專利名稱：食源性致病菌快速檢測基因芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基因芯片(或稱DNA微陣列)，尤其是一種食源性致病菌快速檢測基因芯片。
背景技術(shù)：
“民以食為天”。食品與人類的生存和健康密切相關(guān)。保證食品的安全衛(wèi)生、防止有毒有害物質(zhì)通過食品對人體造成危害是至關(guān)重要的。食品在生產(chǎn)、加工、貯存、運輸和銷售等各個環(huán)節(jié)都有可能受到環(huán)境中各種因素的影響和污染，微生物污染尤為常見。食品由于受致病菌的污染，造成各種食源性疾病，甚至死亡。為了判斷食品是否安全，預(yù)防和控制食源性傳染病的傳播以及快速診斷細菌性食物中毒，必須要有一種能夠快速、準確、及時、高效且能自動化的檢測致病菌的方法。
傳統(tǒng)的檢測方法存在以下兩方面的不足一是操作煩瑣、費時費力；二是在檢測結(jié)果上易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，不易進行質(zhì)量控制。隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，免疫熒光技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、生物傳感器技術(shù)、基因探針技術(shù)和PCR等技術(shù)已被用于致病菌的檢測。這些技術(shù)靈敏度較高、特異性強，在微生物檢測方面具有較好的應(yīng)用前景。然而，這些檢測技術(shù)一次實驗一般只能檢測一種微生物，而食品中存在的致病菌種類很多，所以尚不能滿足實際檢測工作的需要。
基因芯片技術(shù)是九十年代建立的一種全新的分析檢測技術(shù)，是隨著人類基因組計劃的開展而逐步發(fā)展起來的。該技術(shù)綜合運用了分子生物學(xué)技術(shù)、集成電路制造技術(shù)、計算機技術(shù)、半導(dǎo)體技術(shù)、共聚焦激光掃描技術(shù)、熒光標記技術(shù)，使樣品的檢測具有敏感性高、特異性強、大規(guī)模集成化、自動化、操作簡便、快速，高效率等優(yōu)點。目前，基因芯片技術(shù)主要應(yīng)用于基因表達相關(guān)研究和生物制藥研究等方面。利用基因芯片技術(shù)實現(xiàn)對多種常見致病菌的快速檢測鑒定還是一個嶄新的科研領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的內(nèi)容之一是提供一種用于快速檢測食源性致病菌的基因芯片，這種基因芯片克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，能夠快速、準確、高效地檢測和鑒定食品中致病菌的種類。
本發(fā)明的內(nèi)容之二是提供這種基因芯片的制備方法并提供26條用于檢測的寡核苷酸探針序列。
本發(fā)明的內(nèi)容之三是提供這種基因芯片在食源性致病菌快速檢測中的應(yīng)用。
具體實施例方式
本發(fā)明的內(nèi)容之一是這樣實現(xiàn)的通過生物信息學(xué)手段，設(shè)計一系列針對不同致病菌的檢測探針，將探針按照一定排布方式點樣在醛基化的顯微鏡載玻片表面或者其他固相載體表面，制備成基因芯片。待檢樣品通過PCR反應(yīng)標記上熒光，PCR產(chǎn)物不需要純化直接與基因芯片在適當(dāng)溫度下雜交1h以上，利用生物芯片掃描儀檢測熒光信號，根據(jù)熒光信號出現(xiàn)的位置即可判斷致病菌的種類。對于分離的未知菌落，整個檢測過程可以在3h之內(nèi)完成。這種基因芯片能夠檢測的細菌種類有金黃色葡萄球菌、志賀菌、沙門菌、大腸桿菌O157、變形桿菌、單核增生李氏菌、小腸結(jié)腸炎耶氏菌、銅綠假單胞菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、臘樣芽胞桿菌、乙型溶血性鏈球菌、椰酵假單胞菌、肉毒梭菌、空腸彎曲菌、河弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等。
本發(fā)明的內(nèi)容之二是這樣實現(xiàn)的利用Oligo 6.0等生物信息學(xué)軟件和GenBank等公共序列數(shù)據(jù)庫，設(shè)計和篩選用于檢測細菌16S rRNA基因變異的寡核苷酸探針，并且設(shè)計了檢測部分細菌致病基因的寡核苷酸探針。寡核苷酸合成時進行了3’端氨基化修飾或者5’端氨基化修飾。
基因芯片的載體選用顯微鏡載玻片。所用載玻片需要進行表面氨基化和醛基化處理。
