專利名稱：：食源性致病菌多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物
技術(shù)領(lǐng)域：
的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列及其制備方法，具體是一種食源性致病菌PCR檢測中的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列及其制備方法。
背景技術(shù)：
：mIAC(multipleinternalamplificationcontrol)是指多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，艮卩添力口到PCR反應(yīng)體系中，用以指示假陰性現(xiàn)象的一段DNA序列或者是一段致病菌的看家基因序列。中國加入WTO后，食品安全問題越來越成為制約我國對外貿(mào)易的主要障礙，嚴(yán)重地阻礙著我國的經(jīng)濟(jì)發(fā)展、影響人民的身體健康，因此通過發(fā)展快速的檢測技術(shù)來解決食品安全問題是國家所需求的。但是目前我國對食品中5種重要致病菌抓副溶血弧菌、大腸桿菌0157:H7、單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌的國標(biāo)檢驗方法仍是采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，由于此方法費(fèi)時費(fèi)力，而且靈敏度又不高，已不能滿足食品加工與生產(chǎn)中對致病菌快速檢測的需求。所以建立準(zhǔn)確、快速的食源性致病菌PCR檢測方法能促進(jìn)我國及時、有效地進(jìn)行食源性疾病的預(yù)防、預(yù)警和控制，保障人民的身體健康。雖然隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展、改進(jìn)，此技術(shù)已在許多方面都有了很大程度的提高，但在近來的一些應(yīng)用實(shí)踐中顯示，PCR反應(yīng)結(jié)果常常會呈現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，究其原因，PCR反應(yīng)會因抑制劑等的影響而抑制反應(yīng)的發(fā)生，造成假陰性現(xiàn)象的發(fā)生，因此，在PCR檢測中出現(xiàn)假陰性的現(xiàn)象就成為研究者所最為關(guān)心的問題之一，而這一問題也一直沒有得到很好的解決。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，劉斌等人于2006年根據(jù)沙門氏菌stn基因的一段特異DNA序列運(yùn)用復(fù)合引物技術(shù)構(gòu)建了擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，并用于沙門氏菌的普通PCR檢測(劉斌，史賢明；擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)在沙門氏菌PCR檢測方法中的應(yīng)用.微生物學(xué)通報，2006，33:156161)。但由于劉斌等人用于構(gòu)建內(nèi)標(biāo)的序列是源于沙門氏菌本身，這樣難免會出現(xiàn)錯配、同源性交聯(lián)干擾等現(xiàn)象；YounesMaaroufi等于2006年建立了一種多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)合成方法，該方法運(yùn)用復(fù)合引物技術(shù)將EBV、CMV、TGO、hoPoV和HBV的特異檢測引物序列依次添加到一段擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列上，構(gòu)建了同時含這五種病毒檢測引物序列的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)(YounesMaaroufi，Jean—MarcdeBruyne，ValerieDuchateau，RobertScheenandFrancoiseCrokaert.Developmentofamultipleinternalcontrolforclinicaldiagnosticreal—timeamplificationassays.FEMSImmunologyandMedicalMicrobiology,2006，48:183191.)(Yo皿esMaaroufi，Jean-MarcdeBruyne，ValerieDuchateau，RobertScheenandFrancoiseCrokaert.用于臨床診斷實(shí)時擴(kuò)增實(shí)驗的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的研制.FEMS免疫學(xué)與醫(yī)學(xué)微生物學(xué).2006,48:183191.)。而YounesMaaroufi等構(gòu)建的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)是用于臨床研究方面的，而在食品安全檢測方面，添加有多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的檢測方法卻還很少有人加以研究應(yīng)用；2007年，JessicaL.Nordstrom等人在用多重?zé)晒舛縋CR檢測牡蠣中的全部及致病性的副溶血弧菌時，將一條人工構(gòu)建的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)添入檢測體系中，用以指示假陰性(JessicaLNordstrom,MichaelC丄Vickery，GeorgeM.Blackstone，ShelleyL.Murray,andAngeloDePaola.DevelopmentofaMultiplexReal—TimePCRAssaywithaninternalAmplficationControlfortheDetectionofTotalandPathogenicVibrioparahaemolyticusBacteriainOysters.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2007，73(18):58405847)(JessicaL.Nordstrom,MichaelC丄Vickery，GeorgeM.Blackstone,ShelleyLMurray,andAngeloDePaola.用于檢測牡蠣中所有及致病性副溶血弧菌的添加有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的多重?zé)晒舛縋CR實(shí)驗的建立.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué).2007,73(18):58405847)。