一種食源性致病菌分子生物學(xué)檢測(cè)試劑盒的評(píng)價(jià)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)檢測(cè)試劑盒的評(píng)價(jià)技術(shù)，尤其涉及食源性致病菌分子生物學(xué)檢測(cè)試劑盒質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。所述評(píng)價(jià)方法是基于核苷酸為檢測(cè)對(duì)象的試劑盒定性方法的確認(rèn)，應(yīng)驗(yàn)證以下參數(shù)：包容性和排他性、相對(duì)靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度、檢出限、耐變性和批間變異本發(fā)明的食源性致病菌分子生物學(xué)試劑盒的評(píng)價(jià)方法，可以更加客觀準(zhǔn)確地對(duì)此類試劑盒進(jìn)行必要的技術(shù)評(píng)價(jià)，以保證市場(chǎng)上流通的試劑盒性能指標(biāo)滿足相關(guān)要求。
【專利說(shuō)明】一種食源性致病菌分子生物學(xué)檢測(cè)試劑盒的評(píng)價(jià)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)檢測(cè)試劑盒的評(píng)價(jià)技術(shù)，尤其涉及食源性致病菌分子生物學(xué)檢測(cè)試劑盒質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]試劑盒在分析檢測(cè)工作中主要是作為一種快速篩查的方法而存在，開(kāi)始時(shí)是以傳統(tǒng)經(jīng)典方法的替代方法出現(xiàn)的，幾乎所有的試劑盒方法在發(fā)現(xiàn)問(wèn)題時(shí)都需要以傳統(tǒng)的檢測(cè)方法作為最終確認(rèn)的依據(jù)，因此，人們大多認(rèn)同試劑盒方法的一些方法學(xué)上的不穩(wěn)定性，比如假陽(yáng)性率、假陰性率、定量精密度較差等等，并接受了這種可能的結(jié)果錯(cuò)誤。而恰恰是這種認(rèn)同使得人們忽視了對(duì)試劑盒方法進(jìn)行更為科學(xué)深入的方法學(xué)性能指標(biāo)探討，而這種忽視在一些敏感領(lǐng)域的分析中是十分危險(xiǎn)的。
[0003]試劑盒因操作方便，結(jié)果可快速獲得，呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)。但試劑盒的生產(chǎn)、銷售及認(rèn)證認(rèn)可體制尚不完善，我國(guó)還沒(méi)有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)或質(zhì)量評(píng)價(jià)政策，以及對(duì)試劑盒技術(shù)參數(shù)進(jìn)行評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)方法。一方面是試劑盒的發(fā)展向好，另一方面存在的問(wèn)題也愈來(lái)愈突出。正是基于目前試劑盒產(chǎn)品的現(xiàn)狀，需要對(duì)試劑盒進(jìn)行規(guī)范管理，以保證市場(chǎng)上流通的試劑盒性能指標(biāo)滿足相關(guān)要求。食品領(lǐng)域是當(dāng)前問(wèn)題最多、最受關(guān)注的領(lǐng)域，這個(gè)領(lǐng)域的檢測(cè)包括了物理、化學(xué)、微生物及分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論，無(wú)論是按檢測(cè)原理、用途還是其它分類方式，涉及食品安全檢測(cè)項(xiàng)目的試劑盒的品種是最全最多的。因此，從該領(lǐng)域著手從事評(píng)價(jià)方法的研究，便于獲得基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)結(jié)果，并由此推廣至動(dòng)植物檢疫及其它領(lǐng)域是十分必要也是很有意義的。
[0004]隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其在生物檢測(cè)領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)臨床檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用也日益推廣普及，已成為生物、醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域不可或缺的檢測(cè)技術(shù)。近年來(lái)相關(guān)隨著相關(guān)分析設(shè)備的日益自動(dòng)化、智能化，使用到的試劑材料也更多地以配套試劑盒產(chǎn)品的形式出現(xiàn)。國(guó)內(nèi)外研發(fā)產(chǎn)品的速度日益加快，品種也不斷擴(kuò)大。從國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上調(diào)研的產(chǎn)品情況，目前已商品化的食品分子生物學(xué)檢測(cè)試劑盒主要應(yīng)用于食源性致病菌如沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌等，食品中病毒如諾如病毒，轉(zhuǎn)基因成分、過(guò)敏原、物種成分鑒定等方面。可按不同原理分主要有5類產(chǎn)品:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)試劑盒(PCR試劑盒)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑盒，基因芯片雜交檢測(cè)試劑盒，基因探針檢測(cè)試劑盒，恒溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒(LAMP試劑盒)
