一種食源性致病菌dna的階段控溫快速提取方法
【專利摘要】本發(fā)明一種食源性致病菌DNA的階段控溫快速提取方法。本發(fā)明方法將菌液離心、收集菌體，通過(guò)洗滌緩沖液洗滌后，加入裂解液快速油浴裂解，再水浴處理，離心取上清液即為模板DNA。使用本方法提取的DNA純度OD260/OD280為1.6-1.8，能夠滿足PCR、熒光PCR以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)食源性致病菌進(jìn)行分子檢測(cè)的要求。本發(fā)明方法綜合運(yùn)用了階段控溫對(duì)細(xì)胞裂解、去除蛋白質(zhì)等抑制劑從而釋放出DNA，操作簡(jiǎn)單，時(shí)間短，且無(wú)需特殊實(shí)驗(yàn)儀器及試劑，實(shí)驗(yàn)成本低。
【專利說(shuō)明】一種食源性致病菌DNA的階段控溫快速提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及食源性致病菌DNA的快速提取方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 食品安全問(wèn)題一直是各國(guó)政府和人民群眾最為關(guān)心的問(wèn)題，由食源性致病菌引起 的食源性疾病是影響食品安全的最主要的因素之一。在HACCP體系的建立和實(shí)施過(guò)程中， 致病性病原微生物一直是各類食品加工行業(yè)控制的重點(diǎn)。
[0003] 食源性致病菌是引起細(xì)菌性食物中毒的病原菌。食源性致病菌多達(dá)幾十種，主要 有金黃色葡萄球菌，沙門氏菌，志賀氏菌和副溶血性弧菌、大腸桿菌、單核增生李斯特菌、肉 毒桿菌等。食源性致病菌對(duì)人體健康的影響主要是指微生物本身及其代謝過(guò)程、代謝產(chǎn)物 對(duì)食品原料、加工過(guò)程和產(chǎn)品的污染，這種污染會(huì)對(duì)食品消費(fèi)者的健康造成損害。
[0004] 傳統(tǒng)的食源性致病菌的分離培養(yǎng)檢測(cè)方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，需要4-7d，且操作步驟繁 瑣、特異性差。因此建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)來(lái)檢測(cè)食源性致病菌顯得尤為重要，聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)等分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)因其特異性和靈敏度高而被廣泛采用。而PCR 檢測(cè)技術(shù)的第一步就是模板DNA的制備，即樣品中DNA的提取，直接影響著PCR反應(yīng)的結(jié) 果。長(zhǎng)期以來(lái)，樣品中DNA的提取和純化一直是耗時(shí)、繁瑣的過(guò)程，嚴(yán)重減慢了檢測(cè)速度。因 此，建立一種快速的DNA提取方法對(duì)提高PCR檢測(cè)效率起著至關(guān)重要的作用。
[0005] 本【技術(shù)領(lǐng)域】所熟知的DNA提取方法主要有十六烷基三甲基溴化銨（CTAB)、試劑盒 方法等。CTAB方法提取的DNA純度，為1. 8左右，應(yīng)用較廣泛，但其操作步驟繁瑣，長(zhǎng)達(dá)8步， 且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用到苯酚氯仿等有毒試劑，而試劑盒方法因其提取的DNA純度高達(dá)1. 8-2. 0， 是目前應(yīng)用最為廣泛的一種方法，但其操作耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)l_2h。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有DNA提取耗時(shí)長(zhǎng)、步驟多的難題，提供了一種快速提 取食源性致病菌DNA的方法，且提取的DNA質(zhì)量滿足后續(xù)檢測(cè)方法要求，從而加快了食源性 致病菌的檢測(cè)速度，以便更好地為食源性疾病的預(yù)防和控制提供幫助。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是按以下步驟進(jìn)行：
[0008] (a)取食品樣品10_25g(mL)或致病菌菌株至適宜液體培養(yǎng)基制備培養(yǎng)液，然后取 l-5mL細(xì)菌培養(yǎng)液，8000-12000rmp離心l-4min，使細(xì)菌細(xì)胞沉淀，棄上清；
[0009] (b)往步驟（a)制得的的菌體沉淀中加入100-500UL無(wú)菌雙蒸水，充分混合， 8000-12000rmp 離心 l_4min，棄上清；
[0010] (c)往步驟（b)制得的細(xì)菌沉淀中加入100-500uL細(xì)胞裂解液，懸浮細(xì)菌沉淀，并 于 105°C _126°C油浴 10s-3min ;
[0011] (d)將步驟（C)所得的混合液移至70°C -95°c水浴5-30min ;
[0012] (e)步驟（d)結(jié)束后，8000-12000rmp離心l-4min取上清，上清液即為模板DNA，對(duì) 提取所得DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，剩余DNA于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0013] 現(xiàn)有技術(shù)中的DNA提取方法耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)，本發(fā)明方法綜合運(yùn)用了水浴及油浴 進(jìn)行階段控溫，通過(guò)裂解液裂解細(xì)胞，從而快速的獲取DNA，整個(gè)提取過(guò)程不到40min，簡(jiǎn)單 有效。本方法不需要特別的實(shí)驗(yàn)儀器及試劑，成本相對(duì)較低。使用本方法提取的DNA樣品 濃度在50-400ng/uL，所得的DNA純度即0D260/0D280的比值為1. 6-1. 8.且所得的DNA質(zhì) 量可以滿足普通PCR、熒光PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等檢測(cè)方法的要求。
[0014] 表1金黃色葡萄球菌DNA濃度及純度
[0015]

【權(quán)利要求】
1. 一種食源性致病菌DNA的階段控溫快速提取方法，該方法包括如下步驟： (a) 取l-5mL食源性致病菌培養(yǎng)液，8000-12000rmp離心l-4min，使細(xì)菌細(xì)胞沉淀，棄上 清； (b) 往步驟（a)制得的菌體沉淀中加入100-500uL無(wú)菌雙蒸水，充分混合， 8000-12000rmp 離心 l_4min，棄上清； (c) 往步驟（b)制得的細(xì)菌沉淀中加入100-500uL細(xì)胞裂解液，懸浮細(xì)菌沉淀，并于 105°C _126°C油浴 10s-3min ; (d) 將步驟（c)所得的混合液立即移至70°C -95°C中水浴5-30min ; (e) 步驟（d)結(jié)束后，8000-12000rmp離心l-4min取上清，上清液即為模板DNA，對(duì)提取 所得DNA用于分析檢測(cè)，剩余DNA于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的食源性致病菌包括金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、單 核增生李斯特菌、副溶血性弧菌等。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述步驟（a)中，細(xì)胞培養(yǎng)液為取食品樣品10-25g(mL)或致病菌菌 株至適宜液體培養(yǎng)基，于最適培養(yǎng)溫度培養(yǎng)12-20h。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述步驟（c)中，細(xì)胞裂解液為：0-10% chelex-100水溶液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述步驟（e)中所述對(duì)DNA進(jìn)行分析檢測(cè)，其特征在于，所述的DNA 濃度通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳或測(cè)定0D260, 0D260/0D280比值得到。所得致病菌DNA濃度在 50-400ng/uL，所得的DNA純度0D260/0D280比值為1. 6-1. 8 ;且所得的DNA質(zhì)量可以滿足 普通PCR、熒光PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等檢測(cè)方法的要求。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104059906SQ201410161363
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】熊曉輝, 熊麗莎, 陸利霞, 程月花, 游京晶 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)