JessicaL.Nordstrom等人用一條外源DNA作為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，他們所構(gòu)建的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)是非競爭性的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，也即所用的檢測引物不能同時擴(kuò)增目的片段和擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，整個PCR體系中至少有兩對引物，一對用于擴(kuò)增目的片段，一對用于擴(kuò)增擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，這樣很容易引起引物間的相互干擾作用，同時也很難達(dá)到PCR的最佳反應(yīng)條件；2008年，龍飛等人在檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌時將擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)進(jìn)行了進(jìn)一步地改進(jìn)，構(gòu)建了活菌內(nèi)標(biāo)，使得所構(gòu)建的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)不僅僅在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中能起到指示假陰性的作用，而且在增菌培養(yǎng)、菌體收集、DNA提取等所有過程都能指示假陰性的出現(xiàn)(FeiLong,Xin_naZhu，Zhong-mingZhang，Xian-mingShi.Developmentofaqimntitativ印olymerasechainreactionmethodusingalivebacteriumasinternalcontrolforthedetectionofListeriamonocytogenes.DiagnosticMicrobiologyandInfectiousDisease，2008，62:374381)(龍飛，朱欣娜，張忠明，史賢明.以活菌作為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的用于檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌的PCR反應(yīng)體系的建立.診斷微生物學(xué)與傳染病.2008,62:374381)，盡管龍飛等人構(gòu)建的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)可以達(dá)到全程指示假陰性，但是他們所構(gòu)建的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)是單一的，不能應(yīng)用于多種食源性致病菌的PCR檢測中去。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種食源性致病菌PCR檢測中的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列及其制備方法。使用本發(fā)明的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)可使PCR檢測結(jié)果能夠指示假陰性的發(fā)生，避免了因樣品中存在抑制劑或操作失誤而導(dǎo)致檢測結(jié)果呈現(xiàn)假陰性以至于做出錯誤的結(jié)果判斷，從而提高了PCR檢測的準(zhǔn)確率，可滿足檢疫執(zhí)法的需要。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明涉及一種食源性致病菌PCR檢測中的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列，該序列的堿基序列如下1054F—15bp—hlyAF—15bp—PrsF—15bp—PSF--15bp--SAlF--擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列--SAlR—15bp—hlyAR—15bp—PSR—-15bp—PrsR—15bp—1054R;其中，所述1054F的堿基序列如SEQIDNO:8所示；所述1054R的堿基序列如SEQIDNO:9所示;所述hlyAF的堿基序列如SEQIDNO:10所示；所述hlyAR的堿基序列如SEQIDNO:11所示；所述PrsF的堿基序列如SEQIDNO:12所示；所述PrsR的堿基序列如SEQIDNO:13所示；所述PSF的堿基序列如SEQIDNO:14所示；所述PSR的堿基序列如SEQIDNO:15所示；所述SA1F的堿基序列如SEQIDNO:16所示；所述SA1R的堿基序列如SEQIDNO:17所示;所述15bp為由如SEQIDNO:18所示的的堿基序列隨機(jī)重排后得到的任一序列；所述擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列具體為隨機(jī)重排SEQIDNO:1所示的堿基序列，得到相應(yīng)的核酸，選取與所要檢測的五種目的基因無同源性的任一核酸作為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列；所述五種目的基因具體為堿基序列分別如SEQIDNO:37所示的基因。優(yōu)選地，所述多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列的堿基序列如SEQIDNO:2所示。所述食源性致病菌PCR檢測中的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列的制備方法，包括如下步驟步驟一，隨機(jī)重排SEQIDNO:1所示的堿基序列，得到相應(yīng)的核酸，選取與所要檢測的五種目的基因無同源性的任一核酸作為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列；所述五種目的基因具體為堿基序列分別如SEQIDNO:37所示的基因；隨機(jī)重排堿基序列ATTTCCAAGGTGAGC，選擇任一序列作為長度為15bp的序列；步驟二，采用常規(guī)多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)構(gòu)建方法，利用步驟一所得的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列、長度為15bp的序列以及堿基序列如SEQIDNO:817所示的10條序列構(gòu)建如下的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)1054F—15bp—h1yAF—15bp—PrsF—15bp—PSF—15bp—SAIF—擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列一SAlR—15bp—hlyAR—15bp—PSR—-15bp—PrsR—15bp—1054R。本發(fā)明的技術(shù)方案中，術(shù)語"無同源性"是指，所得核酸的堿基序列與目的基因的堿基序列之間的連續(xù)同源堿基數(shù)不超過20bp。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果利用本發(fā)明的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)可以檢測如下五種細(xì)菌副溶血弧菌、大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌。在獨(dú)自檢測5種細(xì)菌時，如樣品中的被檢菌的DNA含量高于檢測靈敏度時，電泳結(jié)果中含有目的基因的擴(kuò)增片段，檢測結(jié)果呈陽性；當(dāng)樣品中不含或者含量低于檢測靈敏度時，電泳結(jié)果中只含有多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增片段，檢測結(jié)果為陰性；當(dāng)電泳結(jié)果中不出現(xiàn)任何擴(kuò)增片段時，檢測結(jié)果即為假陰性；該多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的使用使PCR檢測結(jié)果能夠指示假陰性的發(fā)生，避免了因樣品中存在抑制劑或操作失誤而導(dǎo)致檢測結(jié)果呈現(xiàn)假陰性以至于做出錯誤的結(jié)果判斷，從而提高了PCR檢測的準(zhǔn)確率，可滿足檢疫執(zhí)法的需要。