專利名稱：細(xì)胞粘附性表面的制作方法
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域本發(fā)明涉及能夠抗細(xì)胞粘附的涂層表面以及生產(chǎn)該涂層表面的方法，該表面含有直接與等離子處理(plasma-treated)的聚合物表面結(jié)合的透明質(zhì)酸或藻酸。本發(fā)明提供含有這種細(xì)胞粘附抗性(CAR)的涂層表面的組合物，產(chǎn)品(articles)，物體，裝置以及方法，所述表面上結(jié)合有配體結(jié)合多肽，例如選擇性地結(jié)合目的細(xì)胞或分子類型的抗體。
背景技術(shù)：
在組織培養(yǎng)領(lǐng)域中眾所周知特別需要能夠抗細(xì)胞粘附的表面，過去已經(jīng)進(jìn)行了相當(dāng)多的研究來開發(fā)這種表面。這不僅可用于組織培養(yǎng)，還可用于其他領(lǐng)域，例如在衛(wèi)生器材中，期望防止細(xì)菌細(xì)胞粘附，以及通常用于可能由于微生物的附著而遭受污染的表面。透明質(zhì)酸(或hyaluronan)，縮寫為HA，在這點(diǎn)上成為很多研究的主題，并且當(dāng)其固定在表面上時(shí)已經(jīng)顯示可產(chǎn)生帶有期望抗性特征的表面。但是產(chǎn)生的一個(gè)問題是用一個(gè)HA層簡單地涂覆表面通常被證實(shí)是不足夠的，因?yàn)镠A是水溶性的，并可隨著時(shí)間溶于水溶液。因此，為獲得耐用的涂層，通常必須通過穩(wěn)定的化學(xué)連接將HA附著到表面上。
Morra的US 6,129,956公開了使用聚乙烯亞胺(PEI)或聚-L-賴氨酸(PLL)作為一個(gè)中間連接層能夠?qū)A和藻酸(AA)共價(jià)地連接并固定到聚苯乙烯上，或者能夠利用雙-功能性烷氧基硅烷偶聯(lián)劑進(jìn)行共價(jià)鍵連接，該偶聯(lián)劑將HA連接到等離子處理的表面上。這兩個(gè)方法必須耗費(fèi)大量的時(shí)間和人力投入。
Mason等，Biomaterials 21(2000)31-36公開了向用氨等離子處理的聚合物上固定HA的方法，使用了特定偶聯(lián)劑。因此，使用乙基二甲基氨-丙基碳二亞胺(EDC)(ethyldimethylamino-propylcarbodiimide)作為縮合劑，氨等離子處理表面之后，HA不能順利地與聚苯乙烯(PS)，聚丙烯(PP)或者聚四氟乙烯(PTFE)偶聯(lián)。只有當(dāng)用己二酸二酰肼修飾HA時(shí)，HA才通過EDC順利地連接到這種處理的聚合物上。因此，根據(jù)Mason等，只有在表面胺和HA羧基之間存在“間隔臂”(己二酸二酰肼)的情況下，HA才能與結(jié)合在表面上的NH2基團(tuán)相連。但是，不希望對HA進(jìn)行修飾，并且通常疊氮化物化合物會(huì)造成安全隱患。
因此，需要獲得一種簡化法來制備抗細(xì)胞粘附的表面。
許多報(bào)告描述了將活性生物材料連接到固體支持物的過程。例如，將抗體共價(jià)連接到PS器皿及這種衍生器皿(derivatized dishes)在掃描(panning)方法中用于細(xì)胞消耗過程的應(yīng)用(Larsson，PH等，J Immunol Meth(1989)116293-298)。通過共價(jià)鍵連接抗體或其片段的衍生化PS表面在免疫測定中的應(yīng)用由Peterman，JH等描述，J Immunol Meth(1988)111271-275及Chu，VP等，J AppPolymer Sci(1987)341917-1924。
許多轉(zhuǎn)讓給Applied Immune Sciences，Inc.的專利和該公司成員的科技出版物都公開了PS表面的共價(jià)衍生作用及其在共價(jià)固定配體結(jié)合蛋白質(zhì)主要是抗體中的應(yīng)用，及其用于從混合細(xì)胞群中捕獲(陽性篩選)和去除(陰性篩選)某些細(xì)胞亞群。例如參見，Okrongly(U.S.4,933,410和5,283,034)，Clark(U.S.4,978,724和5,241,012(，Lebkowski，JS等在Recktenwald，D等，eds.，Cell SeparationMethods and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，1998，61-85頁；Okarma T等，Prog Clin Biol Res，1992，377487-504；A.E.Berson等，Biotechniques，1996201098-103)。有人已將根據(jù)Okrongly或Clark制備的裝置(PS組織培養(yǎng)瓶)用于特定鼠細(xì)胞群的陰性去除和陽性篩選。有時(shí)選擇的抗體非共價(jià)鍵地與小鼠抗大鼠抗體結(jié)合，而所述小鼠抗大鼠抗體與該表面共價(jià)結(jié)合。還公開了對在細(xì)胞上差異表達(dá)的某些糖類具有特異性的凝集素的共價(jià)固定過程。這些方法以單或多個(gè)步驟從骨髓富集功能性的造血祖細(xì)胞(Schain，LR等，J Hematother，1994，337-46；Cardoso AA等，J Hematother 1993，2275-9)。
但是，先前針對連接配體結(jié)合蛋白質(zhì)的參考文獻(xiàn)均未公開將這種固定蛋白質(zhì)的表面做成細(xì)胞粘附抗性表面，也沒有說明任何理由產(chǎn)生或利用這種表面。因此本文描述的是一種出乎意料的發(fā)現(xiàn)被設(shè)計(jì)成能抗蛋白質(zhì)，細(xì)胞等粘附/結(jié)合的表面能夠被制造成對預(yù)先確定的分子、細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)等具有選擇性的吸附作用，而特定配體結(jié)合分子附著到抗性表面又不會(huì)使其損失一般的抵抗特性。
發(fā)明概述出乎意料地發(fā)現(xiàn)HA能夠直接與等離子-處理的表面結(jié)合，不需要偶聯(lián)劑，也不必用PEI，PLL，聚D-賴氨酸(PDL)或其它多聚陽離子物質(zhì)處理表面。
因此，本發(fā)明提供一種將HA共價(jià)固定到表面上的方法，以獲得抗細(xì)胞粘附的表面。本發(fā)明特別提供一種通過等離子體處理及隨后在其上固定HA，直接在聚苯乙烯及其他聚合物的表面上獲得含氮表面的方法，不需要使用中間的結(jié)合層或利用化學(xué)偶聯(lián)劑。
在另一
具體實(shí)施例方式
中，本發(fā)明提供一種將HA直接固定在(聚合的)含氮表面上的方法，不需要利用中間的結(jié)合層，例如聚乙烯亞胺，也不需要利用化學(xué)偶聯(lián)劑。
這種表面的實(shí)例是氨等離子處理的聚合物和PrimariaTM-處理的聚苯乙烯表面。適用于本發(fā)明的聚合物包括聚苯乙烯，聚丙烯，聚對苯二甲酸乙二酯，聚交酯，纖維素等等。
在另一
具體實(shí)施例方式
中，本發(fā)明提供能抗細(xì)胞粘附的表面。該表面由一層通過胺基直接與聚合物(例如聚苯乙烯)結(jié)合的透明質(zhì)酸層組成，該表面不含有中間的結(jié)合層或接頭基團(tuán)，例如PLL。
根據(jù)該發(fā)明方法形成的表面可用于與HA或藻酸鹽涂覆的表面及本領(lǐng)域中以前已知的其他細(xì)胞粘附抗性表面相同的目的。當(dāng)未進(jìn)一步處理時(shí)，這種表面可用于抗細(xì)胞粘附及生長。它們還可以通過本領(lǐng)域已知的方法被進(jìn)一步處理，以選擇性地附著具有特定期望特性的額外物質(zhì)。有時(shí)可能希望連接對靶細(xì)胞或化合物具有特定親合性的生物學(xué)活性材料。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及將配體結(jié)合多肽(LBP)，優(yōu)選抗體，固定到如上所述能防止非特異性細(xì)胞及蛋白質(zhì)吸附的修飾固體表面的方法?？蛇@樣實(shí)現(xiàn)通過共價(jià)結(jié)合LBP例如(a)靶細(xì)胞的抗體，或(b)捕獲蛋白，例如葡萄球菌蛋白A(SpA)及鏈球菌蛋白質(zhì)G(SpG)，其天然地與免疫球蛋白(Ig)分子結(jié)合，或其它能夠被產(chǎn)生以特定方式與抗體相互作用的蛋白質(zhì)。有關(guān)后者“捕獲”蛋白質(zhì)的實(shí)例為抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，其能夠以極高的親合性結(jié)合生物素，而生物素則以化學(xué)鍵結(jié)合到可溶性靶特異性抗體上。
在這個(gè)
具體實(shí)施例方式
中，該表面被首先如上所述修飾，產(chǎn)生CAR表面。例如一旦HA結(jié)合到該表面上，HA的游離羥基被例如高碘酸鹽(如NaIO4)氧化為醛。多肽現(xiàn)在可以通過其游離伯胺基團(tuán)(N-末端，Lys或Arg側(cè)鏈等)與這些醛基反應(yīng)。在存在適當(dāng)還原劑例如氫硼化物，如氰基氫硼化物(cyanoborohydride)的情況下，會(huì)發(fā)生還原性胺化作用，在該多肽及HA(或AA)的糖環(huán)上的反應(yīng)性醛之間產(chǎn)生共價(jià)鍵。
同樣，結(jié)合該表面的CAR物質(zhì)——優(yōu)選HA或AA——的COO-基團(tuán)可以通過加入乙基二甲基氨丙基-碳二亞胺(ethyldimethylaminopropyl-carbodiimide)(EDC)活化形成活性中間體酯(o-acylisourea)。該中間體非常不穩(wěn)定，很容易水解，導(dǎo)致活化酯中間體的裂解，形成異脲，并重新生成-COO-基團(tuán)。為穩(wěn)定該不穩(wěn)定的活性中間體并提高反應(yīng)產(chǎn)量，將N-羥基磺基琥珀酰亞胺(N-hydroxysulfosuccinimide)(硫代-NHS)或等價(jià)的活性中間體穩(wěn)定劑加入該反應(yīng)。肽或多肽的自由氨基(N-末端，Lys和Arg側(cè)鏈等)現(xiàn)在可以與這些活性中間體酯或穩(wěn)定的活性中間體酯反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵。這會(huì)在肽或多肽和HA或AA的糖環(huán)上的活性酯之間產(chǎn)生共價(jià)鍵。
本發(fā)明提供一種產(chǎn)生細(xì)胞粘附抗性(CAR)固相表面的方法，該表面上共價(jià)結(jié)合了至少第一配體結(jié)合多肽，該方法包括步驟(a)根據(jù)權(quán)利要求1的用HA，AA或衍生物涂覆聚合物表面；(b)氧化HA，AA或衍生物，產(chǎn)生胺-反應(yīng)性基團(tuán)；和(c)將氧化的HA，AA或衍生物暴露于第一配體結(jié)合多肽，其中在多肽的氨基和胺反應(yīng)性基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵，導(dǎo)致該多肽共價(jià)結(jié)合到HA，AA或衍生物上，從而生成共價(jià)結(jié)合了第一配體結(jié)合多肽的CAR表面。
優(yōu)選的表面選自聚苯乙烯，聚乙烯，聚丙烯，聚對苯二甲酸乙二酯，聚四氟乙烯，聚交酯和纖維素。
上述方法中(i)氧化步驟(b)可以通過提供一種氧化劑進(jìn)行，優(yōu)選高碘酸鹽，其在HA，AA或衍生物上形成反應(yīng)性的醛基，和(ii)步驟(c)還包括向多肽和表面提供一種還原劑，其會(huì)進(jìn)行還原性胺化作用，而該胺化作用使得在多肽的氨基和反應(yīng)性醛基之間生成共價(jià)鍵。
還提供上述方法，其中步驟(b)可在步驟(c)之前或與之同時(shí)，還包括通過暴露于碳二亞胺和活性中間體酯穩(wěn)定化合物而將HA，AA或衍生物的羧基轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性酯的步驟。
上述方法中的活性中間體酯穩(wěn)定化合物選自N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide)，羥基磺基琥珀酰亞胺和羥基苯并三唑水合物(hydroxybenzotriazolohydrate)。
上述方法可在步驟(c)之后包括(d)使共價(jià)結(jié)合的第一配體結(jié)合多肽與第二配體結(jié)合多肽接觸，其中第二配體結(jié)合多肽是第一配體結(jié)合多肽的配體，該步驟是在能夠使第二多肽非共價(jià)結(jié)合到第一多肽的條件下進(jìn)行。
優(yōu)選第一配體結(jié)合多肽是(a)抗體，(b)受體，(c)免疫球蛋白結(jié)合蛋白，(d)抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，(e)凝集素，(f)細(xì)胞粘附分子或(f)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)或(g)合成的肽。免疫球蛋白結(jié)合蛋白可以選自天然或重組的葡萄球菌蛋白A，天然或重組葡萄球菌蛋白G，以及重組蛋白質(zhì)A/G。第二配體結(jié)合多肽可以是(a)抗體或其抗原結(jié)合片段，(b)受體，(c)凝集素，(d)細(xì)胞粘附分子或(e)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)或(f)合成的肽。
在一個(gè)實(shí)施方式中，(a)第一配體結(jié)合多肽是蛋白質(zhì)A，蛋白質(zhì)G，或重組蛋白質(zhì)A/G；及(b)第二配體結(jié)合多肽是抗體或其抗原結(jié)合片段。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，(a)第一配體結(jié)合多肽是抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白；及(b)第二配體結(jié)合多肽是生物素化抗體。
上述方法可方便地用于固定期望的LBP，其作為一種捕獲物質(zhì)。優(yōu)選的LBP是能以期望的特異性結(jié)合例如被分離，富集或去除細(xì)胞的抗體?？蓱?yīng)用這種固定的抗體陽性地篩選在其表面上表達(dá)表位的細(xì)胞或該抗體特異性的抗原。反之，這種表面也能夠用于陰性篩選。優(yōu)選用于本發(fā)明的固定及應(yīng)用的抗體是抗CD34，因?yàn)镃D34標(biāo)記在初期造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞上表達(dá)，當(dāng)其被分離出來時(shí)，可以具有眾多有益的應(yīng)用。
以下
具體實(shí)施例方式
提供了使用抗CD34抗體作為一種示范性的抗體或LBP。SpA或SpG被固定到HA或AA處理的聚合物表面上，然后用于固定(非共價(jià)鍵地)抗CD34mAb。在另一具體實(shí)施方式
中，抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白被結(jié)合到HA或AA表面，用于固定(非共價(jià)鍵地)生物素化抗CD34抗體。在另一具體實(shí)施方式
中，如本文所述，抗CD34抗體是直接偶聯(lián)(共價(jià)地)到HA或AA處理的聚合物表面。這產(chǎn)生了捕獲表面，其上涂覆了期望的抗體，但同時(shí)能防止不表達(dá)CD34的細(xì)胞非特異性的結(jié)合。
帶有捕獲物質(zhì)--優(yōu)選抗體--特異性模式的捕獲表面可以做成這樣的形式帶有結(jié)合抗體的各區(qū)域被缺乏抗體但仍具有細(xì)胞粘附抗性物質(zhì)的各區(qū)域分隔開來。這種模式可以用于開發(fā)專門的抗體捕獲陣列。
還提供由任何上述方法制備的產(chǎn)品，其包含與固體表面結(jié)合的CAR物質(zhì)，并且與CAR物質(zhì)接觸的、優(yōu)選結(jié)合的是第一LBP或第一LBP結(jié)合第二LBP。
下面進(jìn)一步的具體和特定實(shí)施例描述了本發(fā)明的這些及其他具體


