本發(fā)明屬于生物檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種基于新型SERS基底定量檢測致病菌的方法。
背景技術(shù)：
：近年來，微生物引起的食源性疾病已經(jīng)成為當(dāng)今世界性公共衛(wèi)生熱點。在食源性致病菌中，大腸桿菌(Escherichiacoli)O157:H7是最危險的一個，也是目前世界上公認(rèn)的三大最主要的食源性致病菌之一。感染大腸桿菌O157:H7的臨床癥狀包括腹瀉、出血性腸炎(HC)、溶血性尿毒綜合征(HUS)和血栓形成的血小板減少性紫癜等。致病性大腸桿菌可通過污染飲水、食品等途徑引起疾病暴發(fā)流行，嚴(yán)重危害人體健康。目前檢測大腸桿菌O157:H7的金標(biāo)準(zhǔn)是傳統(tǒng)分離鑒定法，該方法需經(jīng)過預(yù)增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生理生化鑒定及血清型鑒定等步驟，整個過程繁瑣耗時(3～7天)，且整個過程需要專業(yè)人員操作，因此該方法只能用于執(zhí)法部門對中毒事件的起因進(jìn)行分析，以及對市場食品安全狀況進(jìn)行評估；免疫學(xué)尤其是免疫層析方法，不需復(fù)雜儀器設(shè)備，檢測時間較快易操作，但目前該類方法總體檢測靈敏度偏低(細(xì)菌濃度需達(dá)到105～106CFU/mL)，因此針對真實樣品檢測，往往需要較長的增菌時間。因此，建立快速、靈敏、穩(wěn)定的檢測方法對食源性致病菌的檢測具有重要的意義。表面增強拉曼散射(Surface-enhancedRamanscattering，SERS)標(biāo)記技術(shù)是一種新穎的光譜標(biāo)記方法，他利用金、銀等貴重金屬的納米粒子來增強吸附在其表面的標(biāo)記分子的拉曼信號，并將其作為標(biāo)記示蹤信號。SERS標(biāo)記技術(shù)具有如下的優(yōu)點，拉曼光譜譜峰窄、拉曼散射幾乎不受水的影響、SERS信號強、低背景、基本不受光漂白的影響且不易發(fā)生淬滅現(xiàn)象、具有超高的靈敏性和選擇性等?；赟ERS技術(shù)而發(fā)展起來的納米探針在生物成像、蛋白質(zhì)檢測、腫瘤識別等諸多領(lǐng)域展現(xiàn)出可觀的應(yīng)用前景。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于新型SERS基底定量檢測致病菌的方法。本發(fā)明采用二氧化硅包裹金納米微球集成免疫磁珠捕獲技術(shù)快速定量檢測致病菌(如：大腸桿菌O157:H7(E.coliO157:H7))。本發(fā)明的方法具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強、檢測過程簡單快速、準(zhǔn)確定量等特點。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種基于新型SERS基底定量檢測致病菌的方法，包括如下步驟：(1)將拉曼信號分子結(jié)合到金納米顆粒表面，隨后通過氨水還原正硅酸乙酯(TEOS)的方法在結(jié)合了拉曼信號分子的金納米顆粒表面形成二氧化硅薄層，以保證拉曼信號分子的穩(wěn)定性；(2)通過硅烷偶聯(lián)劑將巰基修飾在步驟(1)中制備好的硅層上，再通過中間體將致病菌抗體修飾在該顆粒表面，用牛血清蛋白(BSA)封閉剩余活性位點，制備成拉曼信號探針；(3)采用活化劑活化表面修飾有羧基的磁珠，隨后加入致病菌抗體和BSA制備成磁性納米顆粒，即捕獲探針；(4)將培養(yǎng)好的致病菌離心后用水重懸，并稀釋成一組具有濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品液；(5)取相同體積的步驟(3)中的捕獲探針，分別加入步驟(4)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品液，室溫中孵育，磁分離后去掉上清液；再將步驟(2)中的拉曼信