圖1為多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的特異檢測引物的排列順序示意圖；圖2為引物1054的特異性實(shí)驗電泳圖；圖3為引物hlyA的特異性實(shí)驗電泳圖；圖4為引物Prs的特異性實(shí)驗電泳圖；圖5為引物PS的特異性實(shí)驗電泳圖；圖6為引物SA1的特異性實(shí)驗電泳圖7為培養(yǎng)物水平的抗干擾實(shí)驗示意圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗室手冊(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。對于實(shí)施例中涉及的菌株，本領(lǐng)域的技術(shù)人員均可以很容易地通過公開的市售渠道獲得。實(shí)施例1多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的制備步驟一，隨機(jī)重排SEQIDNO:1所示的堿基序列，得到相應(yīng)的核酸，選取與所要檢測的五種目的基因無同源性的核酸作為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列；所述五種目的基因具體為堿基序列分別如SEQIDNO:37所示的基因；隨機(jī)重排堿基序列ATTTCCAAGGTGAGC，選擇一序列作為長度為15bp的序列(SEQIDNO:19);選取副溶血弧菌基因組中的一段DNA序列(堿基序列如SEQIDNO:1所示)，利用軟件BioToolKit320(ChangBioscienceInc.)中的Randomizer程序進(jìn)行DNA序列的隨機(jī)重排，最后通過GenBank數(shù)據(jù)庫中的blastn軟件進(jìn)行同源性匹配分析，選取與5種食源性致病菌均無同源性的一條DNA序列作為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)；所述五種目的基因具體為堿基序列分別如SEQIDNO:37所示的基因;制備堿基序列如SEQIDNO:817所示的10條引物；步驟二，采用常規(guī)多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)構(gòu)建方法，利用步驟一所得的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列、長度為15bp的序列以及堿基序列如SEQIDNO:817所示的10條序列構(gòu)建結(jié)果如下的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)1054F—15bp—hlyAF—15bp—PrsF—15bp—PSF--15bp--SAlF--擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列--SAlR--15bp--hlyAR—15bp—PSR—-15bp—PrsR—15bp—1054R;(見圖1)用重組法(詳見BastoAP，PortugalRS，NixRJ，CartaxeiroC，BoinasF，DixonLK，LeitaoA，MartinsC.DevelopmentofanestedPCRanditsinternalcontrolforthedetectionofAfricanswinefevervirus(ASFV)inOrnithodoroserraticus.ArchivesofVirology,2006，151:819826.)(BastoAP，PortugalRS，NixRJ，CartaxeiroC，BoinasF，DixonLK，LeitaoA，MartinsC.添力口有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的檢測嬰鳥鵡病中非洲豬瘟病毒(ASFV)巢式PCR方法的建立，病毒學(xué)文獻(xiàn)，2006，151:819826.)構(gòu)建多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，將5對特異檢測引物按如下順序連接到擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的兩端，在引物與引物間分別插入長度為15bpDNA序列，既有利于使所構(gòu)建的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)與被檢的5種食源性致病菌無同源性，又有利于使多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增片段大小大于各特異檢測引物的目的產(chǎn)物，同時也有利于在瓊脂糖凝膠電泳圖上能明顯地與目的產(chǎn)物區(qū)分開來，最終得到堿基序列如SEQIDN0:2所示的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)。實(shí)施例2模板DNA的靈敏度測定多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)及5種食源性致病菌純培養(yǎng)各自總基因組DNA的定量測定多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)和5種食源性致病菌純培養(yǎng)的各自總基因組DNA，經(jīng)DU-800紫外分光光度計(BeckmanCoulter)測量，其含量分別為369.8ng/yL(多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo))、1150.Ong/iiL(副溶血弧菌ATCC33846)、474.9ng/iiL(大腸桿菌0157:H7ATCC43889)、56.Ong/yL(單核細(xì)胞增生李斯特菌ATCCBAA-751)、925.8ng/PL(鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028)、55.Ong/iiL(金黃色葡萄球菌ATCC27664)。根據(jù)計算公Ncopies/iiL=PCR片段的質(zhì)量(g/iiL)/(660g/molX堿基數(shù))X(6.023X1023)可以得到1PL多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的拷貝數(shù)為1.13X10"copies;(1)未添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)時的檢測靈敏度將上述經(jīng)過測定的5種食源性致病菌各自總的DNA溶液用無菌水作10倍梯度稀釋，如副溶血弧菌從115ng/iiL1.15fg/iiLDNA溶液中分別取5iiL加入20iiLPCR反應(yīng)體系(20iiL反應(yīng)體系的組分為10iiM的上下游引物各0.5iiL，2.5mMdNTPl.OyL，25mMMg2+1.5iiL，2.5U/yLTaqDNA聚合酶(天根生化科技(北京)有限公司)0.4yL，10XBuffer2.0yL，最后以無菌水補(bǔ)足。PCR循環(huán)參數(shù)在94。C預(yù)變性5min，接著做35個擴(kuò)增循環(huán)，每個循環(huán)包括94。C變性30s，58。C退火30s，72。C延伸30s，所有循環(huán)結(jié)束后，在72°C延伸10min，最后保持在12°C)，使每個PCR反應(yīng)體系分別含DNA的濃度為28.8ng/yL，2.88ng/iiL，288pg/iiL，28.8pg/iiL，2.88pg/iiL，288fg/iiL，28.8fg/iiL，2.88fg/iiL，0.288fg/iiL。