組織學檢查發(fā)現(xiàn)Nell-1表型陽性的TF2小鼠與同窩出生的NF2有明顯差別。同人類CS相同，TF2小鼠顯示出組織學上可見的顱縫早閉，如正面骨縫閉合/重疊形成的濃厚，雜亂的脊(圖4a和b)。全部封固骨骼染色顯示顱外骨骼沒有可觀察到的異常。腭骨和下頜骨、脊椎骨和長骨的蘇木素、曙紅和酒石酸磷酸染色顯示出沒有任何組織學異常，也沒有成骨細胞數(shù)量的增加。因此Nell-1的表達看起來僅限于顱骨。盡管周圍組織Nell-1的表達歸因于CMV啟動子的應用，但是TF2小鼠表現(xiàn)出主要影響顱縫的開放和關閉的特異性顱骨異常。在體內(nèi)的免疫組織化學顯示出成骨細胞分化標記物表達的增加(圖4塊c和d)。
表達Nell-1的TF2小鼠顱縫早閉的原位BrdU分析顯示出沿骨縫邊緣，在顱骨生成區(qū)域內(nèi)的細胞增生數(shù)量明顯減少(表4塊e和f)。這些數(shù)據(jù)顯示出Nell-1過度表達與成骨細胞分化有關。沿TF2和NF2小鼠的顱縫，沒有觀察出每單位面積內(nèi)細胞數(shù)量具有統(tǒng)計學差別(表4塊g)。細胞增生的減少有兩種可能，有可能是由于分化的成骨細胞的增生能力弱而間接導致的，或是由于成骨細胞增生能力減低而直接造成的。
第二個嚴重影響TF2動物的形態(tài)學測定顯示出明顯的顱縫消失，尤其是在帶有在枕骨(后部)區(qū)域膨出的正中線(也就是矢狀線和后額縫)?？傊滹B骨細窄，并且與人類舟狀顱和矢狀骨連接成熟過早畸形相似。MCT掃描顯示后顱縫完全閉合，部分矢狀和冠狀顱縫閉合(圖5B)。組織學上的關聯(lián)顯示出矢狀縫附近區(qū)域發(fā)生的顱骨過度生長和重疊(圖5B)。
為研究TF2妊娠期的胚胎發(fā)育過程，處死2只同窩出生的E15 TF2孕鼠。從19只孕鼠中的兩只觀察到不能存活的露腦畸形樣表現(xiàn)型的胎鼠。有趣的是Liu等報道了過度表達Msx2的小鼠也出現(xiàn)相同表型(6)。這種表型的病因?qū)W還不清楚。上述結果可能有助于解釋嚴重影響新生小鼠中TF2子代的可觀察到的低發(fā)生率。
體外Nell-1過度表達可以加速成骨細胞的分化認為骨形成調(diào)節(jié)紊亂是顱骨過度生長/重疊和顱縫早閉的一種可能機制(18)。因為骨縫部位的異常骨生成是顯示出顱縫早閉的Nell-1 TF2小鼠的主要特征，我們猜測Nell-1過度表達可能會改變正常顱骨成骨細胞的細胞周期和分化路徑，從而促進骨生成提前。
為了證明我們的假說，我們首先測定Nell-1對骨礦化作用的影響，礦化是體外成骨細胞分化的標志。用含有抗壞血酸的20pfu/細胞的AdNell-1感染主要的FRCC和MC3T3(一種小鼠顱骨成骨細胞樣細胞系)培養(yǎng)物。抗壞血酸對于誘導和終止成骨細胞的分化和礦化是必須的(19)。ADNell-1轉(zhuǎn)染后的FRCC和MC3T3比Adβ-Gal-感染，作為對照)細胞的礦化更快且更豐富(多6倍)(圖6A和6B)。相反，AdNell-1轉(zhuǎn)染并沒有在NIH3T3，成熟或胚胎大鼠的成纖維細胞中引起任何礦化響應(資料未給出)。這些資料證實Nell-1加速成骨細胞礦化，以及這種作用具有成骨細胞特異性。
我們前面的體內(nèi)BrdU分析結果表明，在TF2小鼠體內(nèi)沿正面骨生成區(qū)域的細胞增值的減少。為了證明體外Nell-1過度表達是否影響細胞周期，在轉(zhuǎn)染后第24和48小時，對AdNell-1-轉(zhuǎn)染的MC3T3細胞(和Adβ-Gal對照，含有或不含有抗壞血酸，經(jīng)過或不經(jīng)過24小時的血清饑餓)進行流式血細胞計數(shù)分析。不同細胞周期的細胞數(shù)在統(tǒng)計學上沒有顯著性差異(雙側t檢驗，P＞0.05)。轉(zhuǎn)染Nell-1后MC3T3細胞增值沒有減少的事實可能從體外和體內(nèi)成骨細胞的固有差別，或者細胞外環(huán)境或不同細胞分化周期的影響中反映出來。