號探針加入，形成“捕獲探針-致病菌-信號探針”的“三明治”結(jié)構(gòu)；磁分離后，對上清液中剩余的拉曼信號探針進(jìn)行信號采集；(6)根據(jù)致病菌濃度與拉曼信號強度的對應(yīng)關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而應(yīng)用拉曼信號對致病菌進(jìn)行定量檢測；在上述檢測致病菌的方法中：所述的致病菌優(yōu)選為大腸桿菌(E.coli)O157:H7；步驟(2)、(3)中所述的致病菌抗體優(yōu)選為大腸桿菌(E.coli)O157:H7抗體；步驟(1)中所述的拉曼信號分子優(yōu)選為4,4′-聯(lián)吡啶，該分子一端連接在膠體金表面，另一端與抗體相連，是雙官能團(tuán)標(biāo)記分子；步驟(1)中所述的金納米顆粒的平均粒徑優(yōu)選為25nm～35nm；優(yōu)選為30nm；步驟(1)中所述的氨水還原正硅酸乙酯的方法是在異丙醇的水溶液中進(jìn)行；步驟(2)中所述的硅烷偶聯(lián)劑是(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)，通過偶聯(lián)作用將巰基修飾在硅層上；步驟(2)中所述的中間體是3-硫代-N-琥珀酰亞胺基4-(馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸鈉鹽(sulfo-SMCC)，其中一端馬來酰亞胺接在硅層的巰基上，另一端琥珀酰亞胺用來連接致病菌抗體；步驟(2)中所述的致病菌抗體的濃度優(yōu)選為0.5～1mg/mL；更優(yōu)選為0.5mg/mL。步驟(2)中所述的牛血清蛋白(BSA)為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)2.5％的BSA，與重懸用的0.002mol/L硼酸鹽緩沖溶液(BB)(pH＝8.2)的體積比優(yōu)選為1：50；步驟(3)中所述的表面修飾有羧基的磁珠，其粒徑優(yōu)選為100～200nm；優(yōu)選為表面修飾有羧基的四氧化三鐵；步驟(3)中所述的活化劑優(yōu)選為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)；步驟(4)中所述的致病菌培養(yǎng)過程如下：首先將凍存的菌種放置在37℃的環(huán)境中活化30min，然后把活化好的菌種加入到已滅菌的LB培養(yǎng)基中，放置在恒溫培養(yǎng)箱中(120rpm，37℃)振蕩10h；步驟(4)中所述的濃度梯度為0、10、103、105、107、109CFU/mL，其中0CFU/mL為空白對照；步驟(5)中所述的室溫中孵育的時間優(yōu)選為1～2h；更優(yōu)選為1h；步驟(5)中所述的“三明治”結(jié)構(gòu)(捕獲探針-致病菌-信號探針)的混合體積比例為3.5～4.5：1：4.5～5.5；優(yōu)選為4：1：5；當(dāng)采用該比例的用量關(guān)系時，最低檢測限和背景信號大小合適；步驟(5)中所述的磁分離是指利用磁場物理作用分離磁性結(jié)合物與上清液，相比于傳統(tǒng)的清洗固相基底來去除殘留物的步驟，此方法更加漸變、高效；步驟(5)中所述的信號是通過顯微拉曼光譜儀測得：所述的顯微拉曼光譜儀的操作條件優(yōu)選為激發(fā)光源是波長為632.8nm的He-Ne激光器，到達(dá)樣品的激光功率為1mW，信號收集時間為10～60s；步驟(5)中所述的信號是選取拉曼信號分子的特征拉曼譜峰(1612cm-1)作為定量峰，并以致病菌濃度對該譜峰光譜強度作圖，并以此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；本發(fā)明的機理：在收集時間一定的情況下，對于同一種拉曼信號分子，信號強度與拉曼信號分子的濃度呈正相關(guān)；正是在此基礎(chǔ)上實現(xiàn)了定量檢測。