本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種融合蛋白質(zhì)及其在檢測沙門氏菌中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

沙門氏菌是一種世界范圍內(nèi)非常常見的食源性致病菌。根據(jù)WHO/FDA等機構(gòu)發(fā)布的信息，每年由沙門氏菌引起的食物中毒病例總是名列榜首，嚴(yán)重威脅著人體健康、造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，包括我國在內(nèi)的絕大部分國家，都做出食物中不可檢出沙門氏菌的規(guī)定。

目前，包括我國在內(nèi)的很多國家對沙門氏菌的檢測仍采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，報告結(jié)果需4-7天才可得出，步驟繁瑣、耗時耗力，不利于對沙門氏菌進行有效地預(yù)防和控制，因此，人們都在致力于建立一套方便、迅捷、特異性強的沙門氏菌檢測系統(tǒng)。如今，基本形成了PCR、ELISA、生物傳感器等三種基本類型的快速檢測系統(tǒng)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種融合蛋白質(zhì)及其在檢測沙門氏菌中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，是如下(a1)或(a2)：

(a1)由序列表中序列1自N末端第1至120位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；

(a2)將(a1)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且可以與靶標(biāo)分子結(jié)合的由(a1)衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還保護所述蛋白質(zhì)的應(yīng)用，為如下(b1)-(b6)中任一種：

(b1)檢測靶標(biāo)分子；

(b2)制備用于檢測靶標(biāo)分子的試劑盒；

(b3)結(jié)合靶標(biāo)分子；

(b4)制備用于結(jié)合靶標(biāo)分子的試劑盒；

(b5)富集靶標(biāo)分子；

(b6)制備用于富集靶標(biāo)分子的試劑盒。

所述靶標(biāo)分子為序列表中序列3的自5′端第22-33位核苷酸所示的DNA分子。

本發(fā)明還保護含有所述蛋白質(zhì)的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)檢測靶標(biāo)分子；

(d2)結(jié)合靶標(biāo)分子；

(d3)富集靶標(biāo)分子。

所述靶標(biāo)分子為序列表中序列3的自5′端第22-33位核苷酸所示DNA的分子。

本發(fā)明還保護一種融合蛋白，包括結(jié)合區(qū)段和標(biāo)記區(qū)段；所述結(jié)合區(qū)段如序列表中序列1自N末端第1至120位氨基酸殘基所示。

所述融合蛋白的標(biāo)記區(qū)段可為現(xiàn)有技術(shù)中使用的任何可發(fā)揮標(biāo)記功能的蛋白。

所述融合蛋白的標(biāo)記區(qū)段具體可如序列表中序列1自N末端第139至322位氨基酸殘基所示。

所述融合蛋白還包括His標(biāo)簽，所述His標(biāo)簽如序列表中序列1自N末端第330至335位氨基酸殘基所示。

所述融合蛋白具體為由序列表中序列1自N末端第1至335位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還保護所述融合蛋白的應(yīng)用，為如下(c1)或(c2)：