通過成骨細胞的分化，及其后的結節(jié)形成(成骨細胞聚集物)預示一般的體外成骨細胞礦化。這種分化過程需要抗壞血酸。有趣的是，當在沒有抗壞血酸的情況下培養(yǎng)時，AdNell-1轉(zhuǎn)染的MC3T3細胞在轉(zhuǎn)染后的第3天也出現(xiàn)了表達堿性磷酸酶的結節(jié)；而對照組Adβ-Gal-轉(zhuǎn)染細胞沒有結節(jié)。但是可以在沒有抗壞血酸的條件下誘導結節(jié)形成的Nell-1作用微弱(在100×鏡下觀察，每個結節(jié)中≤20個細胞)，并且通過馮科薩氏染色沒有發(fā)現(xiàn)礦化(圖6C)。而且，在這些“小結節(jié)”中沒有發(fā)現(xiàn)晚期分化標記物如骨橋蛋白。在沒有抗壞血酸的條件下由AdNell-1轉(zhuǎn)染成骨細胞得到的小結節(jié)形成，說明僅Nell-1就可能引起細胞與細胞的黏附，但是僅有Nell-1不足以誘導成骨細胞分化。
為了證實Nell-1增強成骨細胞分化，我們在將轉(zhuǎn)染后第6，9和12天，對在帶有抗壞血酸的正常條件下培養(yǎng)的AdNell-1轉(zhuǎn)染的MC3T3細胞的RNA進行微點陣分析(圖6D-6F)。微點陣分析的目的是應用回歸分析來確定AdNell-1轉(zhuǎn)染以及Adβ-Gal-轉(zhuǎn)染的對照細胞的所有成骨細胞分化標記物表達模式是否有顯著差別。在第12天，ADNell-1轉(zhuǎn)染的細胞和Adβ-Gal-轉(zhuǎn)染中成骨細胞分化標記物表達模式顯示出顯著差別(r2＝0.334)。本試驗所用的微點陣分析不是為了定量分析單獨基因的表達。單個基因表達模式應該謹慎解釋，例如應該分析基因的兩或多倍以上的上調(diào)或下調(diào)。還應該應用RT-PCR或RNA分析來證實其結果。在AdNell-1轉(zhuǎn)染的細胞中，晚期分化標記物，如Bmp7，骨橋接素和骨鈣素上調(diào)了兩倍以上，而早期標記物，如膠原蛋白I和骨連接素下調(diào)了兩倍以上。(圖6G)。這表明Nell-1促進成骨細胞的分化。用RNA電泳法證實骨鈣素和骨橋接素的RNA上調(diào)(見圖7C和7D)?；蛘呶Ⅻc陣分析或者減少循環(huán)的RT-PCR分析都沒有發(fā)現(xiàn)AdNell-1轉(zhuǎn)染的MC3T3細胞的Cbfa1，TGF-β1，-β2，和-β3，或Tgf-β型-I，-II，和-III受體，F(xiàn)gfr1，或Fgfr2的表達有意義變化(資料未給出)。這些表明Nell-1可以作用于上述候選基因的下游，或可以影響完全不同的通路。
體外下調(diào)Nell-1延遲成骨細胞的分化 為了進一步闡明Nell-1對成骨細胞分化的生理作用，我們用含有反義Nell-1的腺病毒轉(zhuǎn)染成骨細胞，來檢測下調(diào)Nell-1蛋白質(zhì)的影響。在有抗壞血酸的情況下，用20pfu/細胞的AdAntiNell-1轉(zhuǎn)染FRCC培養(yǎng)物。AdAntiNell-1下調(diào)Nell-1蛋白質(zhì)表達至普通水平的40％(圖7A)。與Adβ-Gal-轉(zhuǎn)染的對照組或AdNell-1轉(zhuǎn)染的細胞相比，AdAntiNell-1轉(zhuǎn)染的FRCC表達的堿性磷酸酶明顯減少(圖7B)。還下調(diào)AdAntiNell-1細胞中骨鈣蛋白和骨橋接素RNA的表達(圖7C和7D)。通過Northern分析法顯示，AdAntiNell-1轉(zhuǎn)染的細胞與Adβ-Gal-對照細胞的骨鈣蛋白的比例在第9天是1∶4，在第12天是1∶2。AdAntiNell-1轉(zhuǎn)染的細胞與Adβ-Gal-對照細胞的骨橋接素的比例在第6和第9天是1∶5，在第12天是2∶5。因此，下調(diào)數(shù)據(jù)對過度表達的數(shù)據(jù)進行了補充，并且證明了Nell-1在成骨細胞分化中具有重要作用。