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果：(1)本發(fā)明將免疫光譜標(biāo)記處理的二氧化硅包裹金納米顆粒用于致病菌(如：E.coliO157:H7)的定量檢測，將拉曼分子的信號強度和待測物質(zhì)的濃度聯(lián)系起來，類似于朗伯比爾定律，從而實現(xiàn)對致病菌(如：E.coliO157:H7)的定量檢測；(2)本發(fā)明采用的二氧化硅包裹金納米顆粒是新型拉曼基底，并首次將4,4′-聯(lián)吡啶包裹在硅層內(nèi)，以保證拉曼信號分子在后續(xù)反應(yīng)中的穩(wěn)定性；(3)本發(fā)明基于二氧化硅包裹金納米顆粒制備的免疫信號探針，相比于傳統(tǒng)的裸金探針，穩(wěn)定性得到了大大提升，可以在4℃條件下穩(wěn)定保存至少50h；(4)本發(fā)明無需將致病菌(如：E.coliO157:H7)從免疫磁珠上洗脫下來，提高了捕獲效率，定量檢測時變異系數(shù)??；減少了工作量和雜菌污染概率；(5)本發(fā)明是通過檢測溶液的拉曼光譜信號得到相應(yīng)的結(jié)果，相比于傳統(tǒng)的檢測固相基底的方法，溶液中的拉曼光譜信號監(jiān)測數(shù)據(jù)更加穩(wěn)定可靠且可大量重復(fù)；(6)本發(fā)明檢測穩(wěn)定性好，檢測靈敏度高，得到了一個寬的檢測區(qū)間(10～109CFU/mL)和低的檢測限(10CFU/mL)；(7)本發(fā)明操作簡單，SERS免疫信號探針與捕獲探針都可以提前準(zhǔn)備好，操作時只需將捕獲探針和信號探針依次加入到待測樣品中反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過磁分離可以馬上進(jìn)行檢測：收集時間30s，然后立刻從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出濃度，從而實現(xiàn)快速定量檢測；這可以滿足食品安全和環(huán)境監(jiān)測部門的要求，具有廣泛的實用性。附圖說明圖1是快速定量檢測E.coliO157:H7的方法流程示意圖。圖2是制備的金納米顆粒和二氧化硅包裹金納米顆粒的透射電鏡圖。圖3是使用不同濃度E.coliO157:H7標(biāo)準(zhǔn)溶液得到的拉曼信號光譜圖。圖4是標(biāo)準(zhǔn)溶液中E.coliO157:H7檢測的曲線圖；其中，橫坐標(biāo)代表E.coliO157:H7的濃度(橫坐標(biāo)是濃度的log10)，縱坐標(biāo)代表水體中E.coliO157:H7的拉曼信號強度。圖5是基于二氧化硅包裹金納米顆粒制備的信號探針和基于裸金制備的信號探針穩(wěn)定性的對比。圖6是E.coliO157:H7特異性檢測的拉曼信號強度圖。具體實施方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。下面實施例中，未注明具體條件和環(huán)境的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或制造廠商所建議的條件。本發(fā)明中DP為拉曼信號分子4,4′-聯(lián)吡啶；BSA為牛血清蛋白；BB表示硼酸鹽緩沖液；PBS表示磷酸鹽緩沖液；EDC表示1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞氨鹽酸鹽；NHS表示N-羥基琥珀酰亞胺；APTES表示3-氨丙基三乙氧基硅烷；TEOS表示正硅酸乙酯；MPTMS表示(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷；Sulfo-SMCC表示3-硫代-N-琥珀酰亞胺基4-(馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸鈉鹽?？焖俣繖z測E.coliO157:H7的方法流程示意圖，如圖1所示。實施例1(1)、金納米顆粒的制備在不斷攪拌下將100mL1mM的氯金酸(HAuCl4)溶液加熱至沸騰，然后加入6mL38.8mM的檸檬酸三鈉水溶液。此時溶液的顏色變化是：淡黃-無色-黑色-紫色-深紅色，等溶液變成深紅色繼續(xù)加熱回流15～20min。