一種高通量檢測食源性致病菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高通量檢測食源性致病菌的方法，所述方法包括：采用針對多種致病菌標(biāo)志性DNA序列的通用引物對對樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列；使得所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列與分別針對所述致病菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針接觸，獲得帶有不同可檢測標(biāo)記物的雜交產(chǎn)物；檢測可檢測標(biāo)記物的信號以確定樣品中致病菌的存在或數(shù)量。本發(fā)明還提供了用于檢測致病菌的試劑盒。本發(fā)明的方法和試劑盒可準(zhǔn)確快速、高通量地檢測致病菌，具有易操作、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用前景廣泛。
【專利說明】一種高通量檢測食源性致病菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品檢測、公共衛(wèi)生和細(xì)菌學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種高通量、快速檢測致病菌(優(yōu)選食源性致病菌)的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002]食源性疾病，包括食物中毒、腸道傳染病、人畜共患傳染病、腸源性病毒感染等，是當(dāng)今最廣泛的公共衛(wèi)生問題之一，而引起這些食源性疾病的主要因子是致病細(xì)菌。要從根本上解決食品安全問題，就必須對食品的生產(chǎn)、加工、流通和銷售等各環(huán)節(jié)實(shí)施全程管理和監(jiān)控，這就需要大量能夠滿足這一要求的快速、方便、準(zhǔn)確、靈敏的食品安全分析檢測技術(shù)。
[0003]目前，食品檢驗(yàn)檢疫工作中的細(xì)菌鑒定主要方法有:傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定方法、PCR、Southern Blot雜交(即DNA印跡法)、ELISA等分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法。
[0004]但是，傳統(tǒng)檢測方法操作繁瑣、耗時費(fèi)力，一般需要5天，有的甚至需要一個月的時間；ELISA方法雖然靈敏度高，但容易污染，出現(xiàn)假陽性；采用多重PCR技術(shù)，雖然可以達(dá)到對單一菌的快速、準(zhǔn)確和方便的診斷目的，但在病原菌未明時，需要采用多種不同引物進(jìn)行試驗(yàn)，這對病原菌的復(fù)雜性和PCR程序的多樣性來說是不夠理想的。
[0005]隨著生物芯片技術(shù)的日趨成熟，高效、快速、準(zhǔn)確、靈敏的生物芯片技術(shù)被應(yīng)用到越來越多的領(lǐng)域，其中就包括食品微生物檢測領(lǐng)域。液相芯片技術(shù)是新近開發(fā)出的新一代分子診斷技術(shù)平臺，該平臺既能保證信息質(zhì)量，又能提供相對高通量的檢測，其高通量、高精確性的特點(diǎn)提供了食源性細(xì)菌所需的多指標(biāo)聯(lián)合檢測的思路。
[0006]目前最先進(jìn)的技術(shù)是科學(xué)家韓健博士發(fā)明的Tem-PCR (target enrichedmultiplex PCR,祀序列富集多重PCR)技術(shù)與液相芯片檢測技術(shù)的結(jié)合運(yùn)用，該技術(shù)能在一次反應(yīng)中對多種靶序列進(jìn)行高度敏感和特異的擴(kuò)增和檢測，其主要原理是，針對待擴(kuò)增的每一種靶序列，設(shè)計(jì)兩對巢式的特異性`引物:F0，R0 ;Fi，Ri。其中的Fi和Ri引物帶有一個能被通用的超級引物(Super Primer)識別的標(biāo)簽序列。巢式的祀序列特異性引物的濃度極低，用于在PCR的最初幾個循環(huán)中富集目標(biāo)序列。只有超級引物的濃度足以進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，而且只有反向超級引物進(jìn)行了生物素的標(biāo)記。最后通過液相芯片檢測平臺輸出信號，達(dá)到檢測目的。該技術(shù)與普通PCR技術(shù)相比具有兼容性好、特異性強(qiáng)、效率超高、可半定量等優(yōu)點(diǎn)，但是該技術(shù)也存在對所需DNA模板要求高、PCR反應(yīng)時間長、敏感性不夠強(qiáng)等缺點(diǎn)。
[0007]細(xì)菌rRNA按沉降系數(shù)分為3種，分別為5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是細(xì)菌染色體上編碼16S rRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌染色體基因中，它的內(nèi)部結(jié)構(gòu)包含保守區(qū)及可變區(qū)。16S rDNA是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA(16S rRNA)的基因，其長度約為1500pb，是細(xì)菌分類學(xué)研究中最常用、最有用的“分子鐘”。
[0008]在核糖體RNA(rRNA)特征序列中，經(jīng)研究認(rèn)為16S rRNA及其類似的rRNA基因序列作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標(biāo)最為合適，其主要依據(jù)是:它們?yōu)榧?xì)胞所共有；其功能同源且最為古老；既含有保守序列又含可變序列；分子大小適合操作；它的序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)。依據(jù)16S rRNA序列繪制的生命進(jìn)化樹，卡爾?沃斯(Carl ffoese)將地球上的所有細(xì)胞生物劃分為3個域(domain),即古生菌(Archaea,也稱Archaebacteria)、細(xì)菌(Bacteria,也稱Eubacteria)和真核生物(Eukarya)。16S rRNA序列分析作為微生物分類系統(tǒng)的主要依據(jù)也得到了廣泛認(rèn)同，隨著微生物核糖體數(shù)據(jù)庫的日益完善，該技術(shù)成為細(xì)菌分類和鑒定的一個有力工具。