圖1顯示實(shí)施例5所述的各等離子處理?xiàng)l件(A-E)的O/C和N/C比率。
圖2顯示實(shí)施例7所述的在等離子處理和HA涂覆器皿中用蘇木精固定并染色的MC3T3細(xì)胞。陰影表示存在細(xì)胞。3個(gè)等離子對照器皿(頂行)被染色[亮紫色]，表示存在一個(gè)細(xì)胞層。在條件A和B的等離子處理及HA涂層皿中沒有發(fā)現(xiàn)染色，表示沒有細(xì)胞附著于這些表面。在條件E的兩個(gè)等離子處理和HA涂層皿中發(fā)現(xiàn)了少量細(xì)胞粘附，可能是由于涂覆過程的小的瑕疵所致。[這還可轉(zhuǎn)換為B&W bimage——亮紫隨后變?yōu)榛疑?，沒有細(xì)胞的表面是白色]圖3是CAR表面的示意圖，其上固定了示范性的LBP，抗CD34mAb，說明在聚苯乙烯表面上建立的不同“層”。
圖4是修飾CAR表面以固定LBP(單個(gè)LBP或者第一(1°)LBP和第二(2°)LBP的組合)的兩種不同方法中各步驟的示意圖。在這個(gè)具體實(shí)施方式
中，CAR物質(zhì)層用HA或AA進(jìn)行示范，其可以直接結(jié)合到PS表面或結(jié)合到直接與PS表面結(jié)合的中間層(這里用PEI示范)上。
圖5-7說明使用BMG熒光計(jì)直接測量結(jié)合本發(fā)明表面的抗體的熒光。處理涂有HA的96孔微量培養(yǎng)板以產(chǎn)生用于固定鼠mAb的三種不同類型表面。評價(jià)各表面的抗CD34mAb最大結(jié)合程度。表面1(圖)是用SpG修飾。表面2(圖6)是用SpA修飾。表面3(圖7)是用抗生物素蛋白(并用生物素化抗CD34測試)修飾。使用熒光2°抗體(抗Ig)通過熒光測量mAb到各表面的結(jié)合效率，其中熒光2°抗體與熒光染料Alexa 488相連(參見實(shí)施例)。顯示了有代表性的結(jié)果。
發(fā)明的詳細(xì)說明在本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，為了清楚起見，使用了特定的術(shù)語。但是，本發(fā)明并非僅限于所選的特定術(shù)語?？梢岳斫飧魈囟ㄒ匕ㄋ械膶I(yè)同等物，其以類似方式運(yùn)行，可以實(shí)現(xiàn)類似的目的。引用的各參考文獻(xiàn)均并入作為參考，如同它們被分別并入作為參考一樣。
縮寫CAR細(xì)胞粘附抗性(或阻抗性或抵抗性)。
ESCA化學(xué)分析電子光譜法EDC1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺MES2-[N-嗎啉代]乙磺酸(2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid)NHSN-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide)Sulfo-NHSN-羥基磺基琥珀酰亞胺PEI聚乙烯亞胺PLL聚L-賴氨酸PP聚丙烯PS聚苯乙烯PE聚乙烯PET聚對苯二甲酸乙二酯PTFE聚四氟乙烯LBP配體結(jié)合多肽除非另有陳述，所有的溶液都是w/v在去離子水中。
本文所用術(shù)語“聚合物”或“聚合物基質(zhì)”指要進(jìn)行等離子處理的產(chǎn)品或表面的組成物，本發(fā)明的HA表面將會(huì)涂覆在其上。
現(xiàn)有技術(shù)用于促進(jìn)HA結(jié)合的PEI，PLL及其他涂覆物統(tǒng)稱為連接物或偶聯(lián)劑或?qū)?，中間結(jié)合層和/或由其它特定功能性術(shù)語命名，盡管它們在性質(zhì)上可能是聚合物。
在HA的羧基和表面胺基之間進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)HA是一種由β-1，4-葡糖醛酸-β-1，3-N-乙酰葡糖胺的重復(fù)單元組成的陰離子多糖。在HA的每個(gè)重復(fù)單元都存在于一個(gè)反應(yīng)性的-CO2基團(tuán)，可用于通過本發(fā)明方法將HA共價(jià)結(jié)合到含胺表面。
乙基二甲基氨丙基-碳二亞胺(EDC)與-COOH反應(yīng)，產(chǎn)生活性酯(o-Acylisourea)中間體。該中間體非常不穩(wěn)定，很容易水解，導(dǎo)致活化酯中間體的裂解，形成異脲，并重新生成-COOH基團(tuán)。為穩(wěn)定該不穩(wěn)定的活性中間體并提高反應(yīng)產(chǎn)量，將硫代-NHS或另一同等物加入該反應(yīng)。
已經(jīng)表明通過本發(fā)明方法已被共價(jià)固定的HA可以防止細(xì)胞粘附，如鼠顱頂來源的成骨細(xì)胞(MC3T3細(xì)胞)。此外，通過本方法制備的表面在延長的培養(yǎng)時(shí)間之后能夠抗剝落。
直接固定在等離子處理表面上的HA有一種優(yōu)點(diǎn)，即不需要中間的聚合物層(如聚乙烯亞胺，聚D-賴氨酸，或聚L賴氨酸)或其它“間隔物”部分。HA層能夠直接固定到PS表面上，而不喪失其細(xì)胞粘附抗性特征。因此本發(fā)明避免了使用中間聚合物層的額外步驟，如PEI或聚賴氨酸，或間隔物基團(tuán)。
本發(fā)明能夠用于，例如涂覆組織培養(yǎng)器皿以防止細(xì)胞粘附和生長，制備用生物學(xué)相關(guān)配體(如肽，ECM，蛋白質(zhì))進(jìn)一步修飾的表面，制備防止細(xì)菌細(xì)胞粘附的抗污染表面和用于接近閃爍和熒光偏振試驗(yàn)的表面。如同下面的詳細(xì)描述，可以在同樣的組織培養(yǎng)裝置上固定特定的配體結(jié)合多肽，優(yōu)選抗體或抗體結(jié)合多肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知等離子技術(shù)的應(yīng)用(例如參見，Garbassi F.等，″Polymer Surfaces，from Physics to Technology″，Wiley，Chichester，6，1994，和N.Inagaki″Plasma Surface Modificationand Plasma Polymerization，Technomic Publishing Company，Lahcaster，1996)。在本發(fā)明中，等離子處理方法可以是能夠?qū)⒌Y(jié)合到產(chǎn)品表面以得到反應(yīng)性胺或其它含氮基團(tuán)的任何方法，包括直接以及間接的等離子處理方法。適當(dāng)?shù)牡入x子處理實(shí)例包括使用活性氣體例如氮?dú)?，一氧化氮，二氧化氮或氣相氨，單?dú)或與空氣混合，氬氣或其它惰性氣體，可以先于或繼之以使用氬氣或其它惰性氣體處理。等離子可以在整個(gè)處理時(shí)間內(nèi)始終維持或以脈沖應(yīng)用。優(yōu)選等離子氣體是氨，并且處理是在1-400W的功率電荷下進(jìn)行，優(yōu)選10-150W，在10mtorr-10torr的壓力下，并且處理時(shí)間為1秒到1小時(shí)，優(yōu)選10秒到30分鐘。
等離子處理的聚苯乙烯可通過例如下述制備將處理室泵到0.3mTorr的基礎(chǔ)壓力下，形成200mTorr氬氣氛，應(yīng)用60秒氬等離子體處理，然后在95W下進(jìn)行120秒，375mTorr NH3等離子處理。其它適當(dāng)?shù)奶幚硎潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的，下面列出了范例。
等離子處理的目的是制備高表面濃度的共價(jià)附著胺基。然后在存在縮合劑例如EDC的情況下，該表面能夠與透明質(zhì)酸或其衍生物，或藻酸(藻酸鹽)起反應(yīng)，在水溶液或二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)中，在有機(jī)溶劑中。為獲得最佳結(jié)果，還存在能夠增強(qiáng)由EDC促進(jìn)的反應(yīng)的分子，例如N-羥基-琥珀酰亞胺(NHS)，羥基-硫代琥珀酰亞胺或羥基苯并三唑水合物。盡管本發(fā)明的成果不希望被特定理論束縛，但是我們認(rèn)為HA連接到含胺表面的過程是通過一種機(jī)理發(fā)生的，在該機(jī)理中(例如)EDC和NHS結(jié)合產(chǎn)生一個(gè)帶有羧基的活性酯多糖，該羧基能夠與胺相連。當(dāng)連接發(fā)生時(shí)NHS被釋放出來。本領(lǐng)域已知的能夠與EDC如此反應(yīng)的其它化合物和能夠充當(dāng)活性中間體酯穩(wěn)定化合物的其它化合物可同樣用于本發(fā)明。
其它產(chǎn)生帶胺及其他含氮基團(tuán)表面的等離子處理方法也同樣適用，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所述公知。在待涂覆表面的等離子處理之后，在碳二亞胺(優(yōu)選EDC)的存在下使等離子處理表面暴露于一種含HA或其衍生物或AA的水溶液。本文所用術(shù)語“暴露”的含義是包括但不限于液相和固體之間的任何類型的接觸，例如用用滴管吸取，倒入，噴涂，滴注，浸漬，倒，浸泡，注射等。
同樣存在活性中間體酯穩(wěn)定化合物，其實(shí)質(zhì)上通過穩(wěn)定由碳二亞胺形成的活性中間體提高結(jié)合效率。這種化合物通常選自N-羥基琥珀酰亞胺和其芳基或雜環(huán)的衍化物。優(yōu)選N-羥基琥珀酰亞胺，但不限于N-羥基-琥珀酰亞胺(NHS)，羥基-硫代琥珀酰亞胺(硫代-NHS)，羥基苯并三唑水合物。
可用于本發(fā)明的合適HA衍生物是技術(shù)人員已知的，例如在US4,851,521中描述。這包括透明質(zhì)酸與脂肪族，araliphatic，環(huán)脂化合物和雜環(huán)系列的醇形成的偏酯以及與無機(jī)或有機(jī)堿形成的這種偏酯的鹽。同樣可使用藻酸的類似衍生物。
本發(fā)明方法制備的表面能有效地抗細(xì)胞粘附，如本文下面實(shí)施例所示，并能夠比那些需要帶有含氮基團(tuán)的化合物(例如PEI，PLL或PDL)中間層的表面被更加經(jīng)濟(jì)有效地制備。
配體-結(jié)合多肽(“LBP”)在本文中，LBP是任何對結(jié)合配偶體或配體(這種結(jié)合伙伴或配體在此也被稱為“靶”)具有親合性的任何多肽，以及在適宜條件下與結(jié)合伙伴或配體結(jié)合的任何多肽。優(yōu)選的LBP是能夠與細(xì)胞表面上的靶結(jié)合的LBP，該靶可以是蛋白質(zhì)，糖類，脂肪或包括這些基本生物化學(xué)組成構(gòu)件的任何結(jié)構(gòu)，例如糖蛋白或糖肽，糖脂或蛋白脂質(zhì)。
有用的LBP可以是通過直接分離(或通過遺傳工程)以天然的結(jié)構(gòu)形態(tài)獲得的天然存在多肽。實(shí)例包括激素受體多肽，例如胰島素受體，糖原受體，內(nèi)分泌激素蛋白質(zhì)受體，神經(jīng)肽受體，或細(xì)胞因子受體，Ig分子(例如，細(xì)菌Ig結(jié)合分子，F(xiàn)c受體，抗-Ig抗體)，補(bǔ)體組分，炎性肽，植物凝集素(例如大豆凝集素，麥胚凝集素，植物凝集素，伴刀豆凝集素A等等，在下面更詳細(xì)地列出)。其它LBP是與相同(同型)或者不同(異型)細(xì)胞粘附分子結(jié)合的細(xì)胞粘附分子。
本組合物及方法對LBP的唯一要求是當(dāng)以固定的形式結(jié)合時(shí)，它能夠與其配體以特異性及充分的親合性結(jié)合，以允許細(xì)胞(或其它分子)結(jié)合，達(dá)到本文公開的那些目的。
本發(fā)明最優(yōu)選的LBP是抗體，優(yōu)選單克隆抗體(mAb)。
全文引入作為參考的抗體及本發(fā)明的相關(guān)免疫學(xué)的方面標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)包括A.K.Abbas等，Cellular and Molecular Immunology(Fourth Ed.)，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，2000，C.A.Janeway等，Immunobiology.The Immune System in Health andDisease，F(xiàn)ifth ed.，Garland Publishing Co.，New York，2002Harlow，E，及Lane，D.Using AntibodiesA Laboratory Manual。New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1998。Howard，GC和Bethell，DR，Basic Methodsin Antibody Production andCharacterization，CRC Press，Boca Raton，2001。至于固定抗體的分析，參見例如，Butler，JE，The Behavior of Antigens andAntibodies Immobilized on a Solid Phase(Chapter 11)InSTRUCTURE OF ANTIGENS，Vol.1(Van Regenmortel，M，ed)，CRCPress，Boca Raton 1992，209-259頁。
本發(fā)明使用抗體作為LBP，多克隆及單克隆抗體均可?？贵w可以是異種的，異源的，同源的(相對于被結(jié)合細(xì)胞的物種)，或其改良型，例如人源化的或嵌合的抗體(見下文)。術(shù)語“抗體”也可包括完整的分子以及其抗原結(jié)合片段，例如Fab和缺乏完整抗體的Fc片段的F(ab′)2片段。還包括Fv片段(Hochman，J.等(1973)Biochemistry121130-1135；Sharon，J.等(1976)Biochemistry 151591-1594)。可使用傳統(tǒng)方法產(chǎn)生這些不同的片段，例如蛋白酶裂解或化學(xué)裂解(參見，如Rousseaux等，Meth.Enzymol.，121663-69(1986))。
多克隆抗體可以作為血清從免疫動(dòng)物獲得，例如兔，山羊，嚙齒動(dòng)物等，可以不用進(jìn)一步處理直接使用，或經(jīng)受常規(guī)的富集或提純法，例如硫酸銨沉淀，離子交換色譜法和親合層析(H.Zola等，inMonoclonal Hybridoma AntibodiesTechniquesand Applications，CRC Press，1982))。mAb可以使用常規(guī)的雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)，例如由Kohler和Milstein介紹的方法(Nature，256495-97(1975)，并對其進(jìn)行修飾(參見上面綜述性免疫學(xué)參考文獻(xiàn))。優(yōu)選商業(yè)上可獲得的mAb。
抗體可以作為單鏈抗體或scFv生產(chǎn)，而不是標(biāo)準(zhǔn)的多聚體結(jié)構(gòu)。單鏈抗體包含來自目的Ig的高變區(qū)并重造了天然Ig的抗原結(jié)合部位，是完整Ig的一部分(Skerra，A.等(1988)Science，2401038-1041；Pluckthun，A.等(1989)Methods Enzymol.178497-515；Winter，G.等(1991)Nature，349293-299)；Bird等，(1988)Science 242423；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879；Jost CR等，J Biol Chem.199426926267-26273；美國專利US 4,704,692、4,853,871、4,94,6778、5,260,203、5,455,030。
已經(jīng)有人合成了能夠通過遺傳工程(參見如Cabilly等，美國專利US 4,816,567和6,331,415；Morrison等，美國專利US 5,807,715)或通過在抗體之后進(jìn)行蛋白質(zhì)操作而制備的雜交或嵌合抗體。用于構(gòu)建這種雜交Ab1-Ab2抗體的生化法和用于同樣目的的基于雜交瘤的重組方法已被公開，例如Hillyard等的美國專利US 5,413,913及其中引用的參考文獻(xiàn)。因此本發(fā)明的雜交或嵌合抗體包括兩種“半-分子”，一種對mAb1具有特異性而另一種對mAb2具有特異性。這種雜交抗體比現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)的尾對尾結(jié)合更具優(yōu)點(diǎn)，其是由雙功能偶聯(lián)劑形成。這種優(yōu)點(diǎn)包括更易制備，能夠維持兩種抗體的正確化學(xué)計(jì)量和立體化學(xué)而保持各片段的結(jié)合親合性。