討論 NELL-1是一個相對新發(fā)現(xiàn)的從前不知其功能的分子。因為在(CS)患者的顱縫早閉中觀察到易變性的NELL-1上調(diào)，我們在小鼠模型中模擬了NELL-1的過度表達以研究Nell-1在顱骨發(fā)育和病理中的新作用。我們發(fā)現(xiàn)Nell-1轉(zhuǎn)基因小鼠中的顱縫早閉，以及增強的成骨細胞分化。因此Nell-1可能是調(diào)節(jié)顱縫閉合的一個候選基因，其過度表達可能在CS顱縫早閉的機理中具有重要作用。根據(jù)我們體外Nell-1過度表達和基因敲除的研究資料，Nell-1最主要的作用是影響成骨細胞的分化，雖然其分子機制尚不清楚。
Nell-1可能通過與配體結合，然后螯合或激活配體，以及激活受體介導的信號通路(20)來誘導成骨細胞的分化。Nell-1與脊索蛋白樣，富含半胱氨酸結構域，NH2-末端凝集蛋白樣分子和EGF樣重復體的結合使Nell-1可能成為生長因子活性的調(diào)節(jié)劑。為證實上述可能性，我們進行了預試驗。為確定Nell-1是否與已知的EGF-樣受體結合，我們先將Nell-1加入表達ErB1，-2，-3或-4的IL-3-依賴細胞中。Nell-1的加入不能激活這些受體的酪氨酸磷酸酶活性。因此，盡管Nell-1是一個已知的帶有EGF樣重復的隱藏活性蛋白質(zhì)(13)，Nell-1也不是上述受體的配體。相反，Nell-1可能與其它僅被某種細胞類型表達的特定受體相互作用。運用酵母雙雜交體系(14)，我們運用分離潛在Nell-1受體的過程。因為Nell-1與血栓凝集素-1和脊索蛋白有許多相同的結構域單元，因此，其可能激活或螯合TGF-β超家族成員，并且作為血栓凝集素-1樣分子，來激活潛伏TGF-β1的活性(21)。最近，Abreu等人證明Nell-1是“脊索蛋白樣，富含半胱氨酸結構域”的家族成員，該家族包括脊索蛋白，kielin，crossveinless，扭轉(zhuǎn)的原腸胚形成(Tsg)和連接的TGF(20)。這些脊索蛋白樣，富含半胱氨酸結構域的家族成員的共同特點是其表達具有暫時和空間的特異性，尤其是在結構中。其另一共同特點是與Bmp家族成員的相互作用，以及其后起前抗-或抗-Bmp成分。
在體內(nèi)Nell-1的特異性表達和功能 在我們以前的研究中，我們報道了最早是在ELL-E14小鼠中發(fā)現(xiàn)了Nell-1的表達(12)。在生長發(fā)育過程中，出生前和出生后Nell-1都主要表達于顱面部。免疫組織化學顯示出Nell-1主要定位于骨縫的骨形成區(qū)域和顱骨以及下頜骨的硬化成骨膜上(資料未給出)。顱骨和下頜骨的成骨膜都是神經(jīng)脊的誘導劑(22)。由神經(jīng)脊的誘導劑優(yōu)先表達于顱面區(qū)的Nell-1證明Nell-1可能在顱面的生長發(fā)育過程中具有重要作用。令人吃驚地，與其它普遍基因過度表達的CS模型不同，盡管基因過度表達沒有廣義的組織特異性，但是Nell-1轉(zhuǎn)基因小鼠僅顯示出顱骨發(fā)育異常。這進一步證明我們關于Nell-1通過高度特異的相互作用誘導成骨細胞的分化的假說。因此，Nell-1的表達不太可能通過非特異性干擾同源性分子如血栓凝集素-1來導致顱縫早閉的發(fā)生。這在體外的敲除研究中已經(jīng)得到證實。
Nell-1對成骨細胞分化的影響 未使用抗壞血酸培養(yǎng)的普通成骨細胞不會分化。在另一方面，過度表達Nell-1的成骨細胞在沒有抗壞血酸的情況下形成小結節(jié)，并表達堿性磷酸酶。這表明單獨Nell-1足以誘導成骨細胞分化。
另外，對在正常條件下(含有抗壞血酸)培養(yǎng)的成骨細胞中的Nell-1過度表達進行RNA微點陣分析發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染12天后晚期分化標識物上調(diào)，AdNell-1轉(zhuǎn)染的成骨細胞于轉(zhuǎn)染后第12天開始增加礦化，這些資料表明Nell-1可能促進顱骨成骨細胞的分化和礦化。
Nell-1過度表達也許并不能真實反映Nell-1的生理作用，而是反映Nell-1過度表達對血栓凝集素-1樣分子的影響。Nell-1的下調(diào)明顯地對成骨細胞的分化進行抑制。因此Nell-1是體外成骨細胞分化的充分以及必要的條件。然而這個結論是否適用于體內(nèi)還有待于制備Nell-1裸鼠來加以證實。