[0009]關(guān)于16S rDNA的數(shù)據(jù)庫信息及分析軟件較其它分類鑒定用的基因豐富得多，如RDP (http://rdp.cme.msu.edu/html/)、ARB (http: //www.ard-home.de/)、ORS (http://soul, mikr0.biologie.tu-muenchen.de/ORS/)、OPD (http: //www.com.msu.eduOPD/)及PRIMROSE, CLUSTAL-X, PRIMER PREMIER、DNA START等，各分析軟件因采用的算法不同而各有所長。
[0010]然而，本領(lǐng)域中尚未提供同時檢測樣品中多種致病菌的方法。本領(lǐng)域中仍然迫切需要開發(fā)出能夠克服目前致病菌檢測中的不足、高通量、快速檢測多種致病菌的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的主要目的就在于提供一種高通量、快速檢測致病菌的方法，該方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、檢測時間短等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的另一個目的在于提供用于本發(fā)明方法的試劑盒，以及本發(fā)明的方法和試劑盒在致病菌檢測中的應(yīng)用。
[0012]在本發(fā)明的第一方面中，提供了一種獲得樣品中致病菌的標(biāo)志性DNA序列的方法，所述致病菌為選自下組中的至少兩種:大腸桿菌(E.coli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimorium)、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)、單增李斯特菌(L.monocytogenes)、小腸結(jié)腸耶爾森菌(Yersima enterocolitica)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni),所述方法包括:
[0013](i)獲得針對SEQ ID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和針對SEQ ID NO:23所示序列TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG的通用下游引物；
[0014](ii)采用所述通用上游引物和通用下游引物對所述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得所述致病菌的標(biāo)志性DNA，其中，所述標(biāo)志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨(dú)有的特異性序列。
[0015]在一些優(yōu)選例中，通過以上所述的PCR擴(kuò)增方法獲得的分別是SEQ ID NO: 16-21所示的標(biāo)志性DNA序列。
[0016]在一些優(yōu)選例中，所述通用下游引物的序列針對SEQ ID N0:24所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA。
[0017]在一些優(yōu)選例中，所述通用上游引物的序列如SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3所示；所述通用下游引物的序列如 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:6 或 SEQID NO:7 所示。
[0018]在一些實(shí)施方式中，所述通用上游引物為與SEQ ID NO:22所示序列的15~17個連續(xù)核苷酸序列完全一致的序列；所述通用下游引物為與SEQ ID NO:23的15~23個連續(xù)核苷酸序列完全互補(bǔ)的序列。
[0019]在一些優(yōu)選例中，所述通用下游引物為與SEQ ID NO:24所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的15~23個連續(xù)核苷酸序列完全互補(bǔ)的序列。
[0020]在另一些實(shí)施方式中，所述通用上游引物為與SEQ ID NO:22所示序列的15~17個連續(xù)核苷酸序列完全互補(bǔ)的序列；所述通用下游引物為與SEQ ID NO: 23的15~23個連續(xù)核苷酸序列完全一致的序列。
[0021]在一些優(yōu)選例中，所述通用下游引物為與SEQ ID NO:24所示序列TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA的15~23個連續(xù)核苷酸序列完全一致的序列。
[0022]在一些優(yōu)選例中，所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列分別如下:a) SEQ ID NO: 16所示的大腸桿菌的標(biāo)志性DNA序列；b)SEQ ID NO: 17所示的鼠傷寒沙門氏菌的標(biāo)志性DNA序列；
c)SEQ ID NO: 18所示的蠟狀芽孢桿菌的標(biāo)志性DNA序列；d)SEQ ID NO: 19所示的單增李斯特菌的標(biāo)志性DNA序列；e) SEQ ID NO: 20所示的小腸結(jié)腸耶爾森菌的標(biāo)志性DNA序列；和
f)SEQ ID NO: 21所示的空腸彎曲桿菌的標(biāo)志性DNA序列。 [0023]在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種檢測樣品中致病菌的方法，所述致病菌為選自下組中的至少兩種:大腸桿菌(E.coli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimorium)、臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、單增李斯特菌(L.monocytogenes)、小腸結(jié)腸耶爾森菌(Yersima enterocolitica)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni),所述方法包括:
[0024](A)采用本發(fā)明所述的方法獲得樣品中所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列；
[0025](B)提供分別針對所述至少兩種致病菌的標(biāo)志性DNA序列的相應(yīng)特異性捕獲探針；
[0026](C)在雜交條件下，使所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列與所述特異性捕獲探針接觸，并且在所述接觸之前、之時或之后用不同的可檢測標(biāo)記物標(biāo)記所述特異性捕獲探針或所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列與所述特異性捕獲探針形成的復(fù)合物，獲得帶有不同可檢測標(biāo)記物的雜交產(chǎn)物；
[0027](D)檢測連接到所述雜交產(chǎn)物上的可檢測標(biāo)記物的信號，以確定樣品中各種待測致病菌的存在或數(shù)量。
[0028]在一些實(shí)施方式中，所述方法用于食品檢驗(yàn)、食品加工過程檢測、臨床樣品或化妝品檢測，優(yōu)選用于食品檢疫。
[0029]在另一些實(shí)施例中，所述可檢測標(biāo)記物選自:編碼微球、或其它載體(如熒光標(biāo)記物、發(fā)光蛋白等)。
[0030]在另一些實(shí)施例中，所述方法還包括在步驟(A)之后，分離和/或純化所述所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列、和/或?qū)⑺鏊鲋虏【臉?biāo)志性DNA序列與可檢測標(biāo)記物連接。在一些實(shí)施例中，所述可檢測標(biāo)記物是生物素、抗生物素、抗體、標(biāo)記細(xì)胞或發(fā)光蛋白。
[0031]在一些實(shí)施方式中,所述樣品來源于:食品、血液或尿液。
[0032]在另一些實(shí)施例中，所述樣品是DNA樣品或菌液。
[0033]在另一些實(shí)施例中，所述樣品中可包含所述6種致病菌中的1、2、3、4、5或6種。
[0034]在另一些實(shí)施方式中，其特征在于，所述特異性捕獲探針選自:
[0035]a)針對SEQ ID NO: 16所示大腸桿菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針；b)針對SEQ ID NO: 17所示鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針；c)針對SEQ IDNO: 18所示臘狀芽孢桿菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針；d)針對SEQ ID NO: 19所示單增李斯特菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針；e)針對SEQ ID NO:20所示小腸結(jié)腸耶爾森菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針；和f)針對SEQ ID NO: 21所示空腸彎曲桿菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針。[0036]在另一些優(yōu)選例中，所述特異性捕獲探針的G/C為45~60%，優(yōu)選50~55%。
[0037]在另一些實(shí)施例中，所述特異性捕獲探針的長度為20_25bp，更優(yōu)選22bp。
[0038]在另一些實(shí)施例中，所述特異性捕獲探針的Tm值為40_60°C，優(yōu)選52°C。
[0039]在另一些實(shí)施例中，所述特異性捕獲探針的5’端將修飾或封閉，以便于與編碼微球偶聯(lián)。
[0040]在另一些實(shí)施例中，所述特異性捕獲探針選自下組:
[0041]a) SEQ ID NO: 10所示的大腸桿菌的特異性捕獲探針；
[0042]b) SEQ ID NO: 11所示的鼠傷寒沙門氏菌的特異性捕獲探針；
[0043]c) SEQ ID NO: 12所示的蠟狀芽孢桿菌的特異性捕獲探針；
[0044]d) SEQ ID NO: 13所示的單增李斯特菌的特異性捕獲探針；
[0045]e) SEQ ID NO: 14所示的小腸結(jié)腸耶爾森菌的特異性捕獲探針；和
[0046]f) SEQ ID NO: 15所示的空腸彎曲桿菌的特異性捕獲探針。
[0047]在另一些實(shí)施方式中，步驟(C)中的所述可檢測標(biāo)記物為編碼微球，所述編碼微球采用可產(chǎn)生不同可信號的標(biāo)記物編碼。
[0048]在一些實(shí)施例中，所述標(biāo)記物選自:不同顏色的標(biāo)記物或其不同比例的組合。在另一些實(shí)施例中，所述標(biāo)記物`選自:不同顏色的熒光標(biāo)記物、或不同比例的兩種或兩種以上的熒光標(biāo)記物的組合。
[0049]在一些實(shí)施例中，所述編碼微球與捕獲探針偶聯(lián)。在一些實(shí)施例中，所述偶聯(lián)通過EDC法進(jìn)行。在另一些實(shí)施例中，所述偶聯(lián)是通過NHS偶聯(lián)劑進(jìn)行的。在另一些實(shí)施例中，所述微球是聚苯乙烯微球，并根據(jù)其表面帶有的分子殘基的不同，可以結(jié)合不同的探針分子。
[0050]在另一些實(shí)施方式中，步驟(D)中的所述檢測采用選自下組的一種或多種系統(tǒng)或儀器:液相芯片檢測系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀或固相芯片。
[0051]在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種用于檢測致病菌和/或治療致病菌感染的試劑盒，所述致病菌為選自下組中的至少兩種:大腸桿菌(E.coli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimorium)、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)、單增李斯特菌(L.monocytogenes)、小腸結(jié)腸耶爾森菌(Yersima enterocolitica)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni),所述試劑盒包含:
[0052](i’)針對SEQ ID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和針對SEQ ID NO:23所示序列TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物對所述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得所述致病菌的標(biāo)志性DNA，其中，所述標(biāo)志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨(dú)有的特異性序列；
[0053](ii')針對所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列的相應(yīng)特異性捕獲探針、各種可檢測標(biāo)記物、或各種特異性捕獲探針與可檢測標(biāo)記物的連接物；
[0054](iii’)一個或多個容器和/或包裝物；
[0055](iv’ )任選的，PCR擴(kuò)增用試劑；
[0056](V’ )任選的，用于連接所述特異性捕獲探針和可檢測標(biāo)記物的試劑；
[0057](vi’ )任選的，檢測信號用的試劑和/或儀器；[0058](vii’)任選的，使用說明書；
[0059](viii’)任選的，致病菌治療劑。
[0060]在本發(fā)明的第四方面中，提供了下述物質(zhì)在制備檢測致病菌和/或治療致病菌感染的試劑盒中的用途:
[0061]⑴針對SEQ ID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和針對SEQ ID NO:23所示序列TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物對所述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得所述致病菌的標(biāo)志性DNA，其中，所述標(biāo)志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨(dú)有的特異性序列；
[0062](ii)針對所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列的相應(yīng)特異性捕獲探針、各種可檢測標(biāo)記物、或各種特異性捕獲探針與可檢測標(biāo)記物的連接物；
[0063](iii) 一個或多個容器和/或包裝物；
[0064](iv)任選的，PCR擴(kuò)增用試劑；
[0065](V)任選的，用于連接所述特異性捕獲探針和可檢測標(biāo)記物的試劑；
[0066](vi)任選的，檢測信號用的試劑和/或儀器；
[0067](vii)任選的，使用說明書；
[0068](viii)任選的，致病菌治療劑。
[0069]在一些實(shí)施例中，所述可檢測標(biāo)記物是微球。
[0070]在本發(fā)明的其它方面中`，還提供了本發(fā)明上述方法和試劑盒在檢測致病菌和/或治療致病菌感染中的用途。
[0071]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0072]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，其中這些顯示僅為了圖示說明本發(fā)明的實(shí)施方案，而不是為了局限本發(fā)明的范圍。
[0073]圖1:針對16S rDNA基因的通用引物和特異性捕獲探針的設(shè)計(jì)示意圖。
[0074]圖2:采用通用引物對(SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2)PCR擴(kuò)增不同菌株的凝膠電泳圖。
[0075]圖3:采用通用引物對(SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4)PCR擴(kuò)增不同菌株的凝膠電泳圖。
[0076]圖4:采用通用引物對(SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5)PCR擴(kuò)增不同菌株的凝膠電泳圖。
[0077]圖5:采用通用引物對(SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:6)PCR擴(kuò)增不同菌株的凝膠電泳圖。
[0078]圖6:采用通用引物對(SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7)PCR擴(kuò)增不同菌株的凝膠電泳圖。
[0079]圖7:采用通用引物對(SEQ ID N0:8、SEQ ID NO:9)PCR擴(kuò)增不同菌株的凝膠電泳圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0080]本發(fā)明主要是為了克服目前致病菌(尤其是食源性致病菌)檢測中的不足，提供一種高通量快速檢測致病菌的方法，采用一對通用引物及特異性捕獲探針設(shè)計(jì)，通過液相芯片實(shí)現(xiàn)信號輸出的方法，可同時、快速檢測多種致病菌。該方法高效、靈敏、特異性強(qiáng)、交叉反應(yīng)少，克服多重PCR及熒光檢測系統(tǒng)中存在的PCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì)繁瑣及產(chǎn)生交叉反應(yīng)等缺點(diǎn)。
[0081]本發(fā)明人開發(fā)的以16S rDNA PCR技術(shù)為核心的新型致病菌快速檢測技術(shù)，只需采用一對通用引物就可以對多種不同細(xì)菌的16S rRNA特征信息進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的為包含多重性的16S rDNA信息的PCR產(chǎn)物。這種常規(guī)的PCR方法，可以在一個小時之內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)。所獲得的PCR產(chǎn)物，采用與特異性引物偶聯(lián)的編碼微球，用液相芯片檢測系統(tǒng)(如Luminex200)，可以實(shí)現(xiàn)多重性和高通量的檢測目標(biāo)。