利用自動點樣儀或者手動點樣儀完成全部點樣，制成基因芯片，芯片上點陣的排布方式根據(jù)需要設(shè)定。利用硼氫化鈉等封閉芯片上未與寡核苷酸結(jié)合的醛基。
基因芯片作為一種技術(shù)平臺，其作用是依賴芯片上所固定的探針來實現(xiàn)的。本發(fā)明基因芯片上固定的探針及其檢測作用如表1所示。
表1“食源性致病菌快速檢測基因芯片”上固定的探針及其檢測作用序號 序列(5′-3′) 檢測對象與用途1gtacaaggcccgggaacgtattcaccg 與所有真細菌雜交，用于檢測所有真細菌2gacataaggggcatgatgatttgacgtc與革蘭氏染色陽性細菌雜交，用于檢測革蘭氏陽性細菌3gtcgtaagggccatgatgacttgacgtc與革蘭氏染色陰性細菌雜交，用于檢測革蘭氏陰性細菌4gtcatgaatcacaaagtggtaagcgcc 與腸道細菌雜交，用于檢測腸道細菌5acgacgcactttatgaggtccgcttg 與大腸桿菌、沙門菌、志賀菌雜交，用于檢測這三屬細菌6gctcctaaaaggttactccaccggctt 用于檢測金黃色葡萄球菌的探針7cgacggctagctccaaatggttact 用于血漿凝固酶陰性葡萄球菌探針8cggctagctccaaaaggttactcta 用于血漿凝固酶陰性葡萄球菌探針9tcacggtcttgcgtcttattgtacctac用于檢測肉毒梭狀芽孢桿菌的探針10 tagataatcggcttcgggcgtctccaac用于檢測艱難梭菌的探針11 gaactgagactggtttttaagtttggct用于檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌的探針12 ccctagagcataaggggcatgatgattt用于檢測破傷風(fēng)梭菌的探針13 tcacggtcttgcgtcttattgtacctac檢測志賀菌virA基因的探針14 tagataatcggcttcgggcgtctccaac檢測沙門菌invA基因的探針15 cgaactgggacatattttatagatttgc用于檢測空腸彎曲菌的探針16 ggtcgccccttcgccgccctctgtatca用于檢測椰酵假單胞菌的探針17 cgatccaccctgagaccggcttttaagg用于檢測臘樣芽胞桿菌的探針18 tactcgtaagggccatgatacgacttaa用于檢測普通變形桿菌的探針19 cgcggcttggcaaccctttgtaccgacc用于檢測銅綠假胞菌的探針20 actgagaatagttttatgggattag 用于檢測單核增生李斯特氏菌的探針21 gctccaccttcgcggtattcgctgccct用于檢測霍亂弧菌的探針22 tcactttcgcaagttggccgccctctgt用于檢測河弧菌的探針23 tggtaagcgtccccccgtagttgaaac 用于檢測副溶血性弧菌的探針24 tacgacagactttatgtggtccgcttgc用于檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的探針25 agattggctttaagagattagcttgccg用于檢測乙型溶血性鏈球菌的探針26 atccccaccttcctccagtt作為實驗陽性對照的探針本發(fā)明的內(nèi)容之三是這樣實現(xiàn)的這種基因芯片可以用于食品中常見致病菌的快速檢測鑒定、引起食物中毒致病菌檢測鑒定、食品安全性評價等方面。檢測時，將待檢細菌進行PCR擴增，擴增用引物的序列如表2所示。為了對PCR產(chǎn)物進行熒光標記，一種做法是將引物1169U20進行熒光標記，另一種做法是利用帶有熒光標記的堿基如Cy3-dCTP或Cy5-dUTP等按一定比例摻入PCR反應(yīng)體系，這兩種熒光方法的標記效果是近似的。
表2引物序列引物名稱 序列(5′-3′)1169U20AACTGGAGGAAGGTGGGGAT1521L19AGGAGGTGATCCAACCGCAPCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過變性與雜交液混合，加至基因芯片探針陣列之上，并保持在45℃-60℃雜交1h以上。配制洗滌液，待雜交完畢，按照離子強度由高到低的順序?qū)蛐酒M行洗滌。用生物芯片專用掃描儀讀取芯片上的熒光信號，并利用相應(yīng)的生物芯片數(shù)據(jù)分析軟件分析得到的掃描結(jié)果，判定樣品細菌的種類，達到對致病菌檢測鑒定的目的。
由上述公開的技術(shù)方案可見，這種基因芯片可以對多種致病菌進行檢測，大大縮短了檢測時間、提高了檢測的準確性又降低了成本，將會具有深遠的意義。