Nell-1與目前已知的CS模型的關系 Nell-1過度表達與體內(nèi)Msx2過度表達所引起的顱面異常相似。兩種模型都表現(xiàn)為顱縫過度生長，以及露腦畸形發(fā)生率的增高。然而這兩種基因的細胞作用卻是不同的；持續(xù)的Msx2過度表達誘導增值而且抑制分化，而Nell-1促進分化。因為顱骨融合發(fā)生較晚(出生后第16-21天)，并且粗大顱縫交疊不會在Pro250突變小鼠中出現(xiàn)(8)，在Fgfr1中有可誘導Cbfa1的過度表達的Pro→Arg突變的小鼠具有與Nell-1過度表達小鼠表型不同的表型。然而在體外，Cbfa1的細胞作用與Nell-1相同；都能通過上調(diào)骨標記物基因誘導成骨細胞分化。Msx2和Cbfa1可以調(diào)節(jié)Nell-1的表達。FRCCs的Cbfa1轉(zhuǎn)染在24小時內(nèi)上調(diào)Nell-1表達，而Msx2和Cbfa1聯(lián)合轉(zhuǎn)染后Nell-1表達下調(diào)(未出版研究)。雖然所有這些候選基因?qū)α私釩S都很重要，但是當Fgfr1/Cbfa1可能在顱縫閉合晚期發(fā)揮作用時，Msx2可能在CS早期發(fā)揮重要作用(5，6)。對包含有儲備Cbfa1和Msx2結合序列的Nell-1啟動子的進一步研究，可能進一步闡明其的相互作用(圖8)。這些研究結果說明了在顱面生長和發(fā)育過程中基因動力學的復雜性和環(huán)境間相互作用。
總之，我們通過過度表達Nell-1建立了人類非綜合征性CS的動物模型。與其它已建立的包括FGFRs基因突變和同源異形盒基因(homeobox)(1，2，8)的動物模型不同，我們的動物模型僅顯示出在顱面骨中出現(xiàn)的異常。我們假設Nell-1足以促進和加速顱骨成骨細胞的分化和骨形成，也可能是必要的。從機理上，NELL-1過度表達誘導顱縫骨膜內(nèi)的骨形成，并且可能會導致顱骨的過度生長和過度交疊，以及隨后的顱縫早閉。盡管在人類基因組研究中，Nell-1還沒有被確定為是CS的治病因子，但是研究資料高度支持Nell-1是顱縫早閉發(fā)病機制中的一個環(huán)節(jié)(1)。NELL-1轉(zhuǎn)基因小鼠和人類非綜合征性CS的相似性以及NELL-L與已知的CS治病候選基因間的相互作用為研究CS提供了新的視點。關于Nell-1在顱縫早閉和骨形成中的調(diào)節(jié)和機制研究可能會加速我們對導致CS的顱縫早閉病因的級聯(lián)的闡明。
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序列表<110>加利福尼亞大學校務委員會(The regents of the University ofCalifornia)<120>增強骨礦化的NELL-1<130>38586-327000<140>PCT/US2003/029281<141>2003-09-15<150>US60/410,846<151>2002-09-13<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2977<212>DNA<213>人類<400>1tagcaagttt ggcggctcca agccaggcgc gcctcaggat ccaggctcat ttgcttccac 60ctagcttcgg tgccccctgc taggcgggga ccctcgagag cgatgccgat ggatttgatt 120ttagttgtgt ggttctgtgt gtgcactgcc aggacagtgg tgggctttgg gatggaccct 180gaccttcaga tggatatcgt caccgagctt gaccttgtga acaccaccct tggagttgct 240caggtgtctg gaatgcacaa tgccagcaaa gcatttttat ttcaagacat agaaagagag 300atccatgcag