[0082]獲得致病菌標(biāo)志性DNA序列的方法
[0083]本發(fā)明中提供了一種獲得樣品中致病菌的標(biāo)志性DNA序列的方法，所述致病菌為選自下組中的至少兩種:大腸桿菌(E.coli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimorium)、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)、單增李斯特菌(L.monocytogenes)、小腸結(jié)腸耶爾森菌(Yersima enterocolitica)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni),所述方法包括:
[0084](i)獲得針對SEQ ID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和針對SEQ ID NO:23所示序列TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG的通用下游引物；
[0085](ii)采用所述通用上游引物和通用下游引物對所述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得所述致病菌的標(biāo)志性DNA，其中，所述標(biāo)志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨(dú)有的特異性序列。
[0086]如本文所用，術(shù)語“標(biāo)志性DNA序列”是指位于各種致病菌16S rDNA中、且可由本發(fā)明的通用引物對擴(kuò)增獲得的特定序列，所述序列的兩端包含各菌共有的保守序列，而在該序列內(nèi)部具有各種致病菌獨(dú)有的特異性序列。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列分別如下:a)SEQ ID NO: 16所示的大腸桿菌的標(biāo)志性DNA序列；b)SEQ IDNO: 17所示的鼠傷寒沙門氏菌的標(biāo)志性DNA序列；c)SEQ ID NO: 18所示的臘狀芽孢桿菌的標(biāo)志性DNA序列；d)SEQ ID NO: 19所示的單增李斯特菌的標(biāo)志性DNA序列；e)SEQ ID NO:20所示的小腸結(jié)腸耶爾森菌的標(biāo)志性DNA序列jPf)SEQ ID NO:21所示的空腸彎曲桿菌的標(biāo)志性DNA序列。 [0087]如本文所用，術(shù)語“特異性序列”或“可變區(qū)”可互換使用，均是指位于各種待測致病菌16S rDNA基因內(nèi)部、各種待測致病菌獨(dú)有的一段區(qū)域。通過分析和比較各種待測致病菌的16S rDNA序列可確定該特異性序列的存在和具體位置。通常，該特異性序列兩端具有各種致病菌共有的保守序列。所述的特異性序列可用于區(qū)分致病菌的種類。
[0088]可采用序列比對、參考文獻(xiàn)(液體芯片技術(shù)定量測定人體血清CEA、AFP、NSE 和 tPSA，粱惠儀等，J Mol Diagn Ther, 2010 年 7 月，Vol.2，N0.4 ;王嘉莉等；High-Throughput,Sensitive, and Accurate Multiplex PCR-Microsphere FlowCytometry System for Large-Scale Comprehensive Detection of Respiratory Viruses(以新技術(shù)平臺Luminex快速檢測具二甲氧基苯青霉素抗藥性的金黃色葡萄球菌)2007年
5月 30 日提前公開? 10.1128/JCM.02501-06.2007，45(8):2626.DO1:J.Clin.Microbiol.JamesR.Prudent等)、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)確定適用于本發(fā)明方法的各待測致病菌的特異性序列或包含該序列的標(biāo)志性DNA序列。關(guān)于16S rDNA的數(shù)據(jù)庫信息及分析軟件在本領(lǐng)域中是已知的，例如 RDP(http://rdp.cme.msu.edu/html/)、ARB(http://www.ard-home.de/)、ORS (http://soul.mikr0.biologie.tu-muenchen.de/0RS/)、OPD (http://www.com.msu.eduOPD/)及 PRMR0SE、CLUSTAL_X、PRMER PREMIER,DNA START 等，各分析軟件因采用的算法不同而各有所長，這些數(shù)據(jù)庫和軟件均可用于本發(fā)明中。
[0089]如本文所用，術(shù)語“保守序列”或“共有序列”可互換使用，均是指各種致病菌的16SrRNA基因(16S rDNA)的標(biāo)志性DNA序列中的一致序列。針對“保守序列”設(shè)計(jì)出的本發(fā)明的通用引物可用于擴(kuò)增出各種待測致病菌的標(biāo)志性DNA序列。為了實(shí)現(xiàn)通用擴(kuò)增的目的，通常該保守序列位于可變區(qū)的兩端。
[0090]如本文所用，術(shù)語“通用引物對”是指針對致病菌標(biāo)志性DNA序列中的保守區(qū)域、可用于擴(kuò)增出包含各種致病菌的特異性序列的致病菌標(biāo)志性DNA序列的一對通用引物。正向通用引物通常針對標(biāo)志性DNA序列的上游；反向通用引物通常針對標(biāo)志性DNA序列的下游。
[0091]通用引物對的設(shè)計(jì)可根據(jù)本領(lǐng)域中常規(guī)的引物設(shè)計(jì)規(guī)則進(jìn)行、采用已知的引物設(shè)計(jì)軟件和/或由提供引物設(shè)計(jì)的公司提供專門的服務(wù)。本發(fā)明的通用上游引物和通用下游引物分別針對SEQ ID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC (即單增李斯特菌16s rDNA的927 ~943bp)和針對 SEQ ID NO:23 所示序列 TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG (即單增李斯特菌16s rDNA的1041~1064bp)。例如在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，可采用SEQ ID NO:1或3的正向通用引物與SEQ ID N0:2、4、5、6或7的反向通用引物組合形成通用引物對。