LBP片段和改造的LBPLBP還包括配體結(jié)合片段，全長多肽的結(jié)構(gòu)域或一部分。為進(jìn)行說明，如果完整的或天然的LBP是一種細(xì)胞表面受體蛋白質(zhì)，最有用的LBP片段可能是這種受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)。如果是抗體，LBP片段可能是任何抗原結(jié)合片段，例如F(ab′)2，F(xiàn)ab或Fv片段。天然LBP的修飾的、改造的形式，例如單鏈抗體(scFv；Skerra，A.等(1988)Science，2401038-1041；Pluckthun，A.等(1989)MethodsEnzymol.178497-515；Winter，G.等(1991)Nature，349293-299)；Bird等(1988)Science 242423；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879；Jost CR等，J Biol.Chem.199426926267-26273；和US專利4,704,692，4,853,871，4,946,778，5,260,203和5,455,030)、嵌合抗體(Cabilly等，US專利4,816,567和6,331,415)，CDR-移植抗體(CDR-grafted antibody)等均屬于本雙(夾層的)LBP在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，要與靶結(jié)構(gòu)結(jié)合的LBP通過與CAR物質(zhì)(優(yōu)選HA)的共價(jià)鍵被直接固定在固相上。直接固定的LBP的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例是抗體。但是，在另一實(shí)施方式中，提高捕獲靶(通常是細(xì)胞)的效率是這樣獲得的將第一LBP直接共價(jià)結(jié)合到固相上的HA或其他CAR涂層，然后與第一LBP非共價(jià)結(jié)合的是第二LBP，其既是第一LBP的配體同時(shí)又是目的靶物質(zhì)的結(jié)合配偶體。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，第一LBP是抗體結(jié)合多肽，其能夠“捕獲”抗體，但這不會(huì)阻礙其識別和結(jié)合終極靶物質(zhì)的能力。有用的抗體結(jié)合多肽實(shí)例包括某些細(xì)菌蛋白，如葡萄球菌蛋白A(SpA)和蛋白G(SpG)(參見下面)，其天然能夠結(jié)合某些Ig分子，通常在Ig抗原結(jié)合位點(diǎn)遠(yuǎn)端的Fc部位。多肽可被改造，以抗體結(jié)合多肽的方式發(fā)揮作用。優(yōu)選的實(shí)例是鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，其可天然以極高的親和性與生物素結(jié)合。因此，如果鏈霉抗生物素蛋白通過與HA(第一LBP)反應(yīng)而直接共價(jià)連接到固體表面上，那么它可以與生物素綴合的抗體(第二LBP)結(jié)合，雖然是非共價(jià)鍵的結(jié)合，但親和性很高。隨后該抗體可用于結(jié)合靶物質(zhì)，例如捕獲細(xì)胞。
作為最后的LBP(不論是第一LBP或第二LBP)的抗體或其片段，可以對任何在細(xì)胞表面表達(dá)的目的表位具有特異性，可以作為一種捕獲表達(dá)該表位的細(xì)胞的工具。這種細(xì)胞表面的表位是本領(lǐng)域公知的，無需在此贅述，其中許多是特定分化譜系抗原的已知“標(biāo)記”。同樣，對這種已知細(xì)胞表面標(biāo)記特異的mAb也是本領(lǐng)域公知的。許多可作為商品購買。例如，如果固定的抗體和本發(fā)明的裝置將要捕獲的細(xì)胞是造血干細(xì)胞，那么可以選擇干細(xì)胞標(biāo)記。CD34是一種存在于早期造血干細(xì)胞上的已知抗原，抗CD34mAb也是已知的并可購買到。如圖3-7所示，本發(fā)明方法用于將抗CD34mAb固定在CAR上。這種組合可用于有效地捕獲并分離/富集人CD34+干細(xì)胞，而不會(huì)引起細(xì)胞在表面不期望的非特異性粘附，而缺乏CAR時(shí)，這種粘附就會(huì)發(fā)生，所述CAR可以是HA，其含有一層固相，抗CD34mAb結(jié)合到該固相上。
免疫球蛋白結(jié)合多肽作為LBP如上所述，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及Ig結(jié)合蛋白被共價(jià)固定到CAR固體表面的組合物，裝置和方法，在該表面上會(huì)進(jìn)一步固定抗體(非共價(jià)鍵地)。然后所述的這些后者抗體與靶結(jié)構(gòu)結(jié)合，完成本發(fā)明的最終發(fā)明目的。
優(yōu)選的Ig結(jié)合蛋白實(shí)例包括SpA，SpG，重組嵌合融合蛋白“蛋白A/蛋白G”(pA/g)，以及其它來源的蛋白，如甘露糖結(jié)合凝集素(MBL；以前被稱為甘露聚糖結(jié)合蛋白或MBP)和jacalin(來自植物)。
SpA是由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)產(chǎn)生的高度穩(wěn)定的表面受體，其能夠結(jié)合來自許多物種的Ig分子的Fc片段，特別是IgG的Fc，(Boyle，MDP等，“Bacterial Fc Receptors.”Biotechnology 5697-703(1987)；Boyle，MDP.，ed.BacterialImmunoglobulin-Binding Proteins，Microbiology，Chemistry andBiology，Vol I.Academic Press，San Diego(1990))。參見下面的表1。SpA分子量約為42kDa(基于沉淀數(shù)據(jù)；Bjrk等，1972Bjrk，I等，Eur J Biochem.29579-584(1972))，盡管SpA在SDS聚丙烯酰胺凝膠上的速度異常的慢(表觀分子量為55-56kd；同前)。SpA是單體，不含Cys殘基。其pI為4.85-5.10，在pH1.0-12.0穩(wěn)定。一個(gè)SpA分子能夠同時(shí)結(jié)合至少2分子IgG(Sjquist，J等，Eur JBiochem 29572-578(1972))。SpA已被固定到固體支持物上以促進(jìn)多克隆或單克隆免疫球蛋白的純化和回收。固定的SpA已在不同疾病的治療中被用于體外的免疫吸附(Jia L等，Biomed Chromatogr.，1999，13472-7；Murphy RM等，Mol Biother.，1989，1186-207；Watt RM等，Transfus Sci.，1992，13233-53；HakanssonL等，Eur J Cancer Clin Oncol.，1984，201377-88；Korec S等，J Biol Response Mod.，1984，3330-5；Terman DS.，Int JArtif Organs.，1982，577-80)，并且甚至在體內(nèi)使用以治療化療誘導(dǎo)的溶血性尿毒綜合癥，該綜合癥是通過抗體介導(dǎo)的(Watson，PR等，Cancer 641400-1403(1989)。
重組SpG(Fahnestock，SR等，J.Bacteriology 167870877.(1986)Trends Biotechnol 57984(1987))是來自鏈球菌種Lancefield Group G的一種非常穩(wěn)定的表面受體，在大腸桿菌中產(chǎn)生，其能夠結(jié)合許多物種的Ig特別是IgG的Fc部分(Boyle等，1987，上文)。參見表1。SpG分子量為22.6kDa，然而其SDS PAGE的表觀MW是32kDa。SpG是單體，不含Cys殘基。其pI為4.5，在pH2-10和80℃下穩(wěn)定(在pH7下10min)。每個(gè)蛋白質(zhì)G分子都能夠結(jié)合2分子的IgG，會(huì)生成沉淀。SpG已被固定到固體支持物上以促進(jìn)多克隆或單克隆免疫球蛋白的純化和回收。
來自金黃色葡萄球菌的SpA和來自鏈球菌種(Lancefield GroupG)的SpG對許多物種的免疫球蛋白多樣排列的恒定區(qū)(Fc)都表現(xiàn)出親合性。盡管存在一些重疊，但對于這些Fc-結(jié)合蛋白的特異性在Ig類別，亞類和物種范圍內(nèi)還是有差別(Boyle等，1987，上文；Boyle，1990，上文)。為了產(chǎn)生具有擴(kuò)展物種和亞類范圍的Fc結(jié)合活性的單個(gè)蛋白質(zhì)，編碼SpA和SpG的Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因被融合在一起。在這些構(gòu)建體中，編碼血清白蛋白結(jié)合部位和膜錨定區(qū)域的SpG基因序列被除去。
合成的融合蛋白質(zhì)是相對較新的Ig Pc結(jié)合蛋白，pA/G，分子量為50kDa，統(tǒng)計(jì)學(xué)地測定其pI為6.9。pA/G是來源于雜合基因的重組蛋白質(zhì)，該雜合基因由金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A基因的Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域(包括結(jié)構(gòu)域E，D，A，B和C)和鏈球菌蛋白質(zhì)G基因的Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域(C2和C3)組成。它在大腸桿菌中表達(dá)并親合純化。該融合基因產(chǎn)物含有455個(gè)氨基酸殘基(41個(gè)賴氨酸，無半胱氨酸)和七個(gè)Fc-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(5個(gè)來自蛋白質(zhì)A，2個(gè)來自蛋白質(zhì)G)。pA/G融合蛋白顯示出的Ig靈敏度與SpA和SpG表現(xiàn)的靈敏度相當(dāng)(參見表)，并且與親本蛋白質(zhì)的最佳表現(xiàn)相比，對于人Ig顯示出更高或相等的親合力。(Eliasson，M等，J.Biol.Chem.2634323-4327(1988)；Eliasson，M等，J Immunol 142575-581(1989))。它們顯示出的特異性比單獨(dú)的SpA或SpG更寬。Sun，S和Lew AM(J.Immunol.Meth.15243-48(1992))報(bào)道說pA/G融合蛋白結(jié)合多數(shù)哺乳動(dòng)物物種的Ig，包括靈長目動(dòng)物，食肉目，偶蹄目，奇蹄目，復(fù)齒目(lagomorpha)以及嚙齒目；但不結(jié)合長鼻目，有袋目或avia。與天然的SpG不同，pA/G不結(jié)合人的白蛋白，也不結(jié)合小鼠血清。為此pA/G對于某些免疫學(xué)技術(shù)而言已被認(rèn)為是比單獨(dú)的蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G用途更多并且方便的試劑。pA/G結(jié)合所有人IgG亞類，IgA，IgE，和IgM的Fc部分，以及小鼠IgG亞類1，2a，2b，和3。另外，它結(jié)合來自其它物種的IgG，包括猴子，兔，豬，豚鼠，牛，狗，貓，山羊，馬和綿羊。它不能較好地結(jié)合大鼠Ig，雞Ig，小鼠IgA或小鼠IgM。pA/G不能結(jié)合牛，鼠或人血清白蛋白。pA/G可用于SpA或SpG已知的用途。
這里描述了兩種Ig結(jié)合凝集素(不同于下面特別用于描述凝集素的部分)。Jacalin是一種存在于木菠蘿(Artocarpus integrifolia)種子的凝集素。Jacalin的分子量大約為50kDa，由四個(gè)亞基組成，兩個(gè)10kDa，兩個(gè)16kDa亞基。Jacalin結(jié)合半乳糖(Gal)，在糖蛋白中似乎僅結(jié)合O-糖苷化連接的低聚糖，優(yōu)選Gal結(jié)構(gòu)(β1，3)GalNAc，其以單或雙唾液酸化(disialylated)形式與之結(jié)合。Jacalin特異性地結(jié)合人分泌型IgA，可用于從其它血清糖蛋白中分離人IgA，包括其它Ig種類；瓊脂糖-結(jié)合Jacalin可用于從IgA2中鑒別IgA1。(Roque-Barreira，MC等，J.Immunol.1341740(1985)；Gregory，RL，J.Immunol.Meth.99101(1987))因?yàn)閷gA1的結(jié)合更強(qiáng)。
甘露聚糖結(jié)合凝集素，MBL，是在結(jié)構(gòu)上與補(bǔ)體C1有關(guān)系的一種血漿蛋白質(zhì)(32kDa分子量)，其通過肝臟分泌，特異性地結(jié)合在各種微生物表面上的含甘露糖的糖類，包括細(xì)菌，酵母，寄生原生動(dòng)物和病毒；通過MBL結(jié)合絲氨酸蛋白酶(MASP)活化補(bǔ)體級連反應(yīng)并促進(jìn)噬菌作用。MBL是6組同源三聚體(homotrimers)的一種寡聚復(fù)合體。MBL是鈣依賴性的C型凝集素，其以鈣依賴方式結(jié)合甘露糖和GlcNAc。由于在IgM上存在甘露糖，這種蛋白質(zhì)會(huì)結(jié)合IgM類的抗體。
凝集素作為LBP凝集素是蛋白質(zhì)或糖蛋白，通常來源于植物或海洋動(dòng)物(眾所周知來自細(xì)菌，病毒和哺乳動(dòng)物的凝集素)，對于特定糖或各種糖，通常單或二糖結(jié)構(gòu)具有結(jié)合特異性。例如，伴刀豆凝集素A(Con A)結(jié)合α-D-Glc和α-D-Man。像抗體結(jié)合抗原一樣，凝集素非共價(jià)并可逆地結(jié)合糖類配體(通常通過足夠的濃度)。因此，例如葡萄糖或甘露糖(或α-甲基甘露糖苷)的溶液會(huì)釋放結(jié)合了細(xì)胞或固定糖蛋白的Con A。至于植物凝集素的詳細(xì)描寫，參見例如EJM Van Damme等，Handbook of Plant LectinsProperties and BiomedicalApplications John Wiley & Sons，New York，1998；還可參見網(wǎng)址http//www.plab.ku.dk/tcbh/和http//www.vectorlabs.com/Lectins/Lindex.html，查詢市場上可買到的凝集素。其它有用的綜述包括Goldstein，IJ等，1978，Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.35127-340；D.Mirelman(ed.)，Microbial Lectinsand AgglutininsPropertie Sand Biological Activity，Wiley，New York(1986)；Goldstein IJ，Indian J Biochem Biophys，1990，27368-369。
凝集素能夠被直接固定到表面上的CAR材料，或者就象抗體一樣，可用于夾心方式，其中第一LBP對凝集素具有結(jié)合特異性和親合性(例如一種抗凝集素抗體或當(dāng)凝集素被生物素化時(shí)的鏈霉抗生物素蛋白)，而凝集素充當(dāng)“第二LBP”，非共價(jià)地結(jié)合第一LBP。該凝集素作為捕獲物質(zhì)發(fā)揮作用，結(jié)合其特異性靶，優(yōu)選靶為在細(xì)胞表面上顯示特定糖類結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。通常，這種糖類靶結(jié)構(gòu)是以在糖蛋白或糖脂上的糖鏈的形式。
下面表2列出大量有用的凝集素及其糖結(jié)合特異性。
本發(fā)明的LBP還包括共價(jià)偶聯(lián)的凝集素-抗體或凝集素-抗原綴合物(參見如Chu，U.S.4,493,793)。
本發(fā)明的LBP還可有另一個(gè)種類對細(xì)胞膜的脂雙層具有親合性的堿性分子，例如魚精蛋白，以及蜂毒肽mellitin的膜結(jié)合部分。雖然這些靶結(jié)構(gòu)可能不會(huì)正式地被認(rèn)為是“配體”，但該概念是相同的當(dāng)它被固定到固體表面時(shí)可以親合性地捕獲與IBP結(jié)合的細(xì)胞。
生物素化的第二LBP
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，作為第一LBP的鏈霉抗生物素蛋白被共價(jià)地固定到與固相結(jié)合的CAR物質(zhì)上，優(yōu)選CAR物質(zhì)為HA。然后鏈霉抗生物素蛋白將會(huì)以高度的親合性結(jié)合到任何生物素化的多肽上，該多肽將會(huì)充當(dāng)?shù)诙﨤BP，靶向細(xì)胞上的結(jié)構(gòu)。生物素化多肽的實(shí)例包括ECM多肽，例如膠原，層粘連蛋白，纖連蛋白，血小板反應(yīng)蛋白1，玻連蛋白，彈性蛋白，腱生蛋白，聚集蛋白聚糖，集聚蛋白，骨唾液蛋白，軟骨基質(zhì)蛋白質(zhì)，纖維蛋白原，纖維蛋白，fibulin，粘蛋白，巢蛋白，骨橋蛋白，血纖蛋白溶酶原，restrictin，絲甘聚糖(serglycin)，SPARC/骨粘連蛋白，多能蛋白聚糖，von Willebrand因子以及細(xì)胞粘附分子(CAMs)，例如鈣粘蛋白，連接蛋白以及選擇素。
在一個(gè)
具體實(shí)施例方式
中，包含Arg-Gly-Asp(RGD)三肽序列的合成肽被用作ECM模擬物，因?yàn)檫@是許多ECM蛋白質(zhì)的細(xì)胞附著結(jié)構(gòu)域。RGD肽已被用于修飾許多聚合物表面(PTFE，聚丙烯酰胺，聚氨基甲酸酯，并與多(DL-乳酸共賴氨酸)(poly(DL-lactic acidco-lysine))(PLA)和多(DL-乳-共羥基乙酸)(PLGA)，多(乙二醇)丙烯酸酯共聚物(PEGAA)(在Glass，JR等，Biomaterials 171101-1108(1996)中論述，全文引入作為參考)作為共聚物。Glass等特別描述了使用高碘酸鹽將含RGD肽共價(jià)結(jié)合到交聯(lián)的HA的方法，產(chǎn)生了RGD肽結(jié)合的交聯(lián)HA多孔狀3D基質(zhì)。在本發(fā)明中，RGD肽，例如本領(lǐng)域已知的那些肽，被生物素化，但仍維持其生物活性。這些生物素化的肽(RGD)可以結(jié)合固定的鏈霉抗生物素蛋白，構(gòu)成固定的ECM-樣物質(zhì)，從CAR表面伸出。
表1由蛋白A和G，Jacalin和甘露聚糖結(jié)合蛋白進(jìn)行的免疫球蛋白結(jié)合