ctcctcatgt gagtgagaaa ttaattcagc tgttccagaa caagagtgaa 360ttcaccattt tggccactgt acagcagaag ccatccactt caggagtgat actgtccatt 420cgagaactgg agcacagcta ttttgaactg gagagcagtg gcctgaggga tgagattcgg 480tatcactaca tacacaatgg gaagccaagg acagaggcac ttccttaccg catggcagat 540ggacaatggc acaaggttgc actgtcagtt agcgcctctc atctcctgct ccatgtcgac 600tgtaacagga tttatgagcg tgtgatagac cctccagata ccaaccttcc cccaggaatc 660aatttatggc ttggccagcg caaccaaaag catggcttat tcaaagggat catccaagat 720gggaagatca tctttatgcc gaatggatat ataacacagt gtccaaatct aaatcacact 780tgcccaacct gcagtgattt cttaagcctg gtgcaaggaa taatggattt acaagagctt 840ttggccaaga tgactgcaaa actaaattat gcagagacaa gacttagtca attggaaaac 900tgtcattgtg agaagacttg tcaagtgagt ggactgctct atcgagatca agactcttgg 960gtagatggtg accattgcag gaactgcact tgcaaaagtg gtgccgtgga atgccgaagg 1020atgtcctgtc cccctctcaa ttgctcccca gactccctcc cagtacacat tgctggccag 1080tgctgtaagg tctgccgacc aaaatgtatc tatggaggaa aagttcttgc agaaggccag 1140cggattttaa ccaagagctg tcgggaatgc cgaggtggag ttttagtaaa aattacagaa 1200
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<212>DNA<213>人類<220>
<221>misc_feature<222>(1594)..(1594)<223>n is a，c，g，or t<220>
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1.一種調(diào)整顱蓋成骨細胞分化和礦化的方法，所述方法包括改變Nell-1的表達或活性，其中增加Nell-1的表達或活性會增加成骨細胞的分化或礦化，而降低Nell-1的表達或活性會減少成骨細胞的分化或礦化。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中通過選自抗-Nell-1反義分子，Nell-1特異性酶核，Nell-1特異性催化性DNA，Nell-1特異性RNAi，抗-Nell-1內(nèi)抗體，或在特異性的目標細胞和/或組織中敲除Nell-1的基因治療方法來對Nell-1的表達或活性進行抑制。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中通過用表達Nell-1的外源核酸轉(zhuǎn)染細胞，或用Nell-1蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染細胞來增強Nell-1的表達或活性。
4.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中在顱骨縫反常發(fā)育的哺乳動物中抑制所述Nell-1的表達或活性。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中所述顱骨縫反常發(fā)育包括顱縫早閉(CS)。