[0092]在本發(fā)明的方法中，可采用本領(lǐng)域中已知的PCR方法和常規(guī)條件、采用本發(fā)明的通用引物對，對樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。也可對已知類型的菌種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，并將測序信息用于后續(xù)的特異性捕獲探針設(shè)計(jì)。
[0093]致病菌檢測方法
[0094]本發(fā)明中提供了一種檢測致病菌的方法，所述方法包括:
[0095](A)采用如上所述的方法獲得樣品中所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列；
[0096](B)提供分別針對所述至少兩種致病菌的標(biāo)志性DNA序列的相應(yīng)特異性捕獲探針；
[0097](C)在雜交條件下，使所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列與所述特異性捕獲探針接觸，并且在所述接觸之前、之時或之后用不同的可檢測標(biāo)記物標(biāo)記所述特異性捕獲探針或所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列與所述特異性捕獲探針形成的復(fù)合物，獲得帶有不同可檢測標(biāo)記物的雜交產(chǎn)物；
[0098](D)檢測連接到所述雜交產(chǎn)物上的可檢測標(biāo)記物的信號，以確定樣品中各種待測致病菌的存在或數(shù)量。
[0099]如本文所用，術(shù)語“特異性捕獲探針”或“捕獲探針”可互換使用，均是指針對可能存在的某種致病菌在16S rDNA標(biāo)志性DNA序列中的特異性序列設(shè)計(jì)的，從而可特異性捕獲該種致病菌的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的探針。根據(jù)需要，本發(fā)明的捕獲探針可帶有或不帶有標(biāo)記物(如放射性、生物素、熒光標(biāo)記物等)?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域中常規(guī)的探針設(shè)計(jì)規(guī)則設(shè)計(jì)探針，并人工合成探針。
[0100]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，SEQ ID NO: 10~15的捕獲探針序列分別特異性地針對并可分別捕獲大腸桿菌、沙門氏菌、蠟狀芽孢桿菌、李斯特菌、小腸結(jié)腸耶爾森菌和空腸彎曲桿菌的標(biāo)志性DNA序列，更具體而言標(biāo)志性DNA序列中的特異性序列。
[0101]可用各種可檢測標(biāo)記物與捕獲探針連接，以使得被特定捕獲探針捕獲的序列上帶有特定的標(biāo)記，從而將特定可檢測標(biāo)記與特定菌的序列對應(yīng)起來，便于區(qū)分不同的細(xì)菌。所述可檢測標(biāo)記物包括但不限于:編碼微球、載體(例如熒光標(biāo)記物、發(fā)光蛋白)等，優(yōu)選編碼微球。連接標(biāo)記物和捕獲探針的方法是本領(lǐng)域中所熟知的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)所選的標(biāo)記物對捕獲探針或標(biāo)記物進(jìn)行修飾或改造，以得到兩者可相互連接(例如可參見許艷軍，廈門大學(xué)2008年碩士學(xué)位論文:液相芯片中羧基功能性聚苯乙烯微球的制備、表征及其在生物檢測中的應(yīng)用、及其所引用的參考文獻(xiàn)等文獻(xiàn))。
[0102]如本文所用，術(shù)語“編碼微球”是指具有不同可檢測區(qū)分的特征(例如大小和/或顏色)、能與捕獲探針偶聯(lián)、并可被檢測設(shè)備區(qū)分的各種微球。微球的材料可為:聚苯乙烯,如MultiAnalyte微球或SeroMap微球等。微球的直徑可為20nm_200 u m,優(yōu)選5~1011111，更優(yōu)選5.611111。微球可用不同配比的染料(優(yōu)選熒光染料)染成不同的顏色(如熒光色)，從而獲得可多達(dá)數(shù)種、十?dāng)?shù)種、數(shù)十種、甚至百余種不同的編碼微球?？赏ㄟ^市售途徑獲得編碼微球，例如購自凱杰生物、BIO-RAD或根據(jù)需要自行設(shè)計(jì)和制備編碼微球(例如可參考陳瑋，液相芯片技術(shù)的原理與應(yīng)用進(jìn)展，成都醫(yī)學(xué)院病理教研室，成都醫(yī)院學(xué)報，2008 (3): 225-231，該文獻(xiàn)以其全文納入本文作為參考)。
[0103]本發(fā)明的捕獲探針可經(jīng)過修飾或改造具有適于與編碼微球偶聯(lián)的接頭或基團(tuán)，例如可在捕獲探針的5’端連接AMB以用于進(jìn)一步與編碼微球連接。捕獲探針與編碼微球的偶聯(lián)，可采用本領(lǐng)域中已知的方法進(jìn)行(例如可參考韓衛(wèi)寧等，液相芯片技術(shù)在核酸檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展，現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008 (10): 1911-1915，該文獻(xiàn)以其全文納入本文作為參考)。例如在適合捕獲探針上的接頭或基團(tuán)與編碼微球上的相應(yīng)結(jié)構(gòu)連接或反應(yīng)的條件下，混合和孵化捕獲探針和編碼微球。
[0104]在適當(dāng)條件下，使采用通用引物對擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與不同的捕獲探針-編碼微球偶聯(lián)物雜交，以使得PCR產(chǎn)物帶有來自編碼微球的可檢測信號。雜交條件可參照廠商提供的操作規(guī)程(例如Iuminex偶聯(lián)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行)或本領(lǐng)域中的常規(guī)條件進(jìn)行。