擴(kuò)增結(jié)果如圖2C所示，只是含0.288fg/yLDNA的PCR反應(yīng)體系沒有目標(biāo)序列擴(kuò)增帶，而其他PCR反應(yīng)體系均有目標(biāo)序列擴(kuò)增帶。因此，其檢測靈敏度為2.88fg/L。同理測定其他4種食源性致病菌的檢測靈敏度，從圖3C、圖4C、圖5C以及圖6C可知，其余各病菌的檢測靈敏度分別為11.8fg/iiL(大腸桿菌0157:H7)、14fg/iiL(單核細(xì)胞增生李斯特菌)、2.32fg/PL(沙門氏菌)及13.8fg/iiL(金黃色葡萄球菌)。(2)添加多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)后的檢測靈敏度多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)先用無菌水作10倍梯度稀釋，從1.13X10opies/yL1.13X102COpieS/iiL。利用(1)中PCR檢測體系，分別加入多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)，研究多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)對靈敏度的影響。在分別對副溶血弧菌、大腸桿菌0157:H7、單核細(xì)胞增生李斯特菌和沙門氏菌進(jìn)行PCR檢測時，當(dāng)PCR反應(yīng)體系添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的量為1.13X105copies/iiL時，均不會影響它們檢測的靈敏度，同時均能達(dá)到指示假陰性的作用(如圖2C、圖3C、圖4C、圖5C所示)。而在檢測金黃色葡萄球菌時，添加的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的量為1.13X106COpieS/iiL時才能達(dá)到指示假陰性的作用，同時也不影響其檢測靈敏度(如圖6C)。圖2為引物1054的特異性實(shí)驗電泳圖；圖中，A:未添加IAC時，引物1054的特異性實(shí)驗電泳圖，圖中，泳道1:VibrioparahaemolyticusATCC33846;泳道2:VibrioparahaemolyticusATCC17802;泳道312:Vibrioparahaemolyticusisolatedstrains;泳道13:SGL;泳道14:Vibrioalginolyticus;泳道15:VibriovulnificuATCC27562;泳道16:VibriocampbeffiATCC33863;泳道17:Vibriodamsela;泳道18:VibrioharveyiATCC33842;泳道:19:VibriofluvialisATCC33810;泳道20:Vibrioanguilla進(jìn)；泳道21:VibriomimicusATCC33653;泳道22:VibriocholeraeATCC25871;泳道23:SalmonellatyphimuriumATCC14028;N:negativecontrol;M:lOObpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。B:添加IAC時，引物1054的特異性實(shí)驗電泳圖，圖中，泳道1:7VibrioparahaemolyticusATCC33846;泳道2:VibrioparahaemolyticusATCC17802;泳道312:Vibrioparahaemolyticusisolatedstrains;泳道13:SGL;泳道14:Vibrioalginolyticus;泳道15:VibriovulnificuATCC27562;泳道16:VibriocampbeffiATCC33863;泳道17:Vibriodamsela;泳道18:VibrioharveyiATCC33842;泳道:19:VibriofluvialisATCC33810;泳道20:Vibrioanguilla進(jìn)；泳道21:VibriomimicusATCC33653;泳道22:VibriocholeraeATCC25871;泳道23:SalmonellatyphimuriumATCC14028;N:negativecontrol;M:100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。C:未添加IAC與添加IAC時，引物1054的靈敏度實(shí)驗電泳圖，圖中，泳道19:每個PCR反應(yīng)中所含有的模板DNA濃度分別為28.8ng/yL，2.88ng/yL，288pg/iiL，28.8pg/iiL，2.88pg/iiL，288fg/iiL，28.8fg/iiL，2.88fg/iiL，0.288fg/iiL;N:negativecontrol;M:100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖3引物hlyA的特異性實(shí)驗電泳圖；圖中，A:未添加IAC時，引物hlyA的特異性實(shí)驗電泳圖，圖中，泳道1Escherichiacoli0157:H7ATCC43889;泳道2-SalmonellatyphimuriumATCC14028;泳道3:Listeri咖onocytogenesATCC7644;泳道4:Staphylococcusaureaus0114;泳道5:VibriocholeraeATCC25871;泳道6:HemoclasticEscherichiacoli;泳道7:BacillussubtilisATCC6633;泳道8-KlebsiellapneumoniaATCC27336;泳道9:ShigellaflexneriCMCC51311;泳道1017-Escherichiacoliisolatedstrains;泳道18:PseudomonasaeruginosaCDCB32116;泳道19:EnterobactercloacaeATCC700323;泳道20:ProteusmirabilisATCC12453;泳道21:EnterococcusaviumATCC14025;泳道22-MicrococcusluteusATCC9341;泳道23:SerratiamarcescensATCC27592;N:negativecontrol;M:100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。B:添加IAC時，引物hlyA的特異性實(shí)驗電泳圖，圖中，泳道1-Escherichiacoli0157:H7ATCC43889;泳道2-SalmonellatyphimuriumATCC14028;泳道3:Listeri咖onocytogenesATCC7644;泳道4:Staphylococcusaureaus0114;泳道5:VibriocholeraeATCC25871;泳道6:HemoclasticEscherichiacoli;泳道7:BacillussubtilisATCC6633;泳道8-KlebsiellapneumoniaATCC27336;泳道9:ShigellaflexneriCMCC51311;泳道1017-Escherichiacoliisolatedstrains;泳道18:PseudomonasaeruginosaCDCB32116;泳道19:EnterobactercloacaeATCC700323;泳道20:ProteusmirabilisATCC12453;泳道21:EnterococcusaviumATCC14025;泳道22-MicrococcusluteusATCC9341;泳道23:SerratiamarcescensATCC27592;N:negativecontrol;M:100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。