6.一種促進哺乳動物體內(nèi)潛在TGF-β1活化的方法，所述方法包括使所述哺乳動物接受外源Nell-1，或增加所述哺乳動物體內(nèi)內(nèi)源Nell-1的表達活性。
7.一種活化或螯合哺乳動物體內(nèi)TGF-β超家族成員的方法，所述方法包括使所述哺乳動物接受外源Nell-1，或增加所述哺乳動物體內(nèi)內(nèi)源Nell-1的表達活性。
8.一種篩選成骨細胞分化調(diào)節(jié)劑的方法，所述方法包括使含有NELL-1基因的測試細胞與測試試劑接觸；以及檢測所述測試細胞中NELL-1基因表達水平或Nell-1基因活性的變化，將其與對照細胞中NELL-1基因的表達水平或Nell-1基因活性進行比較，測試細胞和對照細胞中的NELL-1的表達水平或者Nell-1活性的差異顯示出所述藥劑調(diào)整骨礦化。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述對照是在比所述測試細胞濃度低時與測試細胞接觸的陰性對照細胞。
10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中所述低濃度是指沒有所述測試試劑。
11.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述對照是在比所述測試細胞濃度高時與測試細胞接觸的陽性對照細胞。
12.根據(jù)權利要求8所述的方法，進一步包括記錄改變NELL-1活性調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)庫或骨礦化調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)庫中NELL-1核酸表達或NELL-1蛋白質(zhì)的測試試劑。
13.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中通過測定所述細胞中NELL-1mRNA的水平來檢測nell-1的表達水平。
14.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中通過將所述mRNA與和NELL-1核酸特異性雜交的探針雜交來測定所述NELL-1mRNA的水平。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中所述雜交選自Northern印跡，使用從nell-1 RNA得到的DNA的Southern印跡，點陣雜交，親和色譜或原位雜交。
16.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中所述探針是形成探針點陣的多個探針中的成員。
17.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中是通過核酸擴增反應來測定所述NELL-1 mRNA的水平。
18.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中通過測定所述生物樣品中的NELL-1蛋白質(zhì)的表達水平來測定所述NELL-1的水平。
19.根據(jù)權利要求18所述的方法，其中所述測定選自毛細管電泳，Western印跡，質(zhì)譜，ELISA，免疫色譜或免疫組織化學。
20.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述細胞是體外培養(yǎng)的。
21.據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述測試試劑不是抗體。
22.據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述測試試劑不是蛋白質(zhì)。