實施例為進一步說明食源性致病菌快速檢測基因芯片及其用途，參照下列實施例進行說明，這些實施例是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明。
實施例一食源性致病菌快速檢測基因芯片的制備1.1載體玻璃片的表面醛基化處理顯微鏡載玻片用鉻酸洗液浸泡過夜，以去除表面有機物等雜質(zhì)，然后用蒸餾水清洗，并浸入25％氨水中過夜。之后，將載玻片浸入含氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇(pH至4.5)中20min，用95％乙醇超聲清洗30min，純水超聲清洗20min，115℃烘干45min。最后將載玻片浸泡在5％的戊二醛溶液中浸泡50min，接著超聲清洗10min，水洗2次，置于干燥隔塵處備用。
1.2利用自動點樣儀在載玻片上點涂探針陣列生物芯片點樣儀(Cartesian Technologies)的機械手的型號為AxSys 5000，使用的控制軟件為PixSys 5500Workstation。使用一支羽毛筆式點樣針頭完成全部點樣。點之間間距為0.5mm。陣列中探針(序號)的排布如表3所示在點樣儀的移動臺上放置好經(jīng)過表面處理的醛基載玻片。
取每個探針溶液4μl，依次加入一嶄新的96孔板的相應(yīng)孔中。然后向每孔加入4μl 6×SSC，反復(fù)吹打混勻。將96孔板安放在點樣儀的樣品臺上。啟動PixSys 5500 Workstation，設(shè)置好各個參數(shù)，開始點樣。機器手控制針頭，每點一個樣品要經(jīng)過上樣、清洗、干燥幾個過程。
點樣完畢后，芯片在室溫下自然干燥24h，含有點陣的區(qū)域用鉛筆在背面標記。點好的芯片放在清潔的玻片盒中，在陰涼干燥處保存。
表3陣列中探針的排布12 3 4 5 6

ABCDE1.3封閉為了封閉玻片上未與寡核苷酸結(jié)合的醛基，祛除鹽類和未結(jié)合的寡核苷酸，按照以下程序?qū)ΣＦM行處理0.2％SDS(25℃)洗2次，每次5min；純水(25℃)洗2次，每次5min；純水(95℃)洗1次，洗2min，涼至室溫；迅速將玻片放入封閉液洗5min；(使用的封閉液的配方是將1.3g NaHB4溶在375ml PBS溶液中，再向溶液加入125ml無水乙醇，立即使用。)0.2％SDS(25℃)洗3次，每次1min；純水(25℃)洗2次，每次1min；玻片自然干燥，盡快使用。
實施例二本發(fā)明檢測未知細菌的應(yīng)用舉例2.1挑取一環(huán)生長在培養(yǎng)基上的菌落，研磨混勻于100μl純水中，，煮沸10min，10000rpm離心1min，吸取上清2μl加入PCR反應(yīng)混合液中。PCR反應(yīng)混合液配方如表4。
表4PCR反應(yīng)混合液配方成份 濃度 加樣量(μl)ddH20 - 37.310×PCR Buffer(Mg2+Plus)10× 5.0dNTP Mixture 2.5mmol/L 4.01169U20(Cy3標記) 5μmol/L 1.01521L19 5μmol/L 0.5TaKaRa Taq(5U/ml)5U/μl 0.2
2.2將反應(yīng)管放入PCR儀(PE 2400)中，設(shè)定循環(huán)參數(shù)循環(huán)參數(shù)94℃，5min；94℃，25sec；55℃，25sec；72℃，25sec；，共40個循環(huán)；72℃，5min；100℃，5min；4℃，5min。
PCR反應(yīng)結(jié)束立即取出反應(yīng)管進行下一步雜交反應(yīng)。
2.3取擴增產(chǎn)物(4℃)1μl與4μl雜交液(Telechem公司)混合，點在“食源性致病菌快速檢測基因芯片”(制備方案見實施例一)探針陣列區(qū)域，小心地蓋上蓋玻片膜，注意蓋玻片與載玻片之間不可留有氣泡。放入雜交盒，向盒內(nèi)加入10ml 3×SSC以保持濕度。擰緊雜交盒的螺絲，放入55℃水浴鍋內(nèi)雜交1h。取出雜交盒，拿出玻片，立即投入洗滌液A(55℃)洗60sec，再投入洗滌液B(25℃)洗60sec，洗滌液C(25℃)洗60sec。去除殘留的液體并在空氣中干燥。
洗滌液的配方是洗滌液A1×SSC(0.2％SDS)洗滌液B0.1×SSC 0.2％SDS)洗滌液C0.1×SSC2.4雜交結(jié)果掃讀分析用ScanArray 3000生物芯片掃描儀掃讀基因芯片，選用綠色激光，設(shè)定激光強度為80％，光電倍增管增益值為80％，掃描分辨率為10μm。掃描結(jié)果存為TIFF格式的文件。啟動Imagene4.0軟件對結(jié)果進行分析。