C:未添加IAC與添加IAC時，引物hlyA的靈敏度實(shí)驗電泳圖，圖中，泳道19:每個PCR反應(yīng)中所含有的模板DNA濃度分別為11.8ng/yL，1.18ng/yL，118pg/iiUl.8pg/iiL，1.18pg/iiU18fg/iiUl.8fg/iiL，1.18fg/iiL，O.118fg/iiL;N:negativecontrol;M:100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖4引物Prs的特異性實(shí)驗電泳圖；圖中，A:未添加IAC時，引物Prs的特異性實(shí)驗電泳圖，圖中，泳道1:ListeriamonocytogenesATCC21-AB;泳道2:ListeriamonocytogenesATCC7644;泳道3:ListeriamonocytogenesATCC27708;泳道4:ListeriamonocytogenesATCC54002;泳道5-ListeriamonocytogenesATCCBAA-751;泳道6-ListeriamonocytogenesATCC15313;泳道7-ListeriamonocytogenesATCC13932;泳道812-Listeriamonocytogenesisolatedstrains;泳道1315-Listeriaspp.;泳道16:SalmonellatyphimuriumATCC14028;泳道17Staphylococcusaure雄0114;泳道18-KlebsiellapeneumoniaeATCC27336;泳道19-ShigellaflexneriCMCC51311;泳道20:EnterococcusfaecalisATCC49452;泳道21:HemoclasticEscherichiacoli;泳道22:Vibrioalginolyticus;泳道23:VibriomimicusATCC33653;N:negativecontrol;M:100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。B:添加IAC時，引物Prs的特異性實(shí)驗電泳圖，圖中，泳道1:ListeriamonocytogenesATCC21-AB;泳道2:ListeriamonocytogenesATCC7644;泳道3:ListeriamonocytogenesATCC27708;泳道4:ListeriamonocytogenesATCC54002;泳道5:ListeriamonocytogenesATCCBAA-751;泳道6:ListeriamonocytogenesATCC15313;泳道7:ListeriamonocytogenesATCC13932;泳道812:Listeriamonocytogenesisolatedstrains;泳道1315丄isteriaspp.;泳道16:SalmonellatyphimuriumATCC14028;泳道17-Staphylococcusaureaus0114;泳道18-KlebsiellapeneumoniaeATCC27336;泳道19-ShigellaflexneriCMCC51311;泳道20:EnterococcusfaecalisATCC49452;泳道21:HemoclasticEscherichiacoli;泳道22:Vibrioalginolyticus;泳道23:VibriomimicusATCC33653;N:negativecontrol;M:100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。C:未添加IAC與添加IAC時，引物Prs的靈敏度實(shí)驗電泳圖，圖中，泳道19:每個PCR反應(yīng)中所含有的模板DNA濃度分別為1.4ng/yL，140pg/yL，14pg/yL，1.4pg/iiL，140fg/iiL，14fg/iiL，1.4fg/iiL，0.14fg/iiL，0.014fg/iiL;N:negativecontrol;M:100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖5引物PS的特異性實(shí)驗電泳圖；圖中，A:未添加IAC時，引物PS的特異性實(shí)驗電泳圖，圖中，泳道1:SalmonellatyphimuriumATCC14028;泳道2:SalmonellatyphimuriumATCC13311;泳道3:SalmonellaarizonaeATCC13314;泳道4:SalmonellaparatyphibCMCC50004;泳道5:SalmonellaparatyphicCMCC50017;泳道6:SalmonellaenteritidisATCC13076;泳道7-SalmonellavelloreATCC15611;泳道8-SalmonellaTallahasseeATCC12002;泳道9:SalmonellaAbaetetubaCMCC51812;泳道10:SalmonellacholeraesuisATCC10708;泳道11:SalmonellaInfantisCMCC51741;泳道12:SalmonellatyphiCMCC50098;泳道13丄isteriamonocytogenesATCC7644;泳道14-Staphylococcusaureaus0114;泳道15:BacillussubtilisATCC6633;泳道16-KlebsiellapneumoniaATCC27336;泳道17:SerratiamarcescensATCC27592;泳道18-ShigellaflexneriCMCC51311;泳道19:VibriocholeraeATCC25871;泳道20:CitrobacterfreundiiATCC8090;泳道21:EnterococcusfaeciumATCC27270;泳道22:PseudomonasaeruginosaCDCB32116;泳道23:VibriomimicusATCC33653;N:negativecontrol;M:100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。B:添加IAC時，引物PS的特異性實(shí)驗電泳圖，圖中，泳道1:SalmonellatyphimuriumATCC14028;泳道2:SalmonellatyphimuriumATCC13311;泳道3:9SalmonellaarizonaeATCC13314;泳道4-SalmonellaparatyphibCMCC50004;泳道5:SalmonellaparatyphicCMCC50017;泳道6:SalmonellaenteritidisATCC13076;泳道7-SalmonellavelloreATCC15611;泳道8-SalmonellaTallahasseeATCC12002;泳道9:SalmonellaAbaetetubaCMCC51812;泳道10:SalmonellacholeraesuisATCC10708;泳道11:SalmonellaInfantisCMCC51741;泳道12:SalmonellatyphiCMCC50098;泳道13丄isteri咖onocytogenesATCC7644;泳道14-Staphylococcusaureaus0114;泳道15:BacillussubtilisATCC6633;泳道16-KlebsiellapneumoniaATCC27336;泳道17:SerratiamarcescensATCC27592;泳道18-ShigellaflexneriCMCC51311;泳道19:VibriocholeraeATCC25871;泳道20:CitrobacterfreundiiATCC8090;泳道21:EnterococcusfaeciumATCC27270;泳道22:PseudomonasaeruginosaCDCB32116;泳道23:VibriomimicusATCC33653;N:negativecontrol;M:100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。