(c1)檢測靶標(biāo)分子；

(c2)制備用于檢測靶標(biāo)分子的試劑盒。

所述靶標(biāo)分子為如序列表中序列3的自5′端第22-33位核苷酸所示DNA分子。

本發(fā)明還保護含有所述融合蛋白的試劑盒；所述試劑盒的用途為檢測靶標(biāo)分子；

所述靶標(biāo)分子為如序列表中序列3的自5′端第22-33位核苷酸所示DNA分子。

本發(fā)明還保護一種用于檢測沙門氏菌的試劑盒，包括權(quán)所述融合蛋白和特異引物對；

所述特異引物對由引物F和引物R組成；

所述引物F為如下(e1)或(e2)；

(e1)序列表的序列7所示的單鏈DNA分子；

(e2)將序列7經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的DNA分子；

所述引物R為如下(e3)或(e4)；

(e3)序列表的序列8所示的單鏈DNA分子；

(e4)將序列8經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的DNA分子。

本發(fā)明還保護一種用于檢測沙門氏菌的試劑盒；包括所述融合蛋白、生物素標(biāo)記的特異引物對和鏈霉親合素標(biāo)記磁珠；

所述特異引物對由引物F和引物R組成；

所述引物F為如下(e1)或(e2)；

(e1)序列表的序列7所示的單鏈DNA分子；

(e2)將序列7經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的DNA分子；

所述引物R為如下(e3)或(e4)；

(e3)序列表的序列8所示的單鏈DNA分子；

(e4)將序列8經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的DNA分子。

所述試劑盒還包括沖洗液A、沖洗液B和沖洗液C。

本發(fā)明還保護一種檢測沙門氏菌的方法，包括如下步驟(f1)-(f5)：

(f1)采用生物素標(biāo)記的特異引物對模板進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；

(f2)將步驟(f1)得到的PCR擴增產(chǎn)物與鏈霉親合素標(biāo)記的磁珠共孵育；

(f3)完成步驟(f2)后，收集磁珠，與所述融合蛋白共孵育；

(f4)完成步驟(f3)后，收集磁珠檢測熒光信號；

所述模板為待測樣本的基因組DNA或培養(yǎng)待測樣本得到的菌液；

所述特異引物對由引物F和引物R組成；

所述引物F為如下(e1)或(e2)；

(e1)序列表的序列7所示的單鏈DNA分子；

(e2)將序列7經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的DNA分子；

所述引物R為如下(e3)或(e4)；

(e3)序列表的序列8所示的單鏈DNA分子；

(e4)將序列8經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的DNA分子。

所述方法中，步驟(f1)PCR擴增的反應(yīng)體系具體可為10mmol/L dNTPs 2μL，5×PCR buffer 10μL，F(xiàn)ast pfu DNA polymerase 1μL，引物F 1μL，引物R 1μL，模板DNA 1μL，H₂O 34μL，總體積50μL。

所述反應(yīng)體系中，引物F的濃度為10μM，引物R的濃度為10μM。

所述步驟(f1)中，PCR擴增的反應(yīng)程序具體可為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5min，10℃保存。

所述步驟(f2)中，共孵育的時間為30min。

所述方法中，還包括如下步驟：完成步驟(f2)后，收集磁珠，使用沖洗液A沖洗(具體可沖洗兩次)，然后加入沖洗液B并孵育30min，然后收集磁珠。

所述步驟(f3)中，共孵育的時間為30min。

所述步驟(f3)中，所述融合蛋白以蛋白質(zhì)溶液的形式加入到共孵育體系中，融合蛋白在蛋白質(zhì)溶液中的初始濃度為100nM；每5μL磁珠加入100μL蛋白質(zhì)溶液。

所述方法中，還包括如下步驟：完成步驟(f3)后，收集磁珠，先用沖洗液C沖洗(具體可沖洗兩次)，然后用沖洗液B沖洗(具體可沖洗一次)，然后用100μL沖洗液A重懸。

所述方法中，所述檢測熒光信號具體為檢測460/40nm熒光信號。

以上任一所述沖洗液A的配置方法為：0.1M Tris-HCl、100μM ZnCl₂、0.1M NaCl，余量為水，pH為8.4。

以上任一所述沖洗液B的配置方法為：0.1M Tris-HCl、100μM ZnCl₂、0.1M NaCl、2g/mL脫脂奶粉、1mM Biotin，余量為水，pH為8.4。

以上任一所述沖洗液C的配置方法為：0.1M Tris-HCl、100μM ZnCl₂、0.1M NaCl、2g/mL脫脂奶粉、1mM Biotin，余量為水，0.1％(體積百分比)tween20，pH為8.4。

以上任一所述待測樣本具體可為沙門氏菌或大腸桿菌。

本發(fā)明設(shè)計合成了一種融合蛋白，本發(fā)明可以用于沙門氏菌的檢測，具備方便、迅捷、特異性強的優(yōu)點，對沙門氏菌的有效地預(yù)防和控制有重要意義。

附圖說明

圖1為實施例1中蛋白純化結(jié)果。

圖2為實施例2中應(yīng)用AF-Gluc蛋白檢測靶標(biāo)分子檢測結(jié)果。

圖3為實施例3中特異性檢測結(jié)果。

圖4為實施例4中靈敏度檢測結(jié)果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

pET-21a(+)載體：Novagen公司，產(chǎn)品目錄號：69740-3。

大腸桿菌BL21(DE3)：博邁德公司，產(chǎn)品目錄號：BC201-01。

非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I：0.1M Tris-HCl、0.1M NaCl、0.01M Imidazole、0.5mM EDTA，余量為水，pH為8.4。

非變性鎳柱洗脫緩沖液II：0.1M Tris-HCl、0.1M NaCl、0.5M Imidazole、0.5mM EDTA，余量為水，pH為8.4。

20％非變性鎳柱洗脫緩沖液：非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的混合溶液，非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的體積比為80∶20。

