專(zhuān)利名稱(chēng)：：運(yùn)用復(fù)合熒光pcr技術(shù)檢測(cè)食源性致病弧菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)，具體地說(shuō)是運(yùn)用熒光PCR反應(yīng)來(lái)檢測(cè)致病弧菌，特別是食源性致病弧菌的技術(shù)。
背景技術(shù)：
：食品中常見(jiàn)的致病菌是引起食物中毒的主要原因之一，可導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，嚴(yán)重威脅著人們的健康，其中弧菌是危害較為嚴(yán)重的食源菌。快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)食品中的致病菌是有效預(yù)防和控制病原菌感染的前提條件。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，食品檢驗(yàn)檢疫工作中的細(xì)菌鑒定方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的簡(jiǎn)單生化實(shí)驗(yàn)水平上向分子生物學(xué)的方法如PCR、探針雜交等技術(shù)發(fā)展，但是分子生物學(xué)的檢測(cè)方法在短期內(nèi)仍然難以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的生化鑒定，目前分子生物學(xué)方法主要用于大量樣品的初篩。需要檢測(cè)的食源性弧菌主要包括以下幾種副溶血弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述目標(biāo)菌，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種運(yùn)用復(fù)合熒光PCR技術(shù)快速低成本的檢測(cè)副溶血弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌的方法。該方法包括應(yīng)用該方法檢測(cè)食源性病原微生物的所使用的引物組和與之配套的PCR反應(yīng)條件。其中引物、探針的全部序列如下引物引物序列一5，CAACAATAAATTGTTGTTTTGTCAGCT弓I物序列二5'GGGCTATAGCTCAGCTGGGAGA引物序列三5，GAAAGATAAACACCAACAACACATT弓I物序列四5'CGATTAGCTCCACCACTGACTTC弓I物序列五5，CGAAGTCAGTGGTGGAGCTAATC引物序列六5'TGGTTTAGAAAGTTTAGAGTATCTTAGTGT本發(fā)明提供了更加快速和低成本通過(guò)熒光PCR方法檢測(cè)食源性致病弧菌的方法。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的(1)設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸引物用于熒光染料嵌合熒光PCR技術(shù)檢測(cè)(2)整合各引物使之不相互干擾。(3)以引物序列組，擴(kuò)增待測(cè)樣品模板，進(jìn)行目的基因的特異性擴(kuò)增(4)擴(kuò)增過(guò)程中使用熒光PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光光強(qiáng)度測(cè)量并在PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行所合成DNA片段的熔解曲線的測(cè)定，并將數(shù)據(jù)傳輸至電腦通過(guò)配套軟件進(jìn)行分析可以觀察到各種病原微生物的特異性熔解曲線的峰值。本發(fā)明用特異性的引物組擴(kuò)增金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌、15種腸桿菌和5種弧菌的基因組均產(chǎn)生熒光信號(hào)，并生成相應(yīng)的熔解曲線峰值，均未發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的結(jié)果。本發(fā)明中熒光PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預(yù)混合物2倍12.5fiL熒光嵌合法所用引物序列一1Ofimol/L0.3jiL熒光嵌合法所用引物序列二10阿ol/L熒光嵌合法所用引物序列三10拜ol/L0.6^L熒光嵌合法所用引物序列四10拜oI/L0.3|iL熒光嵌合法所用引物序列五10阿ol/L0.3jtL熒光嵌合法所用引物序列六10pmol/L0單DNA樣品雙蒸水總體積25nL熒光PCR擴(kuò)增程序及測(cè)定擴(kuò)增片段的熔解溫度程序?yàn)?1)95*0IO分鐘；(2)95"15秒；(3)65"C30秒；(4)回到第2步，重復(fù)40次；(5)95*C2分(6)梯度升溫601C至95*C每秒上升0.2"0。熒光PCR結(jié)果在擴(kuò)增過(guò)程中使用熒光PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光光強(qiáng)度測(cè)量，并在PCR擴(kuò)增程序結(jié)束后進(jìn)行梯度升溫測(cè)定擴(kuò)增片段的熔解溫度.