坐寸ο
[0005]國(guó)外自20世紀(jì)80年代末起就開(kāi)始了對(duì)試劑盒的評(píng)價(jià)工作，取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，獲得了良好的效果。但出于種種原因，幾乎現(xiàn)所有的評(píng)價(jià)體系都存在一些缺陷。最為關(guān)鍵的就是由于試劑盒品種繁多，事實(shí)上“試劑盒”這個(gè)術(shù)語(yǔ)至今沒(méi)有規(guī)范的定義，在市場(chǎng)上銷售的稱之為“試劑盒”的產(chǎn)品各式各樣，而不同的試劑盒檢測(cè)原理差異懸殊，使得在構(gòu)建評(píng)價(jià)體系的技術(shù)法規(guī)時(shí)存在相當(dāng)大的技術(shù)難度，迄今為止，國(guó)內(nèi)尚未開(kāi)展對(duì)試劑盒的管理規(guī)范工作，而國(guó)外官方僅采用直接注冊(cè)進(jìn)行管理，國(guó)際上最為成功的評(píng)定機(jī)構(gòu)之一 AFNOR僅對(duì)微生物檢測(cè)用試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià)，依據(jù)是IS016140《食品和動(dòng)物飼料的微生物學(xué)替代檢測(cè)方法驗(yàn)證準(zhǔn)則》，而另一影響廣泛的機(jī)構(gòu)AOAC更多地依靠技術(shù)專家的力量，以專家小組來(lái)決定需要驗(yàn)證的技術(shù)指標(biāo)。
[0006]正是基于目前分子生物學(xué)檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品的現(xiàn)狀，以及目前國(guó)內(nèi)外對(duì)可供借鑒的成熟的評(píng)價(jià)制度方案不多，而試劑盒本身的性質(zhì)也使其不能直接照搬其他產(chǎn)品的評(píng)價(jià)方案和技術(shù)，因此建立針對(duì)食源性致病菌的分子生物學(xué)試劑盒評(píng)價(jià)方法，可以更加客觀準(zhǔn)確地對(duì)此類試劑盒進(jìn)行必要的技術(shù)評(píng)價(jià)，以保證市場(chǎng)上流通的試劑盒性能指標(biāo)滿足相關(guān)要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種食源性致病菌分子生物學(xué)檢測(cè)試劑盒質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。
[0008]本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下:
一種食源性致病菌分子生物學(xué)檢測(cè)試劑盒質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，是基于核苷酸為檢測(cè)對(duì)象的試劑盒定性方法的確認(rèn)，應(yīng)驗(yàn)證以下參數(shù):包容性和排他性、相對(duì)靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度、檢出限、耐變性和批間變異。
[0009]具體驗(yàn)證程序如下:
(1)包容性和排他性
對(duì)試劑盒方法的包容性和排他性測(cè)試時(shí)，沙門氏菌需要測(cè)試包括參考菌株和分離菌株在內(nèi)的100株目標(biāo)菌株和50株非目標(biāo)菌株；其他致病性細(xì)菌測(cè)試包括參考菌株和分離菌株在內(nèi)的30株目標(biāo)菌株和20株非目標(biāo)菌株；
(2)相對(duì)靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度
A、樣品種類要求
選擇5個(gè)食品種類，15個(gè)食品類型的樣品；
B、樣品制備要求
1)人工污染樣品制備方法
a.污染水平
每種食品基體需要有3個(gè)污染水平樣品，標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)試組分為25g，其中一個(gè)未污染、一個(gè)樣品的污染水平為POD值在0.25~0.75、一個(gè)樣品的POD值為1.00，其中POD值為0.25~0.75的目標(biāo)菌濃度為0.2~2cfu/25g、P0D值為I的目標(biāo)菌濃度為4~6cfu/25g ；必要時(shí)調(diào)整水平使部分檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性；