C:未添加IAC與添加IAC時，引物PA的靈敏度實(shí)驗電泳圖，圖中，泳道19:每個PCR反應(yīng)中所含有的模板DNA濃度分別為23.2ng/yL，2.32ng/yL，232ng/yL，23.2pg/iiL，2.32pg/iiL，232fg/iiL，23.2fg/iiL，2.32fg/iiL，0.232g/iiL;N-negativecontrol;M:100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖6引物SA1的特異性實(shí)驗電泳圖；圖中，A:未添加IAC時，引物SA1的特異性實(shí)驗電泳圖，圖中，泳道1:St即hylococcusaureausB272;泳道2-StaphylococcusaureausC209;泳道3:StaphylococcusaureausC299;泳道4-StaphylococcusaureausD184;泳道5:StaphylococcusaureausF104;泳道6-StaphylococcusaureausG064;泳道7:StaphylococcusaureausL022;泳道8-StaphylococcusaureausATCC27664;泳道9-StaphylococcusaureausL103;泳道10-Staphylococcusaureaus0114;泳道11:StaphylococcusaureausQ153;泳道12-StaphylococcusaureausQ236;泳道13:VibrioparahaemolyticusATCC17802;泳道14:Salmonellatyphimuri咖ATCC14028;泳道15:ListeriamonocytogenesATCC7644;泳道16-Escherichiacoli0157:H7ATCC43889;泳道17:VibriocholeraeATCC25871;泳道18:HemoclasticEscherichiacoli;泳道19:EnterobactersakazakiiATCC29544;泳道20:BacillussubtilisATCC6633;泳道21:KlebsiellapneumoniaATCC27336;泳道22-ShigellaflexneriCMCC51311;泳道23:VibriovulnificusATCC27562;N:negativecontrol;M:100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。B:添加IAC時，引物SA1的特異性實(shí)驗電泳圖，圖中，泳道1:St即hylococcusaureausB272;泳道2-StaphylococcusaureausC209;泳道3-StaphylococcusaureausC299;泳道4-StaphylococcusaureausD184;泳道5-StaphylococcusaureausF104;泳道6-StaphylococcusaureausG064;泳道7-StaphylococcusaureausL022;泳道8-StaphylococcusaureausL029;泳道9-StaphylococcusaureausL103;泳道10:Staphylococcusaureaus0114;泳道11-StaphylococcusaureausQ153;泳道12:StaphylococcusaureausQ236;泳道13:VibrioparahaemolyticusATCC17802;泳道14:SalmonellatyphimuriumATCC14028;泳道15-ListeriamonocytogenesATCC7644;泳道16-Escherichiacoli0157:H7ATCC43889;泳道17:VibriocholeraeATCC25871;泳道18:HemoclasticEscherichiacoli;泳道19:Enterobacte:rsakazakiiATCC29544;泳道20:BacillussubtilisATCC6633;泳道21-KlebsiellapneumoniaATCC27336;泳道22-ShigellaflexneriATCC27336;泳道23:VibriovulnificusATCC27562;N-negativecontrol;M:100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。C:未添加IAC與添加IAC時，引物SA1的靈敏度實(shí)驗電泳圖，圖中，泳道19:每個PCR反應(yīng)中所含有的模板DNA濃度分別為1.38ng/yL，138pg/yL，13.8pg/iiL，1.38pg/iiL，138fg/iiL，13.8fg/iiL，1.38fg/iiL，0.138fg/iiL，0.0138fg/iiL;N:negativecontrol;M:100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例3特異性檢測對副溶血弧菌進(jìn)行PCR檢測時，將多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)添加到PCR檢測體系中，所有副溶血弧菌陽性菌株均可擴(kuò)增到一條451bp大小的目的產(chǎn)物(在目的模板濃度較低時也能擴(kuò)增出688bp的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo))，而非副溶血弧菌的陰性菌株則只能擴(kuò)增到688bp大小的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)(如圖2B)。類似地，對大腸桿菌0157:H7進(jìn)行PCR檢測時，所有陽性菌株都能擴(kuò)增到363bp的目的產(chǎn)物(在目的模板濃度較低時也能擴(kuò)增出546bp的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo))，而所有陰性菌株就只能擴(kuò)增出一條546bp大小的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)(如圖3B);對單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)行PCR檢測時，陽性菌株能擴(kuò)增到370bp的目的產(chǎn)物(在目的模板濃度較低時也能擴(kuò)增出583bp的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo))，但陰性菌株就只能擴(kuò)增到583bp大小的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)(如圖4B);對沙門氏菌進(jìn)行PCR檢測時，所有陽性菌株的進(jìn)行PCR擴(kuò)增后都能得到362bp大小的目的產(chǎn)物(在目的模板濃度較低時也能擴(kuò)增出509bp的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo))，陰性菌株卻只能擴(kuò)增到509bp大小的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)(如圖5B);對金黃色葡萄球菌進(jìn)行PCR檢測時，其陽性菌株的PCR產(chǎn)物中都有一條203bp大小的目的產(chǎn)物(在目的模板濃度較低時也能擴(kuò)增出404bp的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo))，而非金黃色葡萄球菌的其他陰性菌株的PCR產(chǎn)物就只有404bp大小的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)(如圖6B)。