[0105]可采用本領(lǐng)域中已知的方法檢測連接到所述PCR產(chǎn)物上的編碼微球的信號，以測定致病菌的存在或數(shù)量。例如可采用熒光微球檢測系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀或固相芯片等。當(dāng)檢測到與特定致病菌的捕獲探針偶聯(lián)的特定編碼微球信號時，表明被檢測的樣品中帶有此種特定的致病菌。如需要的話，可通過編碼微球信號的強(qiáng)弱測定樣品中致病菌的數(shù)量。
[0106] 試劑盒及試劑的應(yīng)用
[0107]本發(fā)明中還提供了一種用于檢測致病菌的試劑盒，其包含:
[0108](i’)針對SEQ ID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和針對SEQ ID NO:23所示序列TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物對所述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得所述致病菌的標(biāo)志性DNA，其中，所述標(biāo)志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨(dú)有的特異性序列；
[0109](ii')針對所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列的相應(yīng)特異性捕獲探針、各種可檢測標(biāo)記物、或各種特異性捕獲探針與可檢測標(biāo)記物的連接物；
[0110](iii’)一個或多個容器和/或包裝物；
[0111](iv’)任選的，PCR擴(kuò)增用試劑；
[0112](V’ )任選的，用于連接所述特異性捕獲探針和可檢測標(biāo)記物的試劑；
[0113](vi’ )任選的，檢測信號用的試劑和/或儀器；
[0114](vii’)任選的，使用說明書；
[0115](viii’)任選的,致病菌治療劑。
[0116]本發(fā)明中進(jìn)一步提供了采用本發(fā)明的方法或試劑盒檢測致病菌和/或治療致病菌感染中的用途。
[0117]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
[0118]利用本發(fā)明的技術(shù)，可在4小時內(nèi)對多種常見食源性致病菌及其混合物進(jìn)行準(zhǔn)確、快速檢測；與傳統(tǒng)的檢測方法(細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定、血清分型等)相比，新技術(shù)的特色和創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在:可以直接用菌液或待檢樣品作為PCR模板進(jìn)行快速多重PCR擴(kuò)增，可同時對多種食源性致病菌進(jìn)行高通量并行檢測，一次實(shí)驗(yàn)即可得出全部結(jié)果，操作簡便快速，特異性強(qiáng)、靈敏度高。
[0119]序列表說明
[0120]本發(fā)明序列表中序列號與具體序列之間的對應(yīng)關(guān)系如下表所示:
[0121]
【權(quán)利要求】
1.一種獲得樣品中致病菌的標(biāo)志性DNA序列的方法，所述致病菌為選自下組中的至少兩種:大腸桿菌(E.coli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimorium)、臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、單增李斯特菌(L.monocytogenes)、小腸結(jié)腸耶爾森菌(Yersimaenterocolitica)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni),所述方法包括: (i)獲得針對SEQID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和針對SEQID NO:23所示序列TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG的通用下游引物； (ii)采用所述通用上游引物和通用下游引物對所述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得所述致病菌的標(biāo)志性DNA，其中，所述標(biāo)志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨(dú)有的特異性序列。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述通用上游引物為與SEQID N0:22所示序列的15~17個連續(xù)核苷酸序列完全一致的序列；所述通用下游引物為與SEQ ID NO:23的15~23個連續(xù)核苷酸序列完全互補(bǔ)的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述通用上游引物為與SEQID N0:22所示序列的15~17個連續(xù)核苷酸序列完全互補(bǔ)的序列；所述通用下游引物為與SEQ ID NO:23的15~23個連續(xù)核苷酸序列完全一致的序列。