根據(jù)熒光信號出現(xiàn)的位置和強度即可判別樣品菌的種類。
權(quán)利要求
1.一種食源性致病菌的快速檢測基因芯片，這種基因芯片由載體和固定在載體表面的多條寡核苷酸探針構(gòu)成。其特征在于載體表面的多條寡核苷酸探針按照一定方式排布，通過與待檢樣品的雜交反應(yīng)，可以檢測鑒定樣品細菌的種類。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，寡核苷酸探針固定在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等固相載體上，形成n×n的陣列，每一陣列具有陽性對照探針?？梢杂卸鄠€這樣的陣列分布于同一個固相載體上。將探針涂布到固相載體的途徑是機械手打印、噴印或者手工點樣，這樣制備好的探針陣列就是基因芯片(或稱DNA微陣列)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，寡核苷酸探針的設(shè)計以細菌的16S rRNA基因為依據(jù)，旨在檢測不同細菌16S rRNA基因序列上的變異，從而區(qū)分細菌的種屬。探針根據(jù)功能分為五類A.所有真細菌共有探針；B.區(qū)分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的探針；C.科特異性探針；D.屬/種特異性探針E.陽性對照探針和陰性對照探針為了對近源細菌更好地區(qū)分，本發(fā)明同時提供了針對部分細菌致病基因的檢測探針。包括檢測志賀菌virA基因的探針、針對沙門菌invA基因的探針等。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，探針的序列設(shè)計在16s rRNA基因的可變區(qū)，長度為20-29個堿基不等。每條探針的堿基序列可以與16s rRNA基因上特定區(qū)域DNA正鏈的堿基序列一致，也可以與16s rRNA基因上這一特定區(qū)域DNA負鏈的堿基序列一致。同一次雜交反應(yīng)中使用的所有探針上述一致性相同。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，以每條探針的堿基序列與16s rRNA基因上特定區(qū)域DNA負鏈的堿基序列一致為準，本發(fā)明的整套探針的序列(5′-3′)及其可以達到的檢測功能是1 gtacaaggcccgggaacgtattcaccg 與所有真細菌雜交，用于檢測所有真細菌2 gacataaggggcatgatgatttgacgtc與革蘭氏染色陽性細菌雜交，用于檢測革蘭氏陽性細菌3 gtcgtaagggccatgatgacttgacgtc與革蘭氏染色陰性細菌雜交，用于檢測革蘭氏陰性細菌4 gtcatgaatcacaaagtggtaagcgcc 與腸道細菌雜交，用于檢測腸道細菌5 acgacgcactttatgaggtccgcttg 與大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌雜交，用于檢測這三屬細菌6 gctcctaaaaggttactccaccggctt 用于檢測金黃色葡萄球菌的探針7 cgacggctagctccaaatggttact 用于血漿凝固酶陰性葡萄球菌探針8 cggctagctccaaaaggttactcta 用于血漿凝固酶陰性葡萄球菌探針9 tcacggtcttgcgtcttattgtacctac用于檢測肉毒梭狀芽孢桿菌的探針10 tagataatcggcttcgggcgtctccaac用于檢測艱難梭菌的探針11 gaactgagactggtttttaagtttggct用于檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌的探針12 ccctagagcataaggggcatgatgattt用于檢測破傷風(fēng)梭菌的探針13 tcacggtcttgcgtcttattgtacctac檢測志賀菌virA基因的探針14 tagataatcggcttcgggcgtctccaac檢測沙門菌invA基因的探針15 cgaactgggacatattttatagatttgc用于檢測空腸彎曲菌的探針16 ggtcgccccttcgccgccctctgtatca用于檢測椰酵假單胞菌的探針17 cgatccaccctgagaccggcttttaagg用于檢測臘樣芽胞桿菌的探針18 tactcgtaagggccatgatacgacttaa用于檢測普通變形桿菌的探針19 cgcggcttggcaaccctttgtaccgacc用于檢測銅綠假胞菌的探針20 actgagaatagttttatgggattag 