最后冷卻至常溫，制備得到30nm的金納米顆粒(如圖2C)，圖2A是理想條件下得到的金納米顆粒。(2)、二氧化硅包裹金納米顆粒的制備向6個1.5mLEP管中分別加入1mL金納米顆粒(濃度約為1mmol/L)，然后依次加入30μL0.01mM的4,4′-聯(lián)吡啶溶液，充分混勻后反應(yīng)10min，8000rpm離心10min，去除上清液，分別用1mL三蒸水重懸。然后將6個EP管中的膠體全部轉(zhuǎn)移至25mL血清瓶中，在不斷攪拌下依次向血清瓶中加入10μL2.7％NaSiO3溶液(反應(yīng)10min)(購自Sigma試劑公司)和12μL1mMAPTES溶液(反應(yīng)10min)(購自Sigma試劑公司)，反應(yīng)結(jié)束后分置在6個EP管中，8000rpm離心10min，去除上清液，三蒸水重懸；再將6個EP管中的混合液逐滴加入到6mL異丙醇水溶液中(3mL異丙醇+3mL三蒸水)，攪拌5min后，加入200μL氨水(混合5min)(購自Sigma試劑公司)，最后將300μLTEOS(購自Sigma試劑公司)逐滴加入到上述混合液中，攪拌反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束；6000rpm離心15min，三蒸水重懸，最后得到二氧化硅包裹的金納米顆粒(如圖2D)，圖2B是理想條件下合成的二氧化硅包裹的金納米顆粒。(3)、拉曼信號探針的制備向1mL二氧化硅包裹的金納米顆粒中加入6μL0.1mMMPTMS(購自Sigma試劑公司)，充分混勻反應(yīng)30min，然后利用離心機離心15min，轉(zhuǎn)速為6000rpm。離心后去掉上清液，以1mLBB緩沖液重懸；隨后加入3μL0.1mMSulfo-SMCC，反應(yīng)30min后，加入5μL0.5mg/mLrabbitanti-E.coliO157:H7(即E.coliO157:H7抗體)(購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，室溫下孵育2h，以8000rpm離心10min，去掉上清液，用BB緩沖液重懸；最后加入30μL2.5％BSA，反應(yīng)1h，離心(8000rpm，10min)去上清液，用PBS緩沖液重懸備用，最終得到的信號探針保存在4℃環(huán)境下。(4)、捕獲探針的制備取100μL表面修飾有羧基的四氧化三鐵Fe3O4，購自阿拉丁試劑(上海)有限公司，用PBS清洗兩次，最后用PBS定容至1mL。然后配制EDC(4mg/mL)和NHS(1mg/mL)，首先向上述磁珠溶液加入30μL的EDC溶液，10min后加入同樣體積的NHS溶液，活化30min。然后用PBS清洗磁珠兩次，之后用PBS重懸，隨后加入5μL0.5mg/mLrabbitanti-E.coliO157:H7，反應(yīng)2h后用PBS洗滌去除多余抗體，加入30μL的BSA(2.5％)，封閉未結(jié)合的位點。1h后，用PBS清洗上述磁珠兩次，重懸備用，得到捕獲探針。(5)、標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的制備選擇6個濃度的E.coliO157:H7標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別為0、10、103、105、107、109CFU/mL，其中0CFU/mL為空白對照。(6)、“三明治”結(jié)構(gòu)制備以及E.coliO157:H7的檢測取80μL步驟(4)中制備的捕獲探針和20μL步驟(5)中配制好的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液混合1h，利用捕獲探針上的抗體與大腸桿菌特異性結(jié)合，形成“捕獲探針-大腸桿菌”的兩層結(jié)構(gòu)；隨后再加入100μL步驟(3)中制備的拉曼信號探針，反應(yīng)2h后，形成了“捕獲探針-大腸桿菌-信號探針”的“三明治”結(jié)構(gòu)；隨著E.coliO157:H7濃度的增加，“三明治”結(jié)構(gòu)會有不同程度的增加，磁分離后的上清液中殘留的拉曼信號探針濃度也會有不同程度的減少。