4.一種檢測樣品中致病菌的方法，所述致病菌為選自下組中的至少兩種:大腸桿菌(E.coli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimorium)、臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、單增李斯特菌(L.monocytogenes)、小腸結(jié)腸耶爾森菌(Yersimaenterocolitica)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni),所述方法包括: (A)采用權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的方法獲得樣品中所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列； (B)提供分別針對所述至少兩種致病菌的標(biāo)志性DNA序列的相應(yīng)特異性捕獲探針； (C)在雜交條件下，使所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列與所述特異性捕獲探針接觸，并且在所述接觸之前、之時或之后用不同的可檢測標(biāo)記物標(biāo)記所述特異性捕獲探針或所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列與所述特異性捕獲探針形成的復(fù)合物，獲得帶有不同可檢測標(biāo)記物的雜交產(chǎn)物； (D)檢測連接到所述雜交產(chǎn)物上的可檢測標(biāo)記物的信號，以確定樣品中各種待測致病菌的存在或數(shù)量。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法用于食品檢驗(yàn)、食品加工過程檢測、臨床樣品或化妝品檢測，優(yōu)選用于食品檢疫。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述特異性捕獲探針選自: a)針對SEQID NO: 16所示大腸桿菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針； b)針對SEQID NO: 17所示鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針； c)針對SEQID NO: 18所示臘狀芽孢桿菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針； d)針對SEQID NO: 19所示單增李斯特菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針； e)針對SEQID NO:20所示小腸結(jié)腸耶爾森菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針；和 f)針對SEQID NO: 21所示空腸彎曲桿菌標(biāo)志性DNA序列的特異性捕獲探針。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(C)中的所述可檢測標(biāo)記物為編碼微球，所述編碼微球采用可產(chǎn)生不同可信號的標(biāo)記物編碼。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(D)中的所述檢測采用選自下組的一種或多種系統(tǒng)或儀器:液相芯片檢測系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀或固相芯片。
9.一種用于檢測致病菌和/或治療致病菌感染的試劑盒，所述致病菌為選自下組中的至少兩種:大腸桿菌(E.coli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimorium)、臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、單增李斯特菌(L.monocytogenes)、小腸結(jié)腸耶爾森菌(Yersimaenterocolitica)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni),所述試劑盒包含: (i’)針對SEQ ID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和針對SEQID NO:23所示序列TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物對所述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得所述致病菌的標(biāo)志性DNA，其中，所述標(biāo)志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨(dú)有的特異性序列； (ii')針對所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列的相應(yīng)特異性捕獲探針、各種可檢測標(biāo)記物、或各種特異性捕獲探針與可檢測標(biāo)記物的連接物； (iii’)一個或多個容器和/或包裝物； (iv’)任選的，PCR擴(kuò)增用試劑； (v’)任選的，用于連接所述特異性捕獲探針和可檢測標(biāo)記物的試劑； (vi’)任選的，檢 測信號用的試劑和/或儀器； (vii')任選的，使用說明書； (viii’)任選的，致病菌治療劑。
10.下述物質(zhì)在制備檢測致病菌和/或治療致病菌感染的試劑盒中的用途: (i)針對SEQID NO:22所示序列ACGCGAAGAA CCTTACC的通用上游引物和針對SEQ IDNO: 23所示序列TGITGGGTTAAGTCCCGCAACGAG的通用下游引物，其中采用所述通用上游引物和通用下游引物對所述樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得所述致病菌的標(biāo)志性DNA，其中，所述標(biāo)志性DNA序列位于所述致病菌的16S rDNA中，且包含所述一種或多種致病菌各自獨(dú)有的特異性序列； (ii)針對所述致病菌的標(biāo)志性DNA序列的相應(yīng)特異性捕獲探針、各種可檢測標(biāo)記物、或各種特異性捕獲探針與可檢測標(biāo)記物的連接物； (iii)一個或多個容器和/或包裝物； (iv)任選的，PCR擴(kuò)增用試劑； (v)任選的，用于連接所述特異性捕獲探針和可檢測標(biāo)記物的試劑； (vi)任選的，檢測信號用的試劑和/或儀器； (vii)任選的，使用說明書； (viii)任選的，致病菌治療劑。
【文檔編號】A61K45/00GK103667251SQ201210322582
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月3日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月3日
【發(fā)明者】王慧, 儲瑞藹, 謝東, 韓雪松, 周賢, 邱紅玲, 李井泉, 尹珺, 王壽利, 王奕然 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院