將數(shù)據(jù)傳輸至電腦通過(guò)配套軟件進(jìn)行分析可以觀察到進(jìn)行特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光，得到對(duì)副溶血弧菌的特異性片段所特有的熔解曲線雙峰值(主峰85"Ci(U"C和次峰761C±0.31C);創(chuàng)傷弧菌的特異性片段所特有的熔解曲線雙峰值(主峰761Cia3^C和次峰8化±0.30;霍亂弧菌的特異性片段所特有的熔解曲線三峰值(主峰74*C±0.3"、第一次峰77t:士0.3r和第二次峰84"0±0.3")。如果得到對(duì)副溶血弧菌的特異性片段所特有的熔解曲線雙峰值(主峰85TC士0.3"C和次峰761C±0.3*C):則證明待測(cè)樣品中含有副溶血弧菌，如果得到對(duì)創(chuàng)傷弧菌的特異性片段所特有的熔解曲線雙峰值(主峰76"±0.3"和次峰84"±0.3")則證明待測(cè)樣品中含有創(chuàng)傷弧菌如果得到對(duì)霍亂弧菌的特異性片段所特有的熔解曲線三峰值(主峰74X^t(U"C、第一次峰77"±0.3"和第二次峰84"±0.3")則說(shuō)明待測(cè)樣品中含有霍亂弧菌。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是基于熒光PCR的鑒定方法適用于直接從患者含菌體液、食品和體液培養(yǎng)物等臨床樣品中擴(kuò)增靶基因，從而細(xì)菌，而且使用本方法只需要一次一管熒光PCR反應(yīng)就能夠檢測(cè)出副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和霍亂弧菌是否存在，能夠節(jié)約檢測(cè)成本和時(shí)間。熒光PCR方法具有檢測(cè)準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定特異的目標(biāo)細(xì)菌。它用PCR的方法擴(kuò)增細(xì)菌靶基因，避免了反復(fù)培養(yǎng)，節(jié)約時(shí)間；PCR鑒定方法不受培養(yǎng)條件和細(xì)菌生理狀態(tài)的影響，較生理生化鑒定方法更為準(zhǔn)確。圖1某待測(cè)帶魚(yú)樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測(cè)待測(cè)樣品DNA，SYBRGreen熒光信號(hào)強(qiáng)度。圖2某待測(cè)帶魚(yú)樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測(cè)待測(cè)樣品DNA,擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度峰值。圖3某待測(cè)魚(yú)丸樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測(cè)待測(cè)樣品DNA,SYBRGreen熒光信號(hào)強(qiáng)度。圖4某待測(cè)魚(yú)丸樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測(cè)待測(cè)樣品DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度峰值。圖5某待測(cè)海帶樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測(cè)待測(cè)樣品DNA,SYBRGreen熒光信號(hào)強(qiáng)度。圖6某待測(cè)海帶樣品中復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測(cè)待測(cè)樣品DNA,擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度峰值。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例l樣本某處出口帶魚(yú)。用常規(guī)生理、生化方法檢測(cè)出副溶血弧菌疑似菌落，然后進(jìn)行如下復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測(cè)食源性致病菌的檢測(cè)1.樣品處理(1)取100克待檢樣品，粉碎。(2)溶解于1升營(yíng)養(yǎng)肉湯中37"培養(yǎng)8小時(shí)。2.DNA抽提取營(yíng)養(yǎng)肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入100nL溶菌酶溶液，371C保溫10分鐘，補(bǔ)加TE緩沖液50(HiL,振蕩混勻。加同體積Tris飽和鼢(pH8.0),強(qiáng)烈振蕩，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上清液，重復(fù)酚抽提。取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加70%冷乙醉洗滌一次，室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加入50jiLTE溶液，置-20TC保存。3.PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量PCR體系預(yù)混合物2倍12早熒光嵌合法所用引物序列一10拜ol/L0.3jiL熒光嵌合法所用引物序列二10拜ol/L0早熒光嵌合法所用引物序列三1(Hunol/L0.6pL熒光嵌合法所用引物序列四10拜1/L0.3jiL熒光嵌合法所用引物序列五10阿ol/L0.3jiL熒光嵌合法所用引物序列六10,ol/L0.6^LDNA樣品14雙蒸水總體積25fiL熒光PCR擴(kuò)增程序及測(cè)定擴(kuò)增片段的熔解溫度程序?yàn)?1)95"CIO分鐘；(2)95"C15秒；(3)65"C30秒(4)回到第2步，重復(fù)40次；(5)95*02分；(6)梯度升溫60"至951C每秒上升0.2匸。