b.競(jìng)爭(zhēng)菌群
至少I種食品必須采用競(jìng)爭(zhēng)菌群進(jìn)行檢測(cè)；如果采用人工污染的方式，競(jìng)爭(zhēng)菌株濃度必須比目標(biāo)菌至少高10倍；
c.污染方式
液體樣品:在大體積的樣品中加入稀釋的目標(biāo)菌，混勻；
干樣:在樣品中加入凍干菌，混勻；
固體/濕潤(rùn)的樣品:滴加稀釋的目標(biāo)菌，均質(zhì)、噴霧；
要求進(jìn)行大體積接種；在采用準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基接種時(shí)應(yīng)保證樣品基體不發(fā)生變化；小心操作以免樣品基體被接種體稀釋；
2)自然污染樣品要求
2個(gè)不同批，每批20次平行檢測(cè)；至少I批要求有部分回收率數(shù)據(jù)；對(duì)于每份基體的每個(gè)水平，均需分別采用LAMP方法與參考方法進(jìn)行測(cè)試。
[0010]3)樣品測(cè)試數(shù)量
選擇人工污染樣品或自然污染樣品共計(jì)15種食品基質(zhì)樣品，對(duì)于低和高的污染水平，分別進(jìn)行20次平行測(cè)試，未接種的樣品進(jìn)行5次平行測(cè)試，同時(shí)用參考方法進(jìn)行驗(yàn)證，以檢測(cè)方法的重復(fù)性；
(3)檢出限
計(jì)算每種食品基體分別采用試劑盒方法與參考方法的POD值。
[0011]POD值為檢出陽(yáng)性結(jié)果占所有檢測(cè)結(jié)果的比率，包括PODk-參考方法的POD值、PODc-采用試劑盒方法檢測(cè)的POD值；
POD= I，其中X為檢出陽(yáng)性結(jié)果次數(shù)，N為測(cè)定總次數(shù)；
N
POD值>0.5時(shí)，25g基質(zhì)中的菌含量即為方法的檢出限；
(4)耐變性
A、試驗(yàn)菌株和測(cè)試數(shù)量
采用純培養(yǎng)的I株目標(biāo)菌與I株非目標(biāo)菌進(jìn)行耐變性實(shí)驗(yàn)，目標(biāo)菌的濃度在POD值為0.25~0.75的水平。每種測(cè)試條件10次平行。目標(biāo)菌采用檢測(cè)方法所要求的培養(yǎng)基；非目標(biāo)菌采用非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；采用試劑盒方法進(jìn)行分析。報(bào)出每種條件下檢測(cè)的POD 值。
[0012]B、耐變因素選擇
確定需要評(píng)價(jià)的變量2個(gè):反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，每個(gè)變量取兩個(gè)不同的水平。
[0013]C、結(jié)果判斷
如果當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件改變，POD值〈0.9，表明該條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果有重要影響。
[0014](5)批間變異
采用純培養(yǎng)的I株目標(biāo)菌與I株非目標(biāo)菌進(jìn)行批間變異實(shí)驗(yàn)，目標(biāo)菌的濃度在POD值為0.25~0.75的水平。目標(biāo)菌采用檢測(cè)方法所要求的培養(yǎng)基；非目標(biāo)菌采用非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；采用試劑盒方法進(jìn)行分析，取3個(gè)不同批號(hào)的試劑盒產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，每種測(cè)試條件10次平行，報(bào)出每種條件下檢測(cè)的POD值；
如果不同批次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的POD值出現(xiàn)〈±0.1的偏差，表明試劑盒產(chǎn)品批次間差異不顯著，POD值偏差>±0.2，表明試劑盒產(chǎn)品批次間差異顯著。
[0015](6)協(xié)同驗(yàn)證
選擇I種食品，添加目標(biāo)菌，制備未接種、低、高三個(gè)接種水平樣品，每一水平8個(gè)平行樣品。同時(shí)用試劑盒方法和參考方法進(jìn)行測(cè)試，至少8家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)同實(shí)驗(yàn)。
[0016]本發(fā)明的食源性致病菌分子生物學(xué)試劑盒的評(píng)價(jià)方法，可以更加客觀準(zhǔn)確地對(duì)此類試劑盒進(jìn)行必要的技術(shù)評(píng)價(jià)，以保證市場(chǎng)上流通的試劑盒性能指標(biāo)滿足相關(guān)要求。

【具體實(shí)施方式】
[0017]I 范圍
本方法適用于以細(xì)菌核苷酸(DNA)為檢測(cè)對(duì)象的試劑盒定性方法的確認(rèn)(也稱驗(yàn)證)。(定性方法是指用直接或間接的方法檢測(cè)被分析物是否存在的分析方法。)2試劑盒方法驗(yàn)證要素