蛋白G，蛋白A，蛋白A/G，甘露聚糖結(jié)合蛋白和Jacalin對不同免疫球蛋白(如文獻(xiàn)報(bào)到)的相對親合性w弱結(jié)合 S強(qiáng)結(jié)合w/s中性的nb無結(jié)合-信息不可用表2凝集素和其結(jié)合特異性

這些RGD肽和任何其它合成肽在合成之后被生物素化，或在合成時(shí)在合成過程中使用生物素化氨基酸生物素化。
可作為第二LBP的其它有用的生物素化多肽可以是任何與細(xì)胞外受體結(jié)合的已知生長因子，例如表皮生長因子，成纖維細(xì)胞生長因子，血小板衍生生長因子，神經(jīng)生長因子，轉(zhuǎn)化生長因子-β，以及任何造血的生長因子或刺激淋巴細(xì)胞及其他免疫系統(tǒng)細(xì)胞生長的白細(xì)胞介素。
可使用同樣結(jié)合期望靶位的非多肽分子代替第二LBP。這里它們被稱為“配體結(jié)合分子”(LBM)。有用的第二LBM的實(shí)例是能夠被類似地生物素化的氨基多糖，核酸分子(DNA或RNA)，包括寡核苷酸。
勝于使用抗生物素蛋白-生物素，任何上述分子特異性的抗體能夠被共價(jià)地固定作為第一LBP，并用于將這些第二LBP(以及非肽LBM)結(jié)合到固體表面，用作本文所述目的。
當(dāng)然，上述所有肽，多肽和非肽分子還可以直接結(jié)合到CAR物質(zhì)上充當(dāng)?shù)谝籐BP(或LBM)。多肽及其他高分子的生物素化方法是本領(lǐng)域公知的(Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques.1996，SanDiegoAcademic Press)。例如可使用硫代NHS生物素?；蛘呖蛇x擇5-(biotinamido)pentylamine或生物素酰肼。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知如何選擇生物素化物質(zhì)以及如何將其用于本文目的。
可以通過任何測定結(jié)合到聚合物或塑料上的多肽的已知方法來評定結(jié)合到固體表面上的結(jié)合第一或第二(或第三)LBP數(shù)量?？杉尤牍潭ǘ嚯牡娜魏慰蓹z測標(biāo)記結(jié)合配偶體，可通過常規(guī)適于標(biāo)記的方法如熒光，顏色，或化學(xué)發(fā)光來評定結(jié)合到表面的結(jié)合配偶體的數(shù)量。下面舉例說明了使用Alexa Fluor 488TM抗體，一種熒光標(biāo)記山羊抗小鼠Ig。
還應(yīng)注意本文所述表面可用于在捕獲細(xì)胞之后培養(yǎng)細(xì)胞。因此，如果表面的形式很合適(如皿或燒瓶)，特異性粘附LBP的細(xì)胞可以在去除非粘附細(xì)胞之后留在原地，并可以生長，分化，分泌因子等。人們期望只有不需要粘附表面的細(xì)胞才能在這種容器內(nèi)生長，因?yàn)樵摫砻嬉驯恍揎椂蠧AR物質(zhì)。這種生長之后可通過細(xì)胞的功能性或“結(jié)構(gòu)性”試驗(yàn)評定最初的分離或富集的質(zhì)量。細(xì)胞生長很可能需要加入生長因子或ECM分子，當(dāng)細(xì)胞隨著時(shí)間的過去從固定的LBP處分開時(shí)這些物質(zhì)可以幫助細(xì)胞更加生理學(xué)地附著。
在一個(gè)優(yōu)選具體實(shí)施方式
中，培養(yǎng)瓶的PS表面被涂有HA(有或者沒有中間層)然后用抗CD34 mAb涂覆，其可以是第一或者第二LBP。含有(或被認(rèn)為可能含有)CD34+細(xì)胞的未被分級的細(xì)胞群被加入該表面并使其粘附。這種細(xì)胞群可以來源于骨髓，流動(dòng)的周圍血液，胎盤或臍帶血。洗掉未粘附的細(xì)胞并棄去。用對造血祖細(xì)胞生長優(yōu)化的生長培養(yǎng)基將燒瓶填充到期望的體積。優(yōu)選在未粘附的細(xì)胞被去除之后向培養(yǎng)基中加入ECM物質(zhì)。特異性粘附的CD34+被刺激生長，可能成長為較大數(shù)目用于臨床應(yīng)用(例如干細(xì)胞移植)。如果需要，可以向選擇培養(yǎng)物中加入特異性分化途徑的誘導(dǎo)物，驅(qū)動(dòng)祖細(xì)胞沿著期望的途徑(淋巴的，粒細(xì)胞樣的，單核細(xì)胞樣的)分化。
在另一
具體實(shí)施例方式
中，本文描述的LBP涂覆表面并不是用于結(jié)合完整的細(xì)胞，而是用于結(jié)合細(xì)胞溶解產(chǎn)物或其它亞細(xì)胞制劑。
本發(fā)明的CAR表面可用第一或第二LBP(捕獲物質(zhì))制備，所述LBP可在聚合物表面以任何圖形或陣列的形式分布，例如調(diào)整為預(yù)定圖形的點(diǎn)微陣列模式。因此例如，如本文所述，一種或多種不同類型抗體的微陣列可以固定到CAR表面。除捕獲或結(jié)合完整細(xì)胞之外，本文所述的LBP涂層表面，例如一種抗體微陣列的形式，可用來檢測或定量細(xì)胞溶解產(chǎn)物或其它亞細(xì)胞制劑形式的許多相應(yīng)抗原或表位。因此本發(fā)明提供一種生產(chǎn)裝置的方法，該裝置包含LBP的高密度陣列，所述LBP例如細(xì)胞表面受體的抗體或配體。這種裝置可用于定量細(xì)胞群體中特定蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，例如以選定的方式誘導(dǎo)分化或其它細(xì)胞活性的體外處理的細(xì)胞。這些裝置和方法可輕易地適應(yīng)細(xì)胞的高通量分析，所述細(xì)胞是用測試物質(zhì)如藥物處理(或未處理)過的。例如，溶解用不同藥物處理的各組細(xì)胞，溶解產(chǎn)物或培養(yǎng)上清液被取樣并置于CAR表面上，該表面上已被固定有抗體文庫微陣列或受體配體肽文庫。
本方法可用于“復(fù)制平板培養(yǎng)”或分裂的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中細(xì)胞在分離的孔中生長或附著于生長面的不同區(qū)域，以某種方式處理，觀察或測試功能性反應(yīng)。然后將來自各孔的細(xì)胞或上清液、或來自特定表面區(qū)域的細(xì)胞等分試樣轉(zhuǎn)移到本發(fā)明的相應(yīng)CAR表面，該表面帶有LBP的微陣列，如抗體，以測試特定細(xì)胞產(chǎn)物的存在或數(shù)量，所述產(chǎn)物可以是在完整細(xì)胞上表達(dá)，從細(xì)胞分泌的，或者存在于細(xì)胞內(nèi)并通過提取或者溶解方法被釋放。這種分裂或復(fù)制方法可以在在例如選定的功能活性或離散細(xì)胞群的活性與其表達(dá)的蛋白產(chǎn)物之間構(gòu)建相互關(guān)系。
在另一應(yīng)用了完整細(xì)胞的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了使用固定的配體文庫尋找細(xì)胞表面受體的方法，所述配體包括但不限于肽，細(xì)胞外基質(zhì)分子，生長因子，細(xì)胞因子，抗體，粘多糖，凝集素等等。在這種系統(tǒng)中的讀出(readout)可以是功能性的試驗(yàn)，從而避免利用胞內(nèi)標(biāo)記基因。
上述方法與裝置具有許多應(yīng)用，如作為免疫診斷及其他評價(jià)細(xì)胞或者各種體液的診斷方法的一部分。
對于指定配體結(jié)合多肽的基本固定方法與選項(xiàng)在本發(fā)明的一個(gè)一般具體實(shí)施方式
中，LBP被固定到CAR物質(zhì)上，優(yōu)選HA，其如本文所述被放置。使用抗CD34 mAb舉例來說(還可參見圖3-7)，如本文所述，本方法包括使用還原性胺化作用將抗CD34直接共價(jià)固定到高碘酸鹽活化的HA上的步驟。
在另一
具體實(shí)施例方式
中包括第一與第二LBP，蛋白A或蛋白G被固定到高碘酸鹽活化的HA上。然后使抗CD34 mAb非共價(jià)地結(jié)合蛋白A或蛋白G。
在另一
具體實(shí)施例方式
中包括第一與第二LBP，抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白被固定到高碘酸鹽活化的HA上。生物素被結(jié)合到抗CD34 mAb上，使生物素化mAb結(jié)合抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白。
配體結(jié)合多肽到CAR涂覆表面的共價(jià)結(jié)合涂有HA，AA或其它CAR物質(zhì)的表面如上面和實(shí)施例所述。這些多糖的氧化導(dǎo)致兩個(gè)相鄰的羥基之間的糖環(huán)裂解，形成兩個(gè)反應(yīng)性醛基。通常當(dāng)醛基部分(RCHO)與伯胺基部分(R′NH2)反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物建立了一種平衡，其為相對不穩(wěn)定的亞胺部分(R′N CHR)。這種偶聯(lián)反應(yīng)能夠在如上所述的氧化作用相同條件下進(jìn)行，其被設(shè)計(jì)成能保護(hù)糖蛋白不受破壞。為穩(wěn)定糖蛋白與生物材料表面之間的結(jié)合，隨后使用還原劑(即，穩(wěn)定劑)進(jìn)行亞胺部分的還原性烷基化作用，例如氫硼化鈉，氰基氫硼化鈉和胺硼烷(amine borane)，以形成仲胺(R′NH-CH2R)。該反應(yīng)還可以在與氧化作用相同的條件下進(jìn)行。但是通常結(jié)合和穩(wěn)定反應(yīng)在約0-50℃溫度下中性或略微堿性的溶液中進(jìn)行。優(yōu)選，pH大約為6-10，溫度大約為4-37℃，進(jìn)行結(jié)合和穩(wěn)定反應(yīng)。這些反應(yīng)(結(jié)合和穩(wěn)定)可以進(jìn)行幾分鐘或多個(gè)小時(shí)。通常反應(yīng)在24小時(shí)之內(nèi)完成(即結(jié)合和穩(wěn)定)。
在另一方法中，涂有HA，AA或其它CAR物質(zhì)的表面以類似于在上面章節(jié)“HA的羧基的和表面胺基之間的偶聯(lián)反應(yīng)”中所述的方式被處理，而不是進(jìn)行氧化作用。此時(shí)，HA(或其它CAR物質(zhì))上的羧基與肽或多肽(或其它含胺分子)上的胺基起反應(yīng)，以便將肽或多肽結(jié)合到HA上，從而結(jié)合到表面上。這些在圖4右邊用示意圖說明。正如以上的討論，CAR物質(zhì)的COO-基團(tuán)通過加入EDC而被活化，形成活性中間體o-acylisourea酯。優(yōu)選通過向反應(yīng)中加入NHS，硫代NHS或其它活性中間體酯穩(wěn)定化合物來穩(wěn)定那些不穩(wěn)定的中間體。肽或多肽的自由氨基與這些酯中間體反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵，從而將肽或多肽共價(jià)固定到表面上。這些反應(yīng)可以通過一個(gè)或兩個(gè)步驟進(jìn)行。兩步反應(yīng)包括首先用EDC處理HA，AA或其它CAR物質(zhì)，有或沒有穩(wěn)定化合物，然后進(jìn)行第二個(gè)步驟，加入肽或多肽。在一步反應(yīng)中，各組分都被混合起來(結(jié)合表面的HA，EDC，任選的穩(wěn)定化合物和多肽)，使其發(fā)生結(jié)合。
目前已綜合說明了本發(fā)明，通過參考以下說明性實(shí)施例可以更加容易地了解本發(fā)明，除非明確說明，否則所述實(shí)施例并非是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1
ESCA分析未處理和等離子處理的聚苯乙烯按下述制備60mm直徑的聚苯乙烯培養(yǎng)皿(Falcon，BDBiosciences)1.對照(未處理)2.等離子空氣處理在140mTorr壓力下，同時(shí)以8sccm的恒速排氣到等離子室中，在40W功率下，總處理時(shí)間為30秒進(jìn)行等離子處理。
進(jìn)行ESCA(化學(xué)分析電子光譜法)評定處理的效果。當(dāng)研究聚合物樣品(絕緣體)時(shí)，在SSX-100光譜儀(Surface ScienceIncorporated，Mountain View，CA)上進(jìn)行ESCA，該光譜儀裝備有單色化Al KαX射線源，半球形電子分析器和用于電荷補(bǔ)償?shù)牡湍茈娮幼x數(shù)電子槍。通常樣品被引入制備室，該室被維持在約10-4Torr，然后轉(zhuǎn)移到分析室，該室通常維持在10-8Torr。通常以35°電子擊射角(take-off angle)分析樣品，該擊射角定義為樣品表面和半球形分析器位置之間的角度，擊射角大致相應(yīng)于50-100之間的取樣深度。
所獲表面組成列于表3表3