實(shí)施例4抗干擾檢測(1)基因組DNA水平的抗干擾實(shí)驗分別提取副溶血弧菌(VibrioparahaemolyticusATCC33846)、美人魚弧菌(Vibriodamsela)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)、SGL(—種淡水弧菌)、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)和河流弧菌(Vibriofluvialis)基因組DNA，并測定他們各自的初始濃度，測定結(jié)果分別為1.20X103ng/yL、6.85X102ng/yL、1.22X103ng/iiL、4.34X102ng/iiL、5.25X102ng/iiL、4.84X102ng/iiL和2.21X102ng/PL。然后再對所有的基因組DNA分別作10倍梯度稀釋至10—s，再取各干擾菌(即非副溶血弧菌)基因組DNA高(單一干擾菌時高濃度是指102103叫；五種干擾菌時高濃度是指2.3i!g)、中(單一干擾菌時中濃度是指20102ng;五種干擾菌時中濃度是指234.7ng)、低三個濃度(單一干擾菌時低濃度是指120ng;五種干擾菌時低濃度是指23.4ng)分別加入到PCR檢測體系中，再進(jìn)行靈敏度實(shí)驗，擴(kuò)增結(jié)果如表1所示。表1副溶血弧菌基因組DNA水平上的抗干擾實(shí)驗的PCR檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注+陽性結(jié)果；-陰性結(jié)果。[OOSS](2)純培養(yǎng)物水平的抗干擾實(shí)驗將溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌和哈維氏弧菌作為干擾菌，以檢測對副溶血弧菌的菌落靈敏度的影響。從甘油管中取溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌，分別接入5mlLB液體培養(yǎng)基中，在37t:中培養(yǎng)8h，然后用滅菌的生理鹽水分別作IO倍梯度稀釋至10—1Q，并取lmL稀釋度為10—6、10—7和10—8的菌液作平板計數(shù)，計算溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌各自純培養(yǎng)的起始濃度。經(jīng)計算溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌各自的起始濃度分別為3.OX108CFU/mL、4.8X109CFU/mL、3.6X109CFU/mL和1.6X109CFU/mL。分別取lmL副溶血弧菌10—\10—2、10—3、10—4、10—5、10—6、10—7、10—8、10—9及10—"1的稀釋菌液加入到裝有6mlLB液體培養(yǎng)基的PA瓶中，并再作兩組重復(fù)，然后，再分別取lmLNX104、NX106和NX108CFU/mL的溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌與哈維氏弧菌的菌懸液分別加入到3組PA瓶中(如圖7所示)。將PA瓶中的菌液與培養(yǎng)基混勻后，從每個PA瓶里取lmL菌體混合液放入1.5mL已滅菌的離心管中，10000rpm離心5min，倒掉上清，加入lOOOyL無菌水，在沸水中煮10min，立即放入_20"冰凍直至完全結(jié)冰，4"解凍，12000rpm離心5min，取5PL上清液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后，再將3組所有的PA瓶均放于37t:搖床上，以150rpm進(jìn)行增菌培養(yǎng)，并每隔2h取lmL混合液，進(jìn)行上述相同處理，之后再進(jìn)行PCR檢測。PCR檢測結(jié)果表明，干擾菌對副溶血弧菌的菌落靈敏度幾乎不產(chǎn)生干擾作用，但在增菌過程中有一段時間會有干擾作用(增菌時間為2h、8h時，干擾菌濃度為NX106和NX108CFU/mL時會出現(xiàn)干擾現(xiàn)象)。實(shí)施例5準(zhǔn)確率評價(1)人工污染樣品的檢測人工污染樣品的制備先將約含107CFU/mL的副溶血弧菌ATCC33846接入養(yǎng)有蠔的水中，接著做兩組平行，分別用不同的處理方式對染菌后的樣品進(jìn)行處理，一組是通過添加消毒劑的方法進(jìn)行處理(取樣時間為處理后30min、60min);另一組是通過凈化的方式進(jìn)行處理(取樣時間為處理后12h、24h)。然后從處理前與處理后的樣品各取25g樣，分別進(jìn)行勻質(zhì)，再各取勻漿液lmL，低速離心，將上清稀釋到合適的濃度進(jìn)行平板計數(shù)，計算樣品起始帶菌量，結(jié)果見表2。表2人工污染相關(guān)數(shù)據(jù)及PCR檢查結(jié)果取樣批次起始染菌CFU/mU污染后的處理方式處理時間處理后帶菌量(CFU/mL)以上清液為模板進(jìn)行PCR檢測的結(jié)果Oh2h4h6h8h10h12h第一次3.5X10'未進(jìn)行處理Omin3.5X107+++++++第二次3.5X10'添加消毒劑30min6X105F++++++第三次3.5X10'添加消毒劑60min8X104FF+++++第四次3.5X10'凈化處理12h3X104FFF+FFF第五次3.5X10'凈化處理24h4X104FFF+FFF注+陽性結(jié)果；F假陰性結(jié)果。人工污染樣品的增菌及樣品中副溶血弧菌DNA的提取采集人為污染嚴(yán)重的海產(chǎn)品_蠔，從處理前后的樣品中各取25g，分別進(jìn)行勻質(zhì)，再將各勻漿物各自移入225mL的3%NaCl2堿性蛋白胨水(APW)液體培養(yǎng)基中，混勻后均取lmL放入l.5mL的離心管中，將其余的混合物放在37t:的搖床(150r/min)中增菌，并且在增菌后每2h取樣一次，每次取樣lmL，放入1.5mL離心管中，在沸水浴中煮30min，從沸水浴中取出后，立即在2(TC放置30min。在37t:解凍后，3000r/min離心2min，沉淀培養(yǎng)物中的食品殘渣。取上清液，12000r/min離心5min，上清液為PCR模板DNA溶液，分別取2yL加入PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR檢測，同時以無菌水代替DNA模板作陰性對照。人工污染樣品的檢測靈敏度人工污染的食品樣品蠔，按上述方法處理后結(jié)果14顯示起始染菌量為3.5X107CFU/mL;經(jīng)消毒劑處理30min和60min后，樣品帶菌量分別降至6X105CFU/mL和8X104CFU/mL;經(jīng)凈化處理12h和24h后，樣品帶菌量則分別降到3X104CFU/mL和4X104CFU/mL。進(jìn)行添加有IAC的PCR檢測，第一次取的樣(即不經(jīng)任何處理，染菌后直接取的樣)，增菌培養(yǎng)Oh后進(jìn)行PCR檢測就可被檢出，第二次取的樣(即經(jīng)消毒劑處理30min后取的樣)，增菌培養(yǎng)2h后進(jìn)行PCR檢測即可被檢出，第三次取的樣(即經(jīng)消毒劑處理60min后所取的樣)，增菌培養(yǎng)4h后進(jìn)行PCR檢測也可被檢出，而第四、五次取的樣(分別為經(jīng)凈化處理12h后取的樣及經(jīng)凈化處理24h后取的樣)，盡管直接以原液為模板時，增菌培養(yǎng)4h及6h以上仍檢測不出，但將樣品經(jīng)過稀釋處理再進(jìn)行PCR檢測，則可被檢出，所以五次取的樣品在增菌培養(yǎng)4h均可被檢出，PCR檢測結(jié)果如表2所示。從表2中PCR檢測結(jié)果中可以看出有20份為陽性，15份為假陰性。