80％非變性鎳柱洗脫緩沖液：非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的混合溶液，非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I和非變性鎳柱洗脫緩沖液II的體積比為20∶80。

沖洗液A：0.1M Tris-HCl、100μM ZnCl₂、0.1M NaCl，余量為水，pH為8.4。

沖洗液B：0.1M Tris-HCl、100μM ZnCl₂、0.1M NaCl、2g/mL脫脂奶粉、1mM Biotin，余量為水，pH為8.4。

沖洗液C：0.1M Tris-HCl、100μM ZnCl₂、0.1M NaCl、2g/mL脫脂奶粉、1mM Biotin，余量為水，0.1％(體積百分比)tween20，pH為8.4。

鏈霉親合素標(biāo)記磁珠：上海翊圣生物科技有限公司。

沙門氏菌：中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號：1.10754。

實施例1、AF-Gluc蛋白的獲得

1、將序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子插入pET-21a(+)載體的Nde I和Hind III酶切位點之間，得到重組質(zhì)粒pET-AF-Gluc。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pET-AF-Gluc進行結(jié)構(gòu)描述如下：將pET-21a(+)載體的Nde I和Hind III酶切位點之間的小片段取代為了序列表的序列2所示的DNA分子。

序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子編碼序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)。將序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)命名為AF-Gluc蛋白，由335個氨基酸殘基組成。將編碼AF-Gluc融合蛋白的基因命名為AF-Gluc基因。AF-Gluc蛋白的預(yù)期分子量約為37kDa。

AF-Gluc蛋白分為三個功能區(qū)。功能區(qū)A為與靶序列的結(jié)合區(qū)，如序列表的序列1第1至120位氨基酸殘基所示；功能區(qū)B為熒光素酶，如序列表的序列1第139至322位氨基酸殘基所示；功能區(qū)C為His標(biāo)簽，如序列表的序列1第330至335位氨基酸殘基所示。

2、將重組質(zhì)粒pET-AF-Gluc導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，得到重組菌，命名為重組菌BL21-pET-AF-Gluc。

3、將重組菌BL21-pET-AF-Gluc接種至含有100μg/ml氨芐霉素的液體LB培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD_600nm值達到0.6-0.8，然后加入IPTG和ZnCl₂(IPTG在培養(yǎng)體系中的濃度為0.5mM、ZnCl₂在培養(yǎng)體系中的濃度為100μM)，然后18℃、200rpm振蕩培養(yǎng)16小時。

4、完成步驟3后，5000rpm離心15分鐘，收集菌體。

5、取步驟4得到的菌體，用非變性鎳柱結(jié)合緩沖液I重懸，超聲波破碎(40w的功率；每超聲5s間歇5s，30個循環(huán))，然后12000rpm離心15min，收集上清液，即為含有AF-Gluc蛋白的粗酶液。

6、采用鎳柱親和層析對步驟5得到的粗酶液進行純化。

采用Amersham公司的AKTA FPLC系統(tǒng)和1ml裝量的HiTrap chelating HP column(鎳柱)。先上樣10ml步驟5得到的粗酶液，然后用10ml 20％非變性鎳柱洗脫緩沖液進行洗滌，然后用30ml 80％非變性鎳柱洗脫緩沖液進行洗脫，整個過程中流速為1ml/min。分別收集上樣時的過柱后溶液(穿透液)和洗脫時的過柱后溶液(洗脫液以每管1ml進行連續(xù)收集)，進行SDS-PAGE。結(jié)果如圖1所示。圖1中，泳道2為標(biāo)準(zhǔn)蛋白maker，泳道1為穿透液，泳道3-9依次對應(yīng)前7管收集的洗脫液(純化后的AF-Gluc蛋白)，蛋白大小為37kDa左右。

實施例2、應(yīng)用AF-Gluc蛋白檢測靶標(biāo)分子

一、制備模板

1、分別合成序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子，然后將兩條單鏈DNA分子進行退火，得到的雙鏈DNA分子即為靶標(biāo)分子。

序列表的序列3：GAAGCGCTCGCATTGTGGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTTGT；