基于核苷酸為檢測(cè)對(duì)象的目標(biāo)細(xì)菌的試劑盒評(píng)價(jià)方法為篩選方法。應(yīng)驗(yàn)證以下參數(shù):包容性和排他性、相對(duì)靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度、檢出限、耐變性和批間變異。
[0018]3室內(nèi)驗(yàn)證程序
3.1包容性和排他性
對(duì)試劑盒方法的包容性和排他性測(cè)試時(shí)，沙門氏菌至少需要測(cè)試包括參考菌株和分離菌株在內(nèi)的100株目標(biāo)菌株和50株非目標(biāo)菌株；其他致病性細(xì)菌測(cè)試包括參考菌株和分離菌株在內(nèi)的30株目標(biāo)菌株和20株非目標(biāo)菌株。
[0019]3.2相對(duì)靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度
3.2.1樣品種類要求
選擇5個(gè)食品種類，15個(gè)食品類型的樣品。(參考食品種類表)
3.2.2樣品制備要求
(I)人工污染樣品制備方法 A.污染水平
每種食品基體需要有3個(gè)污染水平樣品(標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)試組分為25g)，其中一個(gè)未污染(L。)、一個(gè)樣品的污染水平為POD (檢出概率)值在0.25~0.75(^)、一個(gè)樣品的POD值為L(zhǎng)OO(L2)0其中POD值為0.25~0.75的目標(biāo)菌濃度大約為0.2~2cfu/25g、P0D值為I的目標(biāo)菌濃度大約為5cfu/25g ;必要時(shí)調(diào)整水平使部分檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。
[0020]競(jìng)爭(zhēng)菌群
至少I種食品必須采用競(jìng)爭(zhēng)菌群進(jìn)行檢測(cè)(自然的或人工污染樣品)；如果采用人工污染的方式，競(jìng)爭(zhēng)菌株濃度必須比目標(biāo)菌至少高10倍。
[0021]注:結(jié)合在上述I種食品基質(zhì)實(shí)驗(yàn)中。
[0022]污染方式
液體樣品:在大體積的樣品中加入稀釋的目標(biāo)菌，混勻；
干樣:在樣品中加入凍干菌，混勻。
[0023]固體/濕潤(rùn)的樣品:滴加稀釋的目標(biāo)菌，采用合適方法均質(zhì)；噴霧。
[0024]要求進(jìn)行大體積接種；在采用準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基接種時(shí)應(yīng)保證樣品基體不發(fā)生變化；小心操作以免樣品基體被接種體稀釋。
[0025](2)自然污染樣品要求
2個(gè)不同批，每批20次平行檢測(cè)；至少I批要求有部分回收率數(shù)據(jù)?？梢酝ㄟ^(guò)長(zhǎng)時(shí)間放置或采用未被污染的產(chǎn)品稀釋等方式，獲得所希望的合適濃度水平。
[0026]對(duì)于每份基體的每個(gè)水平，均需分別采用LAMP方法與參考方法進(jìn)行測(cè)試。
[0027]3.2.3樣品測(cè)試數(shù)量
選擇人工污染樣品或自然污染樣品共計(jì)15種食品基質(zhì)樣品，當(dāng)采用人工污染樣品時(shí)，按3.2.2 (I)條要求，當(dāng)采用自然污染樣品時(shí)，按3.2.2 (2)條要求。
[0028]對(duì)于低和高的污染水平，分別進(jìn)行20次平行測(cè)試，未接種的樣品進(jìn)行5次平行測(cè)試。同時(shí)用參考方法進(jìn)行驗(yàn)證，以檢測(cè)方法的重復(fù)性。

【權(quán)利要求】
1.一種食源性致病菌分子生物學(xué)檢測(cè)試劑盒質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，其特征在于:所述評(píng)價(jià)方法是基于核苷酸為檢測(cè)對(duì)象的試劑盒定性方法的確認(rèn)，應(yīng)驗(yàn)證以下參數(shù):包容性和排他性、相對(duì)靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度、檢出限、耐變性和批間變異； 具體驗(yàn)證程序如下: (1)包容性和排他性 對(duì)試劑盒方法的包容性和排他性測(cè)試時(shí)，沙門氏菌需要測(cè)試包括參考菌株和分離菌株在內(nèi)的100株目標(biāo)菌株和50株非目標(biāo)菌株；其他致病性細(xì)菌測(cè)試包括參考菌株和分離菌株在內(nèi)的30株目標(biāo)菌株和20株非目標(biāo)菌株； (2)相對(duì)靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度 A、樣品種類要求 選擇5 個(gè)食品種類，15個(gè)食品類型的樣品； B、樣品制備要求 . 1)人工污染樣品制備方法 a.