(*)不了解未處理聚苯乙烯的氧污染來源。PS的ESCA光譜理論上應(yīng)該是100％碳。
不清楚在未處理平皿上的氧污染，不過可能由微量的SiO2污染所引起。
實(shí)施例2比較PrimariaTM和PLL處理表面該實(shí)施例說明PrimariaTM表面與PLL處理表面的比較，未修飾或只使用磷酸鉀緩沖液和EDC用0.5％HA修飾。在乙醇中進(jìn)行HA表面的穩(wěn)定性試驗(yàn)。
將60mm PS培養(yǎng)皿(Falcon，BD Biosciences)分成下列各組1.(2)未處理2.(2)空氣等離子體處理3.(2)空氣等離子體處理，PLL修飾4.(2)空氣等離子體處理，PLL修飾和HA修飾(0.5％HA)5.(2)空氣等離子體處理，PLL修飾和HA修飾(0.5％HA)，用乙醇漂洗。
將35mm PrimariaTM平皿分成下述各組1.(2)PrimariaTM2.(2)PrimariaTM，和HA修飾(0.5％HA)3.(2)PrimariaTM，并且HA修飾(0.5％HA)，乙醇漂洗如實(shí)施例1所述進(jìn)行空氣等離子體處理(在非PrimariaTM平皿上)。使用穩(wěn)定的空氣吸氣泵(inbleed)，以8sccm的速率，總處理時(shí)間為30秒，產(chǎn)生140mTorr等離子室內(nèi)的處理壓力。
將聚L-賴氨酸(PLL)(Sigma)溶于去離子水(DIH2O)，獲得0.025％溶液，在保溫箱內(nèi)37℃過夜孵育充滿了聚賴氨酸溶液的平皿，使該溶液涂覆到5個(gè)等離子處理的聚苯乙烯平皿上。第二天上午去除聚賴氨酸溶液，用DIH2O徹底清洗平皿，使其干燥直至進(jìn)一步修飾。
從BD Biosciences(Labware，Bedford)購買40mm直徑PrimariaTM平皿，作為標(biāo)準(zhǔn)品(as received)。
HA涂覆。在磷酸鉀緩沖液中制備0.5％HA(來自公雞雞冠，Sigma)溶液。將EDC溶于磷酸鉀緩沖液并加入產(chǎn)生約1EDC分子每HA重復(fù)單元的比率。用5ml在磷酸鉀緩沖液中的HA/EDC溶液涂覆PLL涂層及PrimariaTM表面，放置過夜使發(fā)生反應(yīng)。第二天上午去除HA溶液，用DIH2O徹底洗滌各平皿，去除任何非共價(jià)附著的HA，然后使其風(fēng)干。
細(xì)胞培養(yǎng)方案使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，在我們的實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)來源于Dr.L.D.Quarles，Duke大學(xué)及由Dr.Gayle E.Lester，University of NorthCarolina at Chapel Hill惠贈(zèng)的MC3T3-E1成骨細(xì)胞。MC3T3-E1是一種已被清楚表征且生長迅速的成骨細(xì)胞細(xì)胞系，之所以選擇它是因?yàn)樗闪己玫馗街酱蠖鄶?shù)通常應(yīng)用的組織培養(yǎng)表面。本領(lǐng)域技術(shù)人員可能得到的其它細(xì)胞系應(yīng)該可以產(chǎn)生類似的結(jié)果。
根據(jù)本領(lǐng)域已知方法，使用胰蛋白酶-EDTA從細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中取下細(xì)胞。計(jì)數(shù)細(xì)胞，離心沉淀并重懸于含10％胎牛血清的培養(yǎng)基。以該水平加入的胎牛血清使得這個(gè)在HA涂覆表面預(yù)防細(xì)胞粘附的測試更加嚴(yán)格。
一個(gè)經(jīng)過各處理的HA涂層平皿，如，一個(gè)用HA涂覆的PLL-涂層及PrimariaTM表面，被滲入乙醇中1小時(shí)，通過這個(gè)滅菌方法研究這個(gè)HA涂層表面的穩(wěn)定性。然后立即接種(seeding)細(xì)胞接種細(xì)胞(約1百萬細(xì)胞每60mm平皿，800,000細(xì)胞每35mm平皿)并在保溫箱中37℃孵育。通過相差顯微技術(shù)在細(xì)胞接種之后30min，5h，20h，29h，44h，5d，6d和7d監(jiān)測細(xì)胞附著。細(xì)胞附著如下面所述評分。在所有實(shí)施例中均使用該評分體系。
評分++細(xì)胞附著并伸展，形成匯合的細(xì)胞單層+細(xì)胞附著并伸展，未形成匯合的單層±細(xì)胞附著，未伸展(圓形)-個(gè)別細(xì)胞附著，未伸展(圓形)--未觀察到細(xì)胞nd未做該結(jié)果如表4所示。
表4