序列表的序列4：ACAAGGTTAATGACATCTTTTTCTCTTGGCGCCCACAATGCGAGCGCTTC；

退火前，對序列3所示的單鏈DNA分子的5’末端進行生物素標(biāo)記。

2、分別合成序列表的序列5所示的單鏈DNA分子和序列表的序列6所示的單鏈DNA分子，然后將兩條單鏈DNA分子進行退火，得到的雙鏈DNA分子即為對照分子。

序列表的序列5：GGTGTTAAGGTTCTGTTTGCTCTGATTTGCATTGCGGTTGCAGAAGCTAAG；

序列表的序列6：CTTAGCTTCTGCAACCGCAATGCAAATCAGAGCAAACAGAACCTTAACACC；

退火前，序列5所示的單鏈DNA分子的5’末端進行生物素標(biāo)記。

二、應(yīng)用AF-Gluc蛋白檢測靶標(biāo)分子

1、分組處理

實驗組I：將100μL ddH₂O與5μL鏈霉親合素標(biāo)記磁珠在1.5mL EP管中混合后室溫孵育30min。

實驗組II：將100μL含靶標(biāo)分子的DNA溶液與5μL鏈霉親合素標(biāo)記磁珠在1.5mL EP管中混合后室溫孵育30min。

實驗組III：將100μL含對照分子的DNA溶液與5μL鏈霉親合素標(biāo)記磁珠在1.5mL EP管中混合后室溫孵育30min。

實驗組IV：將50μL含靶標(biāo)分子的DNA溶液、50μL含對照分子的DNA溶液與5μL鏈霉親合素標(biāo)記磁珠在1.5mL EP管中混合后室溫孵育30min。

含靶標(biāo)分子的DNA溶液中，靶標(biāo)分子的濃度為100nM。含對照分子的DNA溶液中，對照分子的濃度為100nM。

2、完成步驟1后，收集磁珠，使用沖洗液A沖洗2次。

3、完成步驟2后，取所述磁珠，與沖洗液B孵育30min。

4、完成步驟3后，收集磁珠，加入100μL實施例1純化好的AF-Gluc蛋白溶液，共同孵育30min；AF-Gluc蛋白溶液中，AF-Gluc蛋白的濃度為100nM。

5、完成步驟4后，收集磁珠，先用沖洗液C沖洗兩次，然后用沖洗液B沖洗一次。

6、完成步驟5后，收集磁珠，用100μL沖洗液A重懸，加入黑色96酶標(biāo)板中，在460/40nm酶標(biāo)儀檢測熒光讀數(shù)。

結(jié)果如圖2所示。圖2中，1為實驗組I的相對熒光數(shù)值，2為實驗組II的相對熒光數(shù)值，3為實驗組III的相對熒光數(shù)值，4為實驗組IV的相對熒光數(shù)值。結(jié)果表明，實驗組I和實驗組III的熒光信號均非常微弱，實驗組II和實驗組IV的熒光信號均非常明顯，只有在加入了靶標(biāo)分子的實驗組中，檢測出了非常明顯的熒光信號，其余組別信號均非常微弱，在加入靶標(biāo)分子和對照分子的實驗組也檢測到明顯的熒光信號，表明AF-Gluc蛋白檢測靶標(biāo)分子不受到體系中存在的其他分子干擾。

實施例3、特異性

待測樣本為：沙門氏菌、大腸桿菌BL21(DE3)。

1、針對沙門氏菌設(shè)計合成如下兩條引物(5’→3’)：

F(序列表的序列7)：GAAGCGCTCGCATTGTGGGCG；

R(序列表的序列8)：ACAAGGTTAATGACATC；

將引物F的5’進行生物素標(biāo)記。

2、提取各待測樣本的基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用F和R組成的引物對進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物純化后得到雙鏈DNA。

PCR反應(yīng)體系：10mmol/L dNTPs 2μL，5×PCR buffer 10μL，F(xiàn)ast pfu DNA polymerase 1μL，引物F 1μL，引物R 1μL，模板DNA 1μL，H₂O 34μL，總體積50μL。在反應(yīng)體系中，引物F的濃度為10μM，引物R的濃度為10μM。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5min，10℃保存。

3、按照如下步驟依次操作進行檢測：

(1)設(shè)置如下四個實驗組：

實驗組I：將100μL沙門氏菌基因組DNA擴增純化后的雙鏈DNA與5μL鏈霉親合素標(biāo)記磁珠在1.5mL EP管中混合后室溫孵育30min；

實驗組II：將100μL大腸桿菌BL21(DE3)基因組DNA擴增純化后的雙鏈DNA與5μL鏈霉親合素標(biāo)記磁珠在1.5mL EP管中混合后室溫孵育30min。