污染水平 每種食品基體需要有3個(gè)污染水平樣品，標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)試組分為25g，其中一個(gè)未污染、一個(gè)樣品的污染水平為POD值在0.25~0.75、一個(gè)樣品的POD值為1.00，其中POD值為.0.25~0.75的目標(biāo)菌濃度為0.2~2cfu/25g、P0D值為I的目標(biāo)菌濃度為4~6cfu/25g ；必要時(shí)調(diào)整水平使部分檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性； b.競(jìng)爭(zhēng)菌群 至少I種食品必須采用競(jìng)爭(zhēng)菌群進(jìn)行檢測(cè)；如果采用人工污染的方式，競(jìng)爭(zhēng)菌株濃度必須比目標(biāo)菌至少高10倍； c.污染方式 液體樣品:在大體積的樣品中加入稀釋的目標(biāo)菌，混勻； 干樣:在樣品中加入凍干菌，混勻； 固體/濕潤(rùn)的樣品:滴加稀釋的目標(biāo)菌，均質(zhì)、噴霧； 要求進(jìn)行大體積接種；在采用準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基接種時(shí)應(yīng)保證樣品基體不發(fā)生變化；小心操作以免樣品基體被接種體稀釋； .2)自然污染樣品要求 . 2個(gè)不同批，每批20次平行檢測(cè)；至少I批要求有部分回收率數(shù)據(jù)； 對(duì)于每份基體的每個(gè)水平，均需分別采用LAMP方法與參考方法進(jìn)行測(cè)試； . 3)樣品測(cè)試數(shù)量 選擇人工污染樣品或自然污染樣品共計(jì)15種食品基質(zhì)樣品，對(duì)于低和高的污染水平，分別進(jìn)行20次平行測(cè)試，未接種的樣品進(jìn)行5次平行測(cè)試，同時(shí)用參考方法進(jìn)行驗(yàn)證，以檢測(cè)方法的重復(fù)性； (3)檢出限 計(jì)算每種食品基體分別采用試劑盒方法與參考方法的POD值； POD值為檢出陽(yáng)性結(jié)果占所有檢測(cè)結(jié)果的比率，包括PODk-參考方法的POD值、P0D。-采用試劑盒方法檢測(cè)的POD值；POD= X/n，其中X為檢出陽(yáng)性結(jié)果次數(shù)，N為測(cè)定總次數(shù)； POD值>0.5時(shí)，25g基質(zhì)中的菌含量即為方法的檢出限； (4)耐變性 A、試驗(yàn)菌株和測(cè)試數(shù)量 采用純培養(yǎng)的I株目標(biāo)菌與I株非目標(biāo)菌進(jìn)行耐變性實(shí)驗(yàn)，目標(biāo)菌的濃度在POD值為.0.25~0.75的水平；每種測(cè)試條件10次平行，目標(biāo)菌采用檢測(cè)方法所要求的培養(yǎng)基；非目標(biāo)菌采用非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；采用試劑盒方法進(jìn)行分析，報(bào)出每種條件下檢測(cè)的POD 值； B、耐變因素選擇 確定需要評(píng)價(jià)的變量2個(gè):反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，每個(gè)變量取兩個(gè)不同的水平； C、結(jié)果判斷 如果當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件改變，POD值〈0.9，表明該條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果有重要影響； (5)批間變異 采用純培養(yǎng)的I株目標(biāo)菌與I株非目標(biāo)菌進(jìn)行批間變異實(shí)驗(yàn)，目標(biāo)菌的濃度在POD值為0.25~0.75的水平； 目標(biāo)菌采用檢測(cè)方法所要求的培養(yǎng)基；非目標(biāo)菌采用非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；采用試劑盒方法進(jìn)行分析，取3個(gè)不同批號(hào)的試劑盒產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，每種測(cè)試條件10次平行，報(bào)出每種條件下檢測(cè)的POD值； 如果不同批次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的POD值出現(xiàn)〈±0.1的偏差，表明試劑盒產(chǎn)品批次間差異不顯著，POD值偏差>±0.2，表明試劑盒產(chǎn)品批次間差異顯著； (6 )協(xié)同驗(yàn)證 選擇I種食品，添加目標(biāo)菌，制備未接種、低、高三個(gè)接種水平樣品，每一水平8個(gè)平行樣品； 同時(shí)用試劑盒方法和參考方法進(jìn)行測(cè)試，至少8家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)同實(shí)驗(yàn)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/10GK104131116SQ201410427208
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月27日
【發(fā)明者】鄭晶, 陳彬, 鄭潔, 林杰, 彭華毅 申請(qǐng)人:福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心