23.一種改變哺乳動物細胞內(nèi)Nell-1表達的方法，所述方法包括改變Msx2和/或Cbfal的表達或活性。
24.根據(jù)權利要求23所述的方法，包括通過上調(diào)Cbfal的表達或活性來上調(diào)Nell-1的表達或活性。
25.根據(jù)權利要求23所述的方法，包括通過上調(diào)Msx2的表達或活性來下調(diào)Nell-1的表達或活性。
26.一種篩選Nell-1表達或活性調(diào)節(jié)劑的方法，所述方法包括使含有Msx2和/或Cbfal基因的測試細胞和測試試劑接觸；并且檢測所述測試細胞中Cbfal和/或Msx2基因的表達水平或Cbfal和/或Msx2基因的活性，將其與對照細胞中的Cbfal和/或Msx2基因的表達水平或Cbfal和/或Msx2基因的活性相比較，在測試細胞和對照細胞之間的Cbfal和/或Msx2基因的表達水平或Cbfal和/或Msx2基因的活性的差異顯示出該藥劑可以調(diào)整Nell-1的表達或活性。
27.根據(jù)權利要求26所述的方法，其中所述對照是在比所述測試細胞濃度低時與試劑接觸的陰性對照細胞。
28.根據(jù)權利要求27所述的方法，其中所述低濃度是指沒有所述測試試劑。
29.根據(jù)權利要求26所述的方法，其中所述對照是在比所述測試細胞濃度高時與試劑接觸的陽性對照細胞。
30.根據(jù)權利要求26所述的方法，進一步包括記錄改變NELL-1活性調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)庫或骨礦化調(diào)節(jié)劑數(shù)據(jù)庫中Cbfal和/或Msx2基因的表達或Cbfal和/或Msx2活性的測試試劑。
31.根據(jù)權利要求26所述的方法，其中通過測定所述細胞中Cbfal和/或Msx2mRNA來測量所述nell-1的表達水平。
32.根據(jù)權利要求31所述的方法，其中C通過所述mRNA與和Cbfal和/或Msx2核酸特異性雜交的探針雜交來測量所述Cbfal和/或Msx2mRNA的水平。
33.根據(jù)權利要求32所述的方法，所述雜交選自Northern吸印雜交，使用從Cbfal和/或Msx2RNA得到的DNA的Southern印跡雜交，點陣雜交，親和色譜或原位雜交。
34.根據(jù)權利要求33所述的方法，其中所述探針是形成探針點陣的很多探針中的成員。
35.根據(jù)權利要求31所述的方法，其中CBfal通過核酸擴增反應來測定所述Cbfal和/或Msx2 mRNA的水平。
36.根據(jù)權利要求26所述的方法，其中通過測定所述生物樣品中的Cbfal和/或Msx2蛋白質(zhì)的的表達水平來測定所述Cbfal和/或Msx2的水平。
37.根據(jù)權利要求36所述的方法，其中所述檢測選自毛細管電泳，Western印跡，質(zhì)譜，ELISA，免疫色譜或免疫組織化學。
38.根據(jù)權利要求26所述的方法，其中所述細胞是體外培養(yǎng)的。
39.據(jù)權利要求26所述的方法，其中所述測試試劑不是抗體。
40.據(jù)權利要求26所述的方法，其中所述測試試劑不是蛋白質(zhì)。
41.一種藥劑配方，所述配方包括一種或者多種選自編碼Nell-1蛋白質(zhì)的核酸，Nell-1蛋白質(zhì)或改變Nell-1蛋白質(zhì)活性或表達的試劑的活性劑；以及藥學上可以接受的賦型劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及人類NELL－1基因可以誘導或者上調(diào)骨礦化的發(fā)現(xiàn)。因此NELL－1基因或基因產(chǎn)品為篩選骨礦化調(diào)節(jié)劑提供了一個方便的目標物。另外，NELL－1可以用來促進骨折的修復和/或可以在一般情況下增加骨密度。
文檔編號C12Q1/68GK1867673SQ03824975
公開日2006年11月22日 申請日期2003年9月15日 優(yōu)先權日2002年9月13日
發(fā)明者T·康 申請人:加利福尼亞大學校務委員會