出現(xiàn)假陰性的樣品的DNA溶液經(jīng)過稀釋后(稀釋10X處理)，再次進(jìn)行檢測，假陰性樣品顯示為11陽性結(jié)果，4份仍為假陰性結(jié)果。這說明從上述7份假陰性樣品中提取得到的模板DNA溶液中存在PCR抑制因子，而4份仍為假陰性的結(jié)果說明其所含的抑制因子濃度很高；將PCR檢測結(jié)果仍為假陰性的4份樣品DNA溶液進(jìn)一步稀釋，其結(jié)果為陰性，這可能是由于稀釋后，濃度過低，達(dá)不到檢測靈敏度。(2)實(shí)際食品樣品的檢測采集106份水產(chǎn)品食品樣品，每份取25g，移入225mL的APW(含3%NaCl)液體培養(yǎng)基中，37t:的搖床(150r/min)中增菌10h。用煮沸法提取DNA進(jìn)行添加IAC的PCR檢測，檢測結(jié)果中有55份為陽性，43份陰性，8份為假陰性。出現(xiàn)假陰性的樣品經(jīng)過稀釋DNA處理后，再次進(jìn)行檢測，假陰性樣品2份為陽性結(jié)果，6份為陰性結(jié)果。這說明從這2份假陰性樣品中提取得到的模板DNA溶液中存在PCR反應(yīng)的抑制因子?？梢?，本實(shí)施例涉及的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列在進(jìn)行大量樣品檢測時確實(shí)能夠指示假陰性，提高了檢測的準(zhǔn)確率。序列表〈110〉上海交通大學(xué)〈120〉食源性致病菌PCR檢測中的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列及其制備方法〈130>10008〈160>19〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>360〈212>DNA〈213〉副溶血弧菌〈400>1tegttcttctaacacccgactctctttccctttetttecatcacgtegcaatecacgcat60cggcgtegctttegggtecaagacttcagcctctectgtetcaccattcactegagccat120atcaaaacctgacaccccaaatetcacgctaaacgcggaacgtttetgctcttctgcaaa180ctcacatgcaatttctgggtctcgtgaggttgateaatetgcaggatcaactccaaattc240gccttctgcaaccgacccaaacgcatctctteatcgagaacctcteteagtttttgtcaa300tecatcteatggctctttcgccaccgcttttgateaacctatetccagteattgctccgc36015〈210>2〈211>688〈212>DNA〈213>artificial〈220〉〈223〉人工序列〈400>2ggtgtctttccaatcctttccttte皿ggactggccagteggg皿gcg皿c卿gctgtg60ttecc朋gaggctg朋gagaagcteacgttggagtectgtcaccgtggtc120cagtttecacctg朋gtetggtctetttgctgtetteggtggcggcgccatcccctetct180actttgccccggtcatctttttgaatcactggtctettecactegttg皿皿tgcgttgg240tcgcatcteggteacgccatttttcattctcctcctegac300ttetgtegcaatcactgtgtgatcgtcgcatccateatctttttegcaccttcagaaact3603gC3C3朋Ct3C3Ctg朋C3atgaccgtcagteatgaccgcttccagaacccttcccacc420ttcgagtttctgatcatetcttgttectcaateattg皿cctccatcacggccg皿cgte■tcag朋3tcg3gctec朋cagggttcttecactcteaatgtctcggttegtcggaagtct540ttecgggteggtetgcactecgcttcaggc3C3Cgg3gCttg皿gagttctgtcaccatt600ggtgatggtcttgtcgtegacttcggctegaccgcaaatccaaggtttctttgcagacat660gtttggaccgctecagttgttcgatecc688〈210>3〈211>1842〈212>DNA〈213〉副溶血弧菌〈400>3ttetttgttcttecctttgcctggtga卿cccgccagaaattgcagcgc60cacagtcaccattgctgtcgacgteacattaccgctggtgatcgtetegcteaagctgtc120ttgattcttgaatcgcttcgctggcgtgtettggatectcgtegcttcac180cgttcctttectcggtgcgctcattgctgagatctcgacagacacaccatcagc^tgat240gtcatteccctggtteccgttgaaactttgctcatctgaacgttetcgtc300aaccgccacgtgcccgtttgctgctcagcaacggcatecgttgcttgtgt360cgccacgttgtea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AIF—擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列一SA1R一15bp—hlyAR—15bp—PSR—-15bp—PrsR—15bp—1054R。全文摘要一種檢疫
技術(shù)領(lǐng)域：
的食源性致病菌PCR檢測中的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列及其制備方法；所述食源性致病菌PCR檢測中的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列的堿基序列如下1054F-15bp-hlyAF-15bp-PrsF-15bp-PSF-15bp-SA1F-擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列-SA1R-15bp-hlyAR-15bp-PSR-15bp-PrsR-15bp-1054R；所述多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列的制備方法包括如下步驟隨機(jī)重排SEQIDNO1所示的堿基序列，得到相應(yīng)的核酸，選取與所要檢測的五種目的基因無同源性的核酸作為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列；隨機(jī)重排堿基序列ATTTCCAAGGTGAGC，選擇任一序列作為長度為15bp的序列；采用常規(guī)多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)構(gòu)建方法，利用步驟一所得的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)序列、長度為15bp的序列以及堿基序列如SEQIDNO8～17所示的10條序列構(gòu)建得到多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)。使用本發(fā)明的多重擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)可使PCR檢測結(jié)果能指示假陰性的發(fā)生，提高PCR檢測的準(zhǔn)確率。文檔編號C12N15/11GK101717829SQ201010300888公開日2010年6月2日申請日期2010年1月28日優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日發(fā)明者何曉華,劉斌,史賢明,施春雷申請人:上海交通大學(xué)