總之，在EDC存在下用0.5％HA修飾的PLL和PrimariaTM表面形成匯合細(xì)胞層。乙醇清洗的表面說明了HA涂層的溶劑穩(wěn)定性——HA涂層可以用乙醇清洗而不會(huì)改變其特性。
ESCA分析的結(jié)果(參見實(shí)施例1描述ESCA設(shè)置的說明)列于表5。
表5

(*)不了解未處理聚苯乙烯的氧污染來源。PS的ESCA光譜理論上應(yīng)該是100％碳。
空氣等離子體處理引入了含氧的基團(tuán)，而PLL修飾引入了氮，氮存在于PrimariaTM表面。至于聚L-賴氨酸，兩個(gè)氮的每一個(gè)都代表一個(gè)功能性的[伯]胺基，適合于共價(jià)結(jié)合HA。
再一次加入HA產(chǎn)生下述O/C和O/N比率的改變表6

加入HA之后所有表面的O/C和O/N比率都升高，表明有些HA已與表面相連。但是在PLL或PrimariaTM上未觀察到細(xì)胞粘附的預(yù)防作用，表明按本實(shí)施例描述方法修飾的表面上HA數(shù)量還不足夠多。
實(shí)施例3僅使用EDC，比較磷酸鉀和MES緩沖液對于HA結(jié)合PLL處理表面的作用根據(jù)實(shí)施例1所述等離子方法處理96孔平底微量滴定板。使用穩(wěn)定的空氣吸氣泵(inbleed)，以8sccm的比率，總處理時(shí)間為60秒，產(chǎn)生約140mTorr等離子室內(nèi)的處理壓力。
將PLL(Sigma)溶于DIH2O，獲得0.05％溶液，在室溫下將溶液涂覆到空氣等離子體處理的96孔板的9個(gè)孔的底部上兩個(gè)小時(shí)。然后去除聚賴氨酸溶液，用DIH2O徹底清洗孔，將板放置室溫干燥直至進(jìn)一步修飾。
如實(shí)施例2所述進(jìn)行HA涂覆。在pH5.3的0.1M磷酸鉀緩沖液中制備0.5％HA(來自公雞雞冠，Sigma)溶液。同樣地在pH3.68的0.1MMES緩沖液中制備0.5％HA溶液。將EDC溶于磷酸鉀緩沖液或MES緩沖液，并分別加入HA在磷酸鉀緩沖液中的溶液或者HA在MES緩沖液中的溶液，得到約1EDC分子每HA重復(fù)單元的比率。加入100μl HA/EDC溶液修飾96孔板中的PLL涂覆表面，這樣PLL處理表面不但被HA/EDC在磷酸鉀緩沖液中的溶液修飾，而且被HA/EDC在MES緩沖液中的溶液修飾(每種條件重復(fù)3次)。第二天上午去除HA溶液，用DIH2O徹底洗滌各孔，去除任何非共價(jià)附著的HA，然后使板風(fēng)干直至細(xì)胞培養(yǎng)。
使用MC3T3-E1成骨細(xì)胞如實(shí)施例2所述進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。以約10,000細(xì)胞每孔接種細(xì)胞并在保溫箱中37℃孵育。
通過相差顯微技術(shù)在細(xì)胞接種之后30min，50min，1d，2d和5d監(jiān)測細(xì)胞粘附情況。如上評分細(xì)胞粘附作用。
結(jié)果列于表7。
表7

1PPB＝磷酸鉀緩沖液；2MES＝2-[N-嗎啉代]乙烷磺酸...
概括地說，EDC催化的HA和PLL的結(jié)合，導(dǎo)致表面不能防止細(xì)胞伸展和生長。但是，與MES緩沖液組合，降低了細(xì)胞粘附，任何看得見的細(xì)胞粘附主要是以凝塊的形式并在5天以上的培養(yǎng)下維持該形式。該觀察結(jié)果可能是HA部分地涂覆了表面，觀察到的細(xì)胞粘附可能是由于涂覆在下面PLL涂層(其支持粘附作用)上的HA有缺陷的緣故。
實(shí)施例4在MES緩沖液中的EDC和EDC/NHS催化了PrimariaTMHA結(jié)合的表面。
從BD Biosciences購買PrimariaTM處理的24孔平底板用作標(biāo)準(zhǔn)。
如實(shí)施例2所述進(jìn)行EDC-支持的HA涂覆。在pH3.68的0.1M MES緩沖液中制備0.5％HA(來自公雞雞冠，Sigma)溶液。將EDC溶于MES緩沖液并被加到溶于MES緩沖液中的HA中，得到約1EDC分子每HA重復(fù)單元的比率。加入3ml HA/EDC溶液修飾PrimariaTM板中的10個(gè)孔。放置板過夜使其發(fā)生反應(yīng)。第二天上午去除HA溶液，用DIH2O徹底洗滌各孔，去除任何非共價(jià)附著的HA，然后使板風(fēng)干直至細(xì)胞培養(yǎng)。
類似于單獨(dú)使用EDC進(jìn)行HA涂覆，制備EDC/NHS支持的HA涂層。在pH3.68的0.1M MES緩沖液中制備0.5％HA(來自公雞雞冠，Sigma)溶液。將EDC和NHS溶于MES緩沖液并被加到溶于MES緩沖液中的HA中，得到約1EDC分子和0.5NHS分子每HA重復(fù)單元的比率。加入3ml HA/EDC/NHS溶液修飾PrimariaTM板中的10個(gè)孔。過夜放置板和平皿使其發(fā)生反應(yīng)。第二天上午去除HA溶液，用DIH2O徹底洗滌各平皿和孔，去除任何非共價(jià)附著的HA，然后使板和平皿風(fēng)干直至細(xì)胞培養(yǎng)。
使用MC3T3-E1成骨細(xì)胞如實(shí)施例2所述進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
在24孔PrimariaTM板中以不同接種密度接種細(xì)胞，如100，250，1000和2000個(gè)細(xì)胞每mm2PrimariaTM處理，PrimariaTM處理HA/EDC修飾的培養(yǎng)表面和PrimariaTM處理，HA/EDC/NHS修飾表面。細(xì)胞接種2.5小時(shí)之后，從PrimariaTM處理，PrimariaTM處理HA/EDC修飾的表面和PrimariaTM處理，HA/EDC/NHS修飾表面上去除培養(yǎng)基和任何未粘附細(xì)胞。用培養(yǎng)基輕輕地洗滌表面上的所有粘附細(xì)胞，在表面上放置2ml培養(yǎng)基以在整段研究時(shí)期內(nèi)維持粘附細(xì)胞。
在鏡檢研究之間所有培養(yǎng)物都維持在37℃保溫箱內(nèi)。通過相差顯微技術(shù)在細(xì)胞接種之后30min，2h，1d，2d和5d監(jiān)測細(xì)胞粘附情況。如上評分細(xì)胞粘附作用。該結(jié)果如表8所示。
這些示范性的結(jié)果清楚地表明使用含MES緩沖液和EDC和NHS組合的培養(yǎng)基制備的HA表面能夠防止細(xì)胞粘附。如果表面已被等離子處理過從而存在足量的胺基，那么即使在沒有中間層(例如PLL或PEI)的情況下，以約0.5NHS分子每HA重復(fù)單元的比率加入NHS就足以穩(wěn)定活性中間體并提高HA偶聯(lián)反應(yīng)的效率，而先前則認(rèn)為PLL或PEI中間層是必需的。
表8

1“洗滌過”意思指2.5小時(shí)之后去除了未粘附細(xì)胞，用PBS清洗該表面并補(bǔ)充培養(yǎng)基。
實(shí)施例5銨等離子處理然后6天之后涂覆透明質(zhì)酸。
為鑒定等離子處理?xiàng)l件，除PrimariaTM之外，進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)找到允許細(xì)胞粘附抗性層或透明質(zhì)酸(HA)或藻酸鹽(AA)直接共價(jià)連接到聚合物表面的條件。
用五種不同的氨等離子處理60mm聚苯乙烯平皿(Falcon 1007，BDLabware)(每種處理?xiàng)l件四個(gè)平皿)。所有的處理均使用95瓦，13.56MHz RF平面二極管形成的等離子，樣品置于底部驅(qū)動(dòng)電極，電極頭接地。電極直徑為20cm和間隔6cm。該處理?xiàng)l件是條件A泵到20mTorr基礎(chǔ)壓力的室，形成375mTorr NH3氣壓，進(jìn)行25秒等離子處理。
條件B泵到20mTorr基礎(chǔ)壓力的室，形成375mTorr NH3氣壓，進(jìn)行120秒等離子處理。
條件C泵到0.3mTorr基礎(chǔ)壓力的室，形成200mTorr氬氣氛，進(jìn)行60秒等離子處理，然后25秒，375mTorr NH3等離子處理。
條件D泵到0.3mTorr基礎(chǔ)壓力的室，形成200mTorr氬氣氛，進(jìn)行60秒等離子處理，然后120秒，375mTorr NH3等離子處理。
條件E泵到20mTorr基礎(chǔ)壓力的室，形成由17％氬和83％NH3組成的360mTorr氣氛，進(jìn)行25秒等離子處理。
等離子處理后，在室溫下(RT)貯藏樣品6天，然后根據(jù)以下方法用HA涂覆。
ESCA分析使用化學(xué)分析電子光譜法(ESCA)研究氨等離子處理聚苯乙烯平皿的化學(xué)成分。所有的等離子處理平皿均顯示碳，氧，氮，有些顯示少量(＜1％)的Cl污染。N/C和O/C比列于圖1。
HA涂覆方法根據(jù)實(shí)施例4所述方法用HA涂覆等離子處理的平皿。
細(xì)胞培養(yǎng)以約700個(gè)細(xì)胞每mm2培養(yǎng)表面的接種密度，將如上所述處理的MC3T3-E1成骨細(xì)胞接種到平皿。孵育約4.5小時(shí)之后，獲得活體培養(yǎng)物的相差襯托象(phase contrast images)。在所有的表面上都看到細(xì)胞粘附。但是此時(shí)在等離子處理的對照上的細(xì)胞形成了匯合的單層細(xì)胞，而等離子處理和HA涂覆的平皿上的細(xì)胞粘附仍然是不完全的，存在顯示在該平皿表面上沒有細(xì)胞粘附的部分。
如上所述對等離子處理和HA涂覆表面的細(xì)胞粘附進(jìn)行評分，結(jié)果列于表9。
表9氨等離子處理15分鐘或6天之后，涂有HA的PS表面的細(xì)胞粘附