(7)、拉曼信號的測量利用磁鐵的磁場作用分離底物，保留上清液。用日本NipponOpticalSystem公司的顯微拉曼光譜儀，對上清液中的拉曼信號探針進(jìn)行信號采集，激發(fā)光源是波長為632.8nm的He-Ne激光器，到達(dá)樣品的激光功率為1mW，信號收集時間為30s。信號采集完畢后通過Origin軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行基線處理，得到清晰直觀的SERS光譜圖(如圖3)。從圖4中可以明顯地看到，隨著樣品中E.coliO157:H7濃度的提高，采集的SERS信號逐漸降低，兩者關(guān)系符合Y＝1489.24-80.74X，表明在這一區(qū)間可以進(jìn)行有效的定量分析。實施例2取1mL制得的金納米顆粒溶液，放入EP管中，加入30μL0.01mM的4,4′-聯(lián)吡啶溶液，室溫反應(yīng)10min后，8000rpm離心(10min)，去除上清液，用BB緩沖液重懸，加入5μL0.5mg/mLrabbitanti-E.coliO157:H7，孵育2h后，離心(8000rpm，10min)去上清液，BB緩沖液重懸，再加入30μL2.5％BSA，封閉未結(jié)合位點，1h后離心(8000rpm，10min)去上清液，用PBS緩沖液重懸，制備得到裸金的信號探針。將其與實施例1步驟(3)中的信號探針放置相同時間，并測得各自在同一時間的拉曼信號強度(如圖5)。從圖5中得知，初步的研究表明這種新型的SERS基底具有如下優(yōu)勢：1)二氧化硅硅層可以保證金納米顆粒不受外界化學(xué)條件的干擾；2)把4,4′-聯(lián)吡啶包裹在硅層內(nèi)可以防止標(biāo)記分子在后續(xù)反應(yīng)中發(fā)生脫落；3)二氧化硅硅層可以阻止抗體與標(biāo)記分子發(fā)生競爭反應(yīng)。實施例3取珠江廣州段的水體樣品，經(jīng)過過濾、離心，并用三蒸水稀釋40倍以消除基質(zhì)影響(該已知濃度的水體稀釋液中E.coliO157:H7的濃度分別為102、104、106、108CFU/mL)。根據(jù)該實際水體樣品中獲得的拉曼光譜信號強度，從圖4中的標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出對應(yīng)的E.coliO157:H7的濃度，乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為待測樣品中E.coliO157:H7的實際濃度。根據(jù)實施例1中的線性方程得出的實際水體樣品的濃度如下表1中所示。表1實際水體樣品中E.coliO157:H7濃度和采用本實施例方法測得的E.coliO157:H7濃度已知濃度(CFU/mL)實測濃度(CFU/mL)回收率(％)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(％)1×1021×102.06114.823.771×1041×103.9793.334.541×1061×106.01102.3312.941×1081×108.07117.493.69實施例4為了說明本發(fā)明的特異性，分別制備了來自廣州市疾病預(yù)防控制中心的大腸桿菌137(E.137)，大腸桿菌108G(E.108G)，大腸桿菌974(E.974)，大腸桿菌1006(E.1006)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(SA)，沙門氏菌(Salmonellaenteriditis)(SE)，李斯特菌(Listeriamonocytogenes)(Lm)標(biāo)準(zhǔn)溶液，具體實施步驟參照例1；得到的信號強度可參照圖6，說明本發(fā)明具有很強的特異性。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3