PCR共進(jìn)行2管PCR實(shí)驗(yàn)，其中DNA樣品所加入的分別為本待測(cè)樣品DNA:無(wú)樣品的陰性對(duì)照。4.被檢測(cè)樣品熒光PCR圖譜觀察熒光PCR過(guò)程中可以觀察到本待測(cè)樣品產(chǎn)生了明顯的SYBRGreen熒光，結(jié)果如圖1。陰性對(duì)照在PCR過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生SYBRGreen熒光結(jié)果，在通過(guò)觀測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度的熒光曲線，可以發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌的特征雙峰值(主峰85<0±0.3<0和次峰7610±0.3<0)如圖2。圖1中的曲線所代表的SYBRGreen熒光強(qiáng)度信號(hào)是樣品中DNA擴(kuò)增結(jié)果。圖2中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中副溶血弧菌的特征峰值(主峰85^Cia3"C和次峰76"±0.310)。實(shí)驗(yàn)表明樣品中含有副溶血弧菌。3天后，通過(guò)常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)證明，所檢驗(yàn)的目的菌落為副溶血弧菌，將其中一個(gè)菌株命名為CIQV6。熒光PCR檢驗(yàn)結(jié)果與生化檢測(cè)結(jié)果一致。實(shí)施例2樣本某處出口魚(yú)丸。用常規(guī)生理、生化方法檢測(cè)出創(chuàng)傷弧菌疑似菌落，然后進(jìn)行如下復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測(cè)食源性致病弧菌的檢測(cè)1.樣品處理(1)取100克待檢樣品，粉碎。(2)溶解于1升營(yíng)養(yǎng)肉湯中371C培養(yǎng)8小時(shí)。2.DNA抽提取營(yíng)養(yǎng)肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入100jiL溶菌酶溶液，37*0保溫10分鐘，補(bǔ)加TE緩沖液500nL,振蕩混勻。加同體積Tris飽和酚(pH8.0)，強(qiáng)烈振蕩，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上清液，重復(fù)酚抽提。取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L),混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加入50nLTE溶液，置-20TC保存。3.PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>雙蒸水9.1^L總體積25jiL熒光PCR擴(kuò)增程序及測(cè)定擴(kuò)增片段的熔解溫度程序?yàn)?1)95*0IO分鐘(2)951C15秒；(3)65*C30秒；(4)回到第2步，重復(fù)40次(5)95"2分；(6)梯度升溫60"至95X:每秒上升0,2"C。PCR共進(jìn)行2管PCR實(shí)驗(yàn)，其中DNA樣品所加入的分別為本待測(cè)樣品DNA;無(wú)樣品的陰性對(duì)照。4.被檢測(cè)樣品熒光PCR圖譜觀察熒光PCR過(guò)程中可以觀察到本待測(cè)樣品產(chǎn)生了明顯的SYBRGreen熒光，結(jié)果如圖3。陰性對(duì)照在PCR過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生SYBRGreen熒光結(jié)果，在通過(guò)觀測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度的熒光曲線，可以發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌(主峰76"±0.3*0和次峰84*0±0.310)如圖4。圖3中的曲線所代表的SYBRGreen熒光強(qiáng)度信號(hào)是樣品中DNA擴(kuò)增結(jié)果。圖4中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中創(chuàng)傷弧菌的特征峰值(主峰76*0±0.3*0和次峰84"±0.3")"C。實(shí)驗(yàn)表明樣品中含有創(chuàng)傷弧菌。3天后，通過(guò)常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)證明，所檢驗(yàn)的目的菌落為創(chuàng)傷弧菌，將其中一個(gè)菌株命名為CIQVll。熒光PCR檢驗(yàn)結(jié)果與生化檢測(cè)結(jié)果一致。實(shí)施例3樣本某處出口海帶。用常規(guī)生理、生化方法檢測(cè)出霍亂弧菌疑似菌落，然后進(jìn)行如下復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測(cè)食源性致病菌的檢測(cè)1.