用于檢測單核增生李斯特氏菌的探針21 gctccaccttcgcggtattcgctgccct用于檢測霍亂弧菌的探針22 tcactttcgcaagttggccgccctctgt用于檢測河弧菌的探針23 tggtaagcgtccccccgtagttgaaac 用于檢測副溶血性弧菌的探針24 tacgacagactttatgtggtccgcttgc用于檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的探針25 agattggctttaagagattagcttgccg用于檢測乙型溶血性鏈球菌的探針26 atccccaccttcctccagtt作為實驗陽性對照的探針
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，探針為寡核苷酸探針，探針的3’端或者5’端經(jīng)過了氨基化修飾。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，利用兩條通用引物擴增幾乎所有細菌的16S rRNA基因約370bp長的片段(針對不同細菌，產(chǎn)物片段長度有所不同)，作為下一步基因芯片檢測的靶序列。兩條引物的序列(5′-3′)如下1169U20AACTGGAGGAAGGTGGGGAT1521L19AGGAGGTGATCCAACCGCA其中一條引物經(jīng)過5’端熒光素標記。利用上述的引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物不需要純化，在一定的雜交反應(yīng)條件下與基因芯片共保溫20min至數(shù)小時，利用熒光掃描儀即可檢測到熒光信號。根據(jù)信號出現(xiàn)的位置可以判斷出細菌的種類。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，這種基因芯片能夠準確檢出金黃色葡萄球菌、志賀菌、沙門菌、大腸桿菌O157、變形桿菌、單核增生李氏菌、小腸結(jié)腸炎耶氏菌、銅綠假單胞菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、臘樣芽胞桿菌、乙型溶血性鏈球菌、椰酵假單胞菌、肉毒梭菌、空腸彎曲菌、河弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，利用上述的整套探針或其中一部分，可以通過雜交反應(yīng)對實驗樣品中的相應(yīng)細菌進行檢測。具有較高的靈敏度和特異度，尤其適用于基于基因芯片原理的檢測。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于，這種基因芯片克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，能夠快速、準確、高效地檢測和鑒定食品中致病菌的種類。可以用于食品的監(jiān)督與檢測、食物中毒病源菌檢測、細菌學(xué)分類與流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于快速檢測食源性致病菌的基因芯片，公開了這種基因芯片的制備方法并提供26條用于檢測的寡核苷酸探針序列。這種基因芯片克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，能夠快速、準確、高效地檢測、鑒定食品中致病菌的種類。檢測范圍包括金黃色葡萄球菌、志賀菌、沙門菌、大腸桿菌O157、變形桿菌、單核增生李氏菌、小腸結(jié)腸炎耶氏菌、銅綠假單胞菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、臘樣芽胞桿菌、乙型溶血性鏈球菌、椰酵假單胞菌、肉毒梭菌、空腸彎曲菌、河弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等。本發(fā)明可以用于食品的監(jiān)督與檢測、食物中毒病源菌檢測、細菌學(xué)分類與流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域，具有深遠的社會效益與較大的經(jīng)濟效益。
文檔編號C12Q1/68GK1536090SQ03109149
公開日2004年10月13日 申請日期2003年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月7日
發(fā)明者李君文, 靳連群, 王新為, 晁福寰, 王升啟 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)