當(dāng)該平皿在等離子處理和HA涂覆之間放置6天時(shí)，使用該公開方法在氨等離子處理平皿上進(jìn)行的HA涂覆并未杜絕細(xì)胞粘附，但顯著地減少了細(xì)胞粘附。
實(shí)施例6銨等離子處理15分鐘后進(jìn)行透明質(zhì)酸涂覆用選自實(shí)施例5所述五種等離子處理?xiàng)l件的條件A，條件B和條件E處理60mm聚苯乙烯平皿(Falcon 1007，BD Labware)(每種處理?xiàng)l件四個(gè)平皿)。
ESCA分析如上所述對樣品進(jìn)行ESCA分析。所有的等離子處理平皿均顯示碳，氧，氮，有些顯示少量(＜1％)的Cl污染，如實(shí)施例5中所述。
HA涂覆方法等離子處理之后，根據(jù)實(shí)施例5所述方法立即(在15分鐘之內(nèi))用HA涂覆樣品。
細(xì)胞培養(yǎng)用胰蛋白酶-EDTA從細(xì)胞培養(yǎng)燒瓶中除去MC3T3-E1成骨細(xì)胞。計(jì)數(shù)細(xì)胞，離心沉淀并重懸于含10％胎牛血清的培養(yǎng)基。以約420細(xì)胞/mm2的接種密度將細(xì)胞接種到平皿。孵育約3小時(shí)之后，獲得活體培養(yǎng)物的相差襯托象，再一次根據(jù)說明書所述對等離子處理和HA涂覆表面的細(xì)胞粘附進(jìn)行評分，將結(jié)果歸納為表格。在所有的等離子處理對照表面上都看到細(xì)胞粘附。但是，在所有的等離子處理，HA涂覆平皿上都發(fā)現(xiàn)了顯示并非粘附的圓細(xì)胞。
相差顯微技術(shù)之后，去除培養(yǎng)基和任何未粘附細(xì)胞，用PBS清洗平皿2次，用3ml 10％甲醛液(Sigma)過夜孵育細(xì)胞使其固定。次日早晨去除甲醛液，在PBS中清洗平皿兩次，每平皿用2ml蘇木精溶液染色細(xì)胞。圖2比較了所有平皿染色情況。在所有的三種等離子對照平皿中都可看到紫色染色細(xì)胞。相比之下，使用條件A和B等離子處理和HA涂覆的平皿中沒有觀察到紫色染色。使用條件E然后HA涂覆的等離子處理平皿有少量染色，表明這種涂覆方法獲得的HA涂層有些缺陷，該涂層允許細(xì)胞附著于下層的聚苯乙烯基質(zhì)上。這些結(jié)果證實(shí)在活體培養(yǎng)物上的觀察結(jié)果，使用本公開方法在等離子處理之后立即在氨等離子處理平皿上涂覆HA能夠防止細(xì)胞粘附。這種意外的發(fā)現(xiàn)容許用透明質(zhì)酸形成更優(yōu)良的細(xì)胞粘附抗性表面，不需要PEI，聚賴氨酸或其它含胺化合物的中間層，從而大大地簡化了需要這種表面的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備及其他產(chǎn)品和裝置的產(chǎn)生過程。為獲得最佳結(jié)果，這種表面的HA處理應(yīng)該于等離子處理之后立即進(jìn)行；但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將其延遲最多約一個(gè)小時(shí)也可產(chǎn)生滿意的結(jié)果。
本發(fā)明的HA涂層表面優(yōu)選在4℃干燥貯藏，并已知當(dāng)其在這些條件下貯藏時(shí)其細(xì)胞粘附抗性可持續(xù)至少五月。
實(shí)施例7固定有抗CD34的細(xì)胞粘附抗性表面如下所述處理表面上結(jié)合有HA的聚苯乙烯96孔微量培養(yǎng)板。用50mM高碘酸鈉溶液處理共價(jià)結(jié)合的HA層(100μl/well，2小時(shí))，在HA的glucoronic酸環(huán)中的相鄰羥基被氧化。氧化反應(yīng)導(dǎo)致glucoronic酸環(huán)裂解并形成反應(yīng)性的醛。在氰基氫硼化物緩沖液(Sigma)的存在下，以圖5-7所述的濃度向各孔加入第一LBP，使其共價(jià)結(jié)合HA，所述第一LBP可以是蛋白A，蛋白G或抗生物素蛋白(ImmunoPure Avidin(Pierce))的形式。最后向固定的蛋白A或蛋白G中加入來自Pharmingen的鼠抗CD34mAb(IgG1，κ)，并以圖5-7所列濃度，向固定的抗生物素蛋白中加入綴合了生物素的大鼠抗小鼠CD34單克隆抗體(PharMingen)。4℃過夜使抗體與LBP(SpA，SpG或抗生物素蛋白)反應(yīng)。
向各孔加入10μg/ml固定數(shù)量的熒光標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(AlexaFluor 488山羊抗小鼠IgG(H+L)，來自Molecular Probes)，4℃下維持1小時(shí)，測試結(jié)合的抗體數(shù)量。洗滌之后，使用BMG熒光計(jì)閱讀各孔的熒光。列于圖5-7的結(jié)果是直接的熒光測量結(jié)果。這些數(shù)值反映了結(jié)合到HA涂層表面的抗體數(shù)量。評價(jià)了三個(gè)表面的抗CD34mAb結(jié)合情況。
表面1(圖5)是以三個(gè)濃度蛋白G(SpG)修飾的HA，例如1，10和100μg/ml。以3，30和300μg/ml向每個(gè)表面加入抗CD34 mAb，得到九個(gè)不同的SpG/抗CD34 mAB組合，該實(shí)驗(yàn)包括各種的對照，如下面表格所述。
表面1包含以下基團(tuán)

下面列出了各板的布局。

使用SpG作為LBP固定的抗CD34 mAb的熒光結(jié)果顯示抗CD34 mAb被固定了，但與SpG和mAb的濃度相對無關(guān)(在這里的研究范圍內(nèi))。
表面2(圖6)是以四個(gè)濃度1，10，50和100μg/ml的SpA修飾的HA?？笴D34 mAb以0.3，3，10，30或300μg/ml加入這些表面。在兩個(gè)不同的96孔板上進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)以3個(gè)重復(fù)為基準(zhǔn)。不同的條件和多方面的對照概括在下面表格中。
表面2包含以下基團(tuán)


使用SpA作為LBP固定的抗CD34 mAb的熒光結(jié)果顯示抗CD34 mAb被固定了，但固定化顯示在更低的SpA和抗CD34 mAb濃度下更加有效(在研究范圍以上)。
表面3是用3個(gè)濃度下的抗生物素蛋白修飾的HA1，10和100μg/ml。再一次如上所述使用熒光抗免疫球蛋白抗體檢測固定的mAb的存在。表面3包含以下基團(tuán)

使用抗生物素蛋白作為LBP固定的生物素化抗CD34 mAb的結(jié)合結(jié)果顯示抗CD34 mAb被非常有效地固定，并且在試驗(yàn)的范圍上，抗生物素蛋白和生物素化mAb濃度越高，固定作用效率隨之提高。
概述上述觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)三個(gè)測試中將抗體固定到HA涂覆表面效率最低的是SpG。實(shí)際上，mAb到HA的直接固定作用(在這些實(shí)驗(yàn)中的對照孔)大于與首先固定在HA上的SpG結(jié)合的抗體(結(jié)果未列出)。
抗CD34 mAb與共價(jià)結(jié)合到HA的SpA的結(jié)合(固定)比結(jié)合SpG更加有效。使用較低的SpA和抗CD34 mAb在溶液中的數(shù)量似乎有利獲得更高的固定效率。
抗生物素蛋白共價(jià)結(jié)合到HA以及生物素化mAb固定到這些共價(jià)結(jié)合的抗生物素蛋白導(dǎo)致了最大數(shù)量的mAb結(jié)合到該表面。更高的抗生物素蛋白濃度與更高的生物素化抗CD34 mAb濃度組合導(dǎo)致熒光增強(qiáng)，表明mAb的固定效率更高。
這里所列的結(jié)果說明抗生物素蛋白-生物素化mAb固定策略使抗體很好地結(jié)合到HA涂層表面。
實(shí)施例8使用EDC/NHS結(jié)合將LBP連接到HA表面如下所述使用三種不同的化學(xué)作用處理表面上結(jié)合有HA的聚苯乙烯96孔微量培養(yǎng)板，將不同的膠原結(jié)合到HA上。
高碘酸鹽氧化作用用50mM高碘酸鈉處理共價(jià)結(jié)合的HA層(50μl/孔)2小時(shí)，在HA的葡糖醛酸環(huán)中的相鄰羥基被氧化。氧化反應(yīng)導(dǎo)致相鄰環(huán)OH基團(tuán)之間的葡糖醛酸環(huán)裂解并形成反應(yīng)性的醛。
氧化作用之后，將50μl含有I型，III型或IV型膠原的溶液加入適當(dāng)?shù)母骺?，與高碘酸鹽氧化的HA表面反應(yīng)，所述膠原均以100μg/ml溶解于10mM乙酸緩沖液中。將50μl氰基氫硼化物緩沖液(Sigma)加到各孔膠原溶液之上。過夜孵育該板。此后，向各孔加入50μl Tris(GIBCO)，孵育2hr，阻斷任何未反應(yīng)的醛基。然后去除各孔內(nèi)的溶液，首先用NaCl、乙酸和去離子蒸餾水(DIH2O)混合物洗滌該涂層表面，以去除任何離子結(jié)合的膠原，然后用DIH2O洗滌至少3次。干燥放置該表面并貯藏在4℃，直至應(yīng)用于如下所述實(shí)驗(yàn)。
EDC/NHS預(yù)處理向各孔加入30μl含EDC和NHS的溶液，活化固定結(jié)合的HA上的羧基20分鐘，所述EDC和NHS濃度均為5mg/ml，在MES緩沖液(pH3.6)中。然后去除EDC/NHS溶液，向各孔加入100μl的50μg/ml I，III或IV型膠原的溶液，放置使其反應(yīng)過夜。然后去掉溶液，用NaCl/乙酸/DIH2O混合物洗滌各孔，再用DIH2O洗滌至少3次。在這種情況下，阻斷并非是必需的，因?yàn)镹HS穩(wěn)定的EDC的水解降解隨時(shí)間產(chǎn)生了活性中間體酯。干燥放置該涂層表面并貯藏在4℃，直至應(yīng)用于如下所述實(shí)驗(yàn)。
EDC/NHS活化作用的同時(shí)進(jìn)行蛋白結(jié)合(“共同處理”)將含有EDC和NHS的溶液加入到I，III或IV型膠原的溶液中，獲得終蛋白質(zhì)濃度為50μg/ml的含EDC/NHS的蛋白質(zhì)溶液，所述EDC和NHS的濃度均為5mg/ml，在MES緩沖液(pH3.6)中。向每孔加入100μl該溶液，放置使其反應(yīng)過夜。然后去掉溶液，用NaCl/乙酸/DIH2O混合物洗滌各孔，再用DIH2O洗滌至少3次。在這種情況下，阻斷并非是必需的，因?yàn)镹HS穩(wěn)定的EDC的水解降解隨時(shí)間產(chǎn)生了活性中間體酯。干燥放置該涂層表面并貯藏在4℃，直至應(yīng)用于如下所述實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果將如上所述處理的MC3T3-E1成骨細(xì)胞以約104細(xì)胞/孔的密度接種到各孔。過夜使細(xì)胞附著并伸展。然后使用染色活細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的鈣黃綠素(Calcein)染色細(xì)胞，使用自動(dòng)鏡檢獲得各孔的活細(xì)胞計(jì)數(shù)。粘附到不同表面(與結(jié)合到PS表面的HA相連的3種不同膠原)的細(xì)胞數(shù)目列于下面表10。
在具有CAR表面(HA結(jié)合到PS，沒有加入蛋白)的對照孔中，未觀察到細(xì)胞粘附或伸展。蛋白質(zhì)涂覆的HA表面的結(jié)果顯示如下。
表10粘附到處理的HA表面的細(xì)胞數(shù)目(每孔)