實驗組III：將50μL沙門氏菌基因組DNA擴增純化后的雙鏈DNA、50μL大腸桿菌BL21(DE3)基因組DNA擴增純化后的雙鏈DNA與5μL鏈霉親合素標(biāo)記磁珠在1.5mL EP管中混合后室溫孵育30min。

實驗組IV：將100μL無菌水與5μL鏈霉親合素標(biāo)記磁珠在1.5mL EP管中混合后室溫孵育30min。

以上各組DNA擴增純化后的雙鏈DNA均以DNA溶液的形式加入到實驗體系中，雙鏈DNA在DNA溶液中的初始濃度均為100nM。

(2)使用磁力分選器分離磁珠2min，使用移液器將EP管中液體吸走，注意避免接觸磁珠，盡量吸凈。使用沖洗液A沖洗2次。

(3)加入沖洗液B與磁珠孵育30min，磁力分選，吸凈液體。

(4)加入100μL實施例1純化好的AF-Gluc蛋白溶液與磁珠共同孵育30min；AF-Gluc蛋白溶液中，AF-Gluc蛋白的濃度為100nM。

(5)使用沖洗液C沖洗兩次，使用沖洗液B沖洗一次，最終用100μL沖洗液A重懸磁珠，加入黑色96酶標(biāo)板中，在460/40nm酶標(biāo)儀檢測熒光讀數(shù)。

結(jié)果如圖3所示。圖3中，縱坐標(biāo)為相對熒光數(shù)值；1為實驗組I的相對熒光數(shù)值，2為實驗組II的相對熒光數(shù)值，3為實驗組III的相對熒光數(shù)值，4為實驗組IV的相對熒光數(shù)值。結(jié)果表明，只有實驗組I和實驗組III檢測出了非常明顯的熒光信號，另外2組別信號均非常微弱，本方法具有特異性。

實施例4、靈敏度

1、將沙門氏菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24小時，將菌液進行稀釋，得到5μL菌液A和5μL菌液B；5μL菌液A中沙門氏菌的含量為1CFU，5μL菌液B中沙門氏菌的含量為10CFU。

2、分別以菌液A和菌液B為模板，采用F和R組成的引物對進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物。

F(序列表的序列7)(5’→3’)：GAAGCGCTCGCATTGTGGGCG；

R(序列表的序列8)(5’→3’)：ACAAGGTTAATGACATC；

將引物F用生物素標(biāo)記。

PCR反應(yīng)體系：10mmol/L dNTPs 2μL，5×PCR buffer 10μL，F(xiàn)ast pfu DNA polymerase 1μL，引物F 1μL，引物R 1μL，菌液A或菌液B 5μL，H₂O 30μL，總體積50μL。在反應(yīng)體系中，引物F的濃度為10μM，引物R的濃度為10μM。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5min，10℃保存。

3、按照如下步驟依次操作進行檢測：

(1)設(shè)置如下三個實驗組：

實驗組I：將50μL無菌水與5μL鏈霉親合素標(biāo)記磁珠在1.5mL EP管中混合后室溫孵育30min。

實驗組II：將50μL以菌液A為模板得到的擴增產(chǎn)物與5μL鏈霉親合素標(biāo)記磁珠在1.5mL EP管中混合后室溫孵育30min。

實驗組III：將50μL以菌液B為模板得到的擴增產(chǎn)物與5μL鏈霉親合素標(biāo)記磁珠在1.5mL EP管中混合后室溫孵育30min。

(2)使用磁力分選器分離磁珠2min，使用移液器將EP管中液體吸走，注意避免接觸磁珠，盡量吸凈。使用沖洗液A沖洗2次。

(3)加入沖洗液B與磁珠孵育30min，磁力分選，吸凈液體。

(4)加入100μL實施例1純化好的AF-Gluc蛋白溶液與磁珠共同孵育30min；AF-Gluc蛋白溶液中，AF-Gluc蛋白的濃度為100nM。

(5)使用沖洗液C沖洗兩次，使用沖洗液B沖洗一次，最終用100μL沖洗液A重懸磁珠，加入黑色96酶標(biāo)板中，在460/40nm酶標(biāo)儀檢測熒光讀數(shù)。

結(jié)果如圖4所示。圖4中，縱坐標(biāo)為相對熒光數(shù)值；1為實驗組I的相對熒光數(shù)值，2為實驗組II的相對熒光數(shù)值，3為實驗組III的相對熒光數(shù)值；結(jié)果表明，當(dāng)待測菌含量低至1CFU時，使用本方法也可以檢測到。