在所有的蛋白質(zhì)結(jié)合表面上均觀察到有活力的粘附細(xì)胞，表明兩種化學(xué)作用，即高碘酸鹽氧化作用和羧化物活化作用順利地將蛋白質(zhì)結(jié)合到HA透明質(zhì)酸上(可以同樣地預(yù)見到能將蛋白質(zhì)結(jié)合到包括AA的其它CAR物質(zhì)和HA和AA衍生物上)。如此生產(chǎn)的CAR表面共價(jià)相連的蛋白質(zhì)可以使細(xì)胞保留生物學(xué)功能，在所述情形中為粘附到表面上。
上面引用的所有參考文獻(xiàn)均全文并入本文作為參考，無論其被明確地并入與否。
本說明書中說明并論述的具體實(shí)施方式
僅僅是教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員本發(fā)明人所知的實(shí)現(xiàn)并應(yīng)用本發(fā)明的最佳方法，不應(yīng)該被認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員按照上述教導(dǎo)可以理解，本發(fā)明示范性具體實(shí)施方式
可能改進(jìn)或變化，可以加入或省略一些要素，但仍不背離本發(fā)明。因此可以理解，在權(quán)利要求以及其同等物的范圍內(nèi)，本發(fā)明可以通過與具體說明不同的方式實(shí)現(xiàn)。
權(quán)利要求
1.用透明質(zhì)酸(HA)或藻酸(AA)或HA或AA的衍生物涂覆表面的方法，基本上由以下步驟組成i)用能夠在所述表面上生成含氮基團(tuán)的等離子處理產(chǎn)品的表面；和ii)在碳二亞胺和活性中間體酯穩(wěn)定化合物的存在下，使該產(chǎn)品的被處理表面暴露于含有透明質(zhì)酸或藻酸或其衍生物的溶液；獲得涂層表面。
2.權(quán)利要求1的方法，其中活性中間體酯穩(wěn)定化合物選自N-羥基琥珀酰亞胺，羥基磺基琥珀酰亞胺和羥基苯并三唑水合物。
3.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括使該涂層表面干燥的步驟。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述表面選自聚苯乙烯，聚乙烯，聚丙烯，聚對苯二甲酸乙二酯，聚四氟乙烯，聚交酯或纖維素。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述表面是聚苯乙烯。
6.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(ii)是在步驟(i)的60分鐘之內(nèi)進(jìn)行。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述等離子處理是NH3等離子處理。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述等離子處理是如下進(jìn)行將聚合物產(chǎn)品置于等離子室內(nèi)，將室排氣到20mTorr的基礎(chǔ)壓力，形成375mTorr NH3氣氛，然后進(jìn)行25秒等離子處理。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述HA的濃度為至少約0.05％w/v。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述HA的濃度為至少約0.5％w/v。
11.權(quán)利要求1的方法，其中碳二亞胺及酯穩(wěn)定化合物與HA重復(fù)單元的比率為至少1和0.5。
12.用HA或AA或HA或AA的衍生物涂覆等離子處理過的產(chǎn)品表面的方法，所述表面包含含氮基團(tuán)，該方法包括在碳二亞胺和活性中間體穩(wěn)定化合物的存在下，使所述等離子處理過的表面暴露于HA，AA或所述衍生物的溶液，獲得涂層表面。
13.用HA或AA或HA或AA的衍生物涂覆等離子處理過的產(chǎn)品表面的方法，所述表面包含含氮基團(tuán)，該方法基本上由以下步驟組成在碳二亞胺和活性中間體穩(wěn)定化合物的存在下，使所述等離子處理過的表面暴露于HA，AA或所述衍生物的溶液，獲得涂層表面。
14.權(quán)利要求12的方法，其中活性中間體酯穩(wěn)定化合物選自N-羥基琥珀酰亞胺，羥基磺基琥珀酰亞胺和羥基苯并三唑水合物。
15.權(quán)利要求12的方法，進(jìn)一步包括使該涂層表面干燥的步驟。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述表面選自聚苯乙烯，聚乙烯，聚丙烯，聚對苯二甲酸乙二酯，聚四氟乙烯，聚交酯和纖維素。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述表面是聚苯乙烯。
18.權(quán)利要求12的方法，其中所述等離子處理表面表面是NH3等離子處理的表面。
19.權(quán)利要求12的方法，其中所述不品是PrimariaTM處理的。
20.權(quán)利要求12的方法，其中所述等離子處理是如下進(jìn)行將聚合物產(chǎn)品置于等離子室內(nèi)，將室排氣到20mTorr的基礎(chǔ)壓力，形成375mTorr NH3氣氛，然后進(jìn)行25秒等離子處理。
21.權(quán)利要求12的方法，其中所述HA的濃度為至少約0.05％w/v。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述HA的濃度為至少約0.5％w/v。
20.權(quán)利要求12的方法，其中碳二亞胺及酯穩(wěn)定化合物與HA重復(fù)單元的比率為至少1和0.5。
21.由權(quán)利要求1的方法形成的表面。
22.由權(quán)利要求12的方法形成的表面。
23.具有權(quán)利要求21或22所述表面的產(chǎn)品。
24.權(quán)利要求23的產(chǎn)品，其包括聚合物。
25.權(quán)利要求24的產(chǎn)品，其選自培養(yǎng)皿，生物培養(yǎng)瓶或燒瓶，組織載玻片，多孔板，泡沫狀物，纖維篩，支架。
26.權(quán)利要求25的產(chǎn)品，其為具有多個(gè)孔的組織載玻片。
27由權(quán)利要求1的方法形成的有機(jī)溶劑抗性表面。
28.生產(chǎn)細(xì)胞粘附抗性(CAR)固相表面的方法，所述表面共價(jià)結(jié)合了至少第一配體結(jié)合多肽，該方法包括以下步驟(a)根據(jù)權(quán)利要求用HA，AA或衍生物涂覆聚合物表面；(b)氧化所述HA，AA或衍生物，產(chǎn)生胺反應(yīng)性基團(tuán)；和(c)將該氧化的HA，AA或衍生物暴露于第一配體結(jié)合多肽，其中在該多肽的氨基和胺反應(yīng)性基團(tuán)之間形成了共價(jià)鍵，導(dǎo)致多肽共價(jià)結(jié)合HA，AA或衍生物，從而產(chǎn)生了共價(jià)結(jié)合有第一配體結(jié)合多肽的CAR表面。
29.權(quán)利要求28的方法，其中(i)所述氧化步驟(b)是如下進(jìn)行提供一種能夠在HA，AA或衍生物上形成反應(yīng)性醛基的氧化劑，和(ii)步驟(c)還包括向所述多肽和表面提供一種進(jìn)行還原性胺化作用的還原劑，所述胺化作用使得所述多肽的氨基和反應(yīng)性醛基之間生成了所述共價(jià)鍵。
30.權(quán)利要求28的方法，其中步驟(b)還包括在步驟(c)之前或與其同時(shí)，通過暴露于碳二亞胺和活性中間體酯穩(wěn)定化合物使HA，AA或衍生物的羧基轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性酯。
31.權(quán)利要求30的方法，其中活性中間體酯穩(wěn)定化合物選自N-羥基琥珀酰亞胺，羥基磺基琥珀酰亞胺和羥基苯并三唑水合物。
32.權(quán)利要求28的方法，步驟(c)之后進(jìn)一步包括，(d)用第二配體結(jié)合多肽接觸所述共價(jià)結(jié)合的第一配體結(jié)合多肽，所述第二配體結(jié)合多肽是所述第一配體結(jié)合多肽的配體，該步驟是在使所述第二多肽非共價(jià)結(jié)合到所述第一多肽的條件下進(jìn)行。
33.權(quán)利要求29的方法，步驟(c)之后進(jìn)一步包括，(d)用第二配體結(jié)合多肽接觸所述共價(jià)結(jié)合的第一配體結(jié)合多肽，所述第二配體結(jié)合多肽是所述第一配體結(jié)合多肽的配體，該步驟是在使所述第二多肽非共價(jià)結(jié)合到所述第一多肽的條件下進(jìn)行。
34.權(quán)利要求30的方法，步驟(c)之后進(jìn)一步包括，(d)用第二配體結(jié)合多肽接觸所述共價(jià)結(jié)合的第一配體結(jié)合多肽，所述第二配體結(jié)合多肽是所述第一配體結(jié)合多肽的配體，該步驟是在使所述第二多肽非共價(jià)結(jié)合到所述第一多肽的條件下進(jìn)行。
35.權(quán)利要求28的方法，其中所述表面選自聚苯乙烯，聚乙烯，聚丙烯，聚對苯二甲酸乙二酯，聚四氟乙烯，聚交酯和纖維素。
36.權(quán)利要求29的方法，其中步驟(b)的所述氧化劑是高碘酸鹽。
38.權(quán)利要求28的方法，其中所述第一配體結(jié)合多肽是(a)抗體，(b)受體，(c)免疫球蛋白結(jié)合蛋白，(d)抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，(e)凝集素，(f)細(xì)胞粘附分子或(f)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)或(g)合成的肽。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述第一配體結(jié)合多肽是選自下述的免疫球蛋白結(jié)合蛋白天然或重組葡萄球菌蛋白A，天然或重組葡萄球菌蛋白G或重組蛋白質(zhì)A/G。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述第一配體結(jié)合多肽是(a)抗體或其抗原結(jié)合片段，(b)免疫球蛋白結(jié)合蛋白或(c)抗生物素蛋或鏈霉抗生物素蛋白。
41.權(quán)利要求32的方法，其中所述第二配體結(jié)合多肽是(a)抗體或其抗原結(jié)合片段，(b)受體，(c)凝集素，(d)細(xì)胞粘附分子或(e)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)或(f)合成的肽。
42.權(quán)利要求32的方法，其中(a)所述第一配體結(jié)合多肽是蛋白質(zhì)A，蛋白質(zhì)G，或重組蛋白質(zhì)A/G；以及(b)所述第二配體結(jié)合多肽是抗體或其抗原結(jié)合片段。
43.權(quán)利要求32的方法，其中(a)所述第一配體結(jié)合多肽是抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白；以及(b)所述第二配體結(jié)合多肽是生物素化抗體。
44.權(quán)利要求28的任一方法，其中所述第一配體結(jié)合多肽是抗CD34單克隆抗體。
45.權(quán)利要求40的方法，其中所述第一配體結(jié)合多肽是抗CD34單克隆抗體。
46.權(quán)利要求38的方法，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)多肽選自膠原，層粘連蛋白，纖連蛋白和血小板反應(yīng)蛋白1，玻連蛋白，彈性蛋白，腱生蛋白，聚集蛋白聚糖，集聚蛋白，骨唾液蛋白，軟骨基質(zhì)蛋白，血纖蛋白原，血纖蛋白，fibulin，粘蛋白，巢蛋白，骨橋蛋白，血纖蛋白溶酶原，restrictin，絲甘聚糖，SPARC/骨粘連蛋白，多能蛋白聚糖，von Willebrand因子，鈣粘蛋白，連接蛋白和選擇素。
47.權(quán)利要求41的方法，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)多肽選自膠原，層粘連蛋白，纖連蛋白和血小板反應(yīng)蛋白1，玻連蛋白，彈性蛋白，腱生蛋白，聚集蛋白聚糖，集聚蛋白，骨唾液蛋白，軟骨基質(zhì)蛋白質(zhì)，血纖蛋白原，纖維蛋白，fibulin，粘蛋白，巢蛋白，骨橋蛋白，血纖蛋白溶酶原，restrictin，絲甘聚糖，SPARC/骨粘連蛋白，多能蛋白聚糖，von Willebrand因子，鈣粘蛋白，連接蛋白和選擇素。
48.可用于結(jié)合靶細(xì)胞或靶分子的產(chǎn)品，所述靶細(xì)胞或分子包含靶配體，所述產(chǎn)品包括(a)用包含HA，AA或HA或AA衍生物的層涂覆的CAR表面；(b)將第一配體結(jié)合多肽共價(jià)結(jié)合到所述HA，AA或衍生物上，所述第一配體結(jié)合多肽能夠結(jié)合所述靶配體。
49.權(quán)利要求48的產(chǎn)品，其中所述第一配體結(jié)合多肽是(a)抗體，(b)受體，(c)免疫球蛋白結(jié)合蛋白，(d)抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，(e)凝集素，(f)細(xì)胞粘附分子，(f)細(xì)胞外基質(zhì)肽或多肽，或(g)合成的肽。
50.權(quán)利要求49的產(chǎn)品，其中所述第一配體結(jié)合多肽是選自下述的免疫球蛋白結(jié)合蛋白天然或重組葡萄球菌蛋白A，天然或重組葡萄球菌蛋白G或重組蛋白質(zhì)A/G。
51.權(quán)利要求48的產(chǎn)品，進(jìn)一步含有與所述共價(jià)結(jié)合的第一配體結(jié)合多肽結(jié)合的(c)第二配體結(jié)合多肽，該第二配體結(jié)合多肽(i)含有所述第一配體結(jié)合多肽的靶配體，以及(ii)能夠結(jié)合靶細(xì)胞或靶分子的靶配體。
52.權(quán)利要求51的產(chǎn)品，其中所述第二配體結(jié)合多肽是(a)抗體或其抗原結(jié)合片段，(b)免疫球蛋白結(jié)合蛋白(c)受體，(d)凝集素，(e)細(xì)胞粘附分子，(f)細(xì)胞外基質(zhì)肽或多肽，或(f)合成的肽。
53.權(quán)利要求52的產(chǎn)品，其中(a)所述第一配體結(jié)合多肽是葡萄球菌蛋白A，葡萄球菌蛋白G，或重組蛋白質(zhì)A/G；以及(b)所述第二配體結(jié)合多肽是抗體或其抗原結(jié)合片段。
54.權(quán)利要求52的產(chǎn)品，其中(a)所述第一配體結(jié)合多肽是抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白；以及(b)所述第二配體結(jié)合多肽是生物素化抗體。
55.權(quán)利要求48的產(chǎn)品，其中所述第一配體結(jié)合多肽是抗CD34單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物。
56.權(quán)利要求51的產(chǎn)品，其中所述第二配體結(jié)合多肽是抗CD34特異性的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物。
57.權(quán)利要求49的產(chǎn)品，其中所述細(xì)胞外基質(zhì)多肽選自膠原，層粘連蛋白，纖連蛋白和血小板反應(yīng)蛋白1，玻連蛋白，彈性蛋白，腱生蛋白，聚集蛋白聚糖，集聚蛋白，骨唾液蛋白，軟骨基質(zhì)蛋白質(zhì)，纖維蛋白原，纖維蛋白，fibulin，粘蛋白，巢蛋白，骨橋蛋白，血纖蛋白溶酶原，restrictin，絲甘聚糖，SPARC/骨粘連蛋白，多能蛋白聚糖，von Willebrand因子，鈣粘蛋白，連接蛋白和選擇素。
58.權(quán)利要求48的方法，其中所述表面選自聚苯乙烯，聚乙烯，聚丙烯，聚對苯二甲酸乙二酯，聚四氟乙烯，聚交酯和纖維素。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠抗細(xì)胞粘附的涂層表面，其含有直接與等離子體處理的聚合物表面結(jié)合的透明質(zhì)酸。公開了通過附著配體－結(jié)合多肽(抗體或抗體結(jié)合蛋白)進(jìn)一步修飾透明質(zhì)酸而生產(chǎn)該涂層表面的方法。
文檔編號C12N5/00GK1695405SQ03824808
公開日2005年11月9日 申請日期2003年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月30日
發(fā)明者A·里布曼-文森, R·P·克拉克, R·徐, M·A·黑達(dá)蘭 申請人:貝克頓·迪金森公司