樣品處理(1)取100克待檢樣品，粉碎，(2)溶解于1升營(yíng)養(yǎng)肉湯中37X:培養(yǎng)8小時(shí)，2.DNA抽提取營(yíng)養(yǎng)肉湯lmL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入l(KHiL溶菌醸溶液，37"保溫10分鐘，補(bǔ)加TE緩沖液5(XHiL,振蕩混勻。加同體積Tris飽和酚(pH8.0),強(qiáng)烈振蕩，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取上清液，重復(fù)酚抽提。取上清液，加入O.l倍體積的乙酸鈉(2mol/L),混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加70%冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加入5(HiLTE溶液，置-20X;保存，3.PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下-成分濃度加樣量PCR體系預(yù)混合物2倍12單熒光嵌合法所用引物序列一0.3jiL熒光嵌合法所用引物序列二1O萍o(jì)l/L0早熒光嵌合法所用引物序列三io拜iyL0單熒光嵌合法所用引物序列四1(Hunol/L熒光嵌合法所用引物序列五1O拜ol/L熒光嵌合法所用引物序列六10萍o(jì)l/L0單DNA樣品雙蒸水9.叫總體積25熒光PCR擴(kuò)增程序及測(cè)定擴(kuò)增片段的熔解溫度程序?yàn)?1)95"CIO分鐘(2)95"C15秒；(3)65"C30秒(4)回到第2步，重復(fù)40次(5)951C2分；(6)梯度升溫601C至每秒上升0.210。PCR共進(jìn)行2管PCR實(shí)驗(yàn)，其中DNA樣品所加入的分別為本待測(cè)樣品DNA:無(wú)樣品的陰性對(duì)照。4.被檢測(cè)樣品熒光PCR圖譜觀察熒光PCR過(guò)程中可以觀察到本待測(cè)樣品產(chǎn)生了明顯的SYBRGreen熒光，結(jié)果如圖5。陰性對(duì)照在PCR過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生SYBRGreen熒光結(jié)果，在通過(guò)觀測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物熔解溫度的熒光曲線，可以發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌的特征峰值(主峰7410±0.3"、第一次峰77TCiO,3lC和第二次峰84tl±0.3r)。圖5中的曲線所代表的SYBRGreen熒光強(qiáng)度信號(hào)是樣品中DNA擴(kuò)增結(jié)果.圖6中的曲線所代表的熔解溫度峰值是樣品中霍亂弧菌的特征峰值(主峰74*C±0.31C、第一次峰77"±0.310和第二次峰841C±0.3r〉T。實(shí)驗(yàn)表明樣品中含有霍亂弧菌.5天后，通過(guò)常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)證明，所檢驗(yàn)的目的菌落為霍亂弧菌，將其中一個(gè)菌株命名為CIQV30。熒光PCR檢驗(yàn)結(jié)果與生化檢測(cè)結(jié)果一致，序列列表SEQUENCELISTING<110>中華人民共和國(guó)天津出入境檢驗(yàn)檢疫局<120>運(yùn)用復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測(cè)食源性致病弧菌的方法<130>2007118<160>6<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>27<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer—bind<222>(1)..(27)<400>1caacaata助ttgttgttttgtoagct27<210>2<211>22<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer一bind<222>(1)"(22)<400>2鵬ctatagctoagct鵬aga<210>3<211>25<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer一bind<222>(1)..(25)<400>3gaaagataaacaccaacaacacatt<210>4<211>23<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer一bind<222>(1)"(23)<400>4cgattagctccaccactgac加<210>5<211>23<212>DNA<213>人工合成<220><221>jnimer一bind<222>(1)..(23)<400>cgaagtcagtggtggagctaate<210>6<211>30<212>DNA<213>人工合成<220><221>primer—bind<222>(1)"(30)<400>6tggtttagaaagtttagagtatcttagtgt30權(quán)利要求1.一種運(yùn)用復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測(cè)食源性致病弧菌的方法，其特征在于，所使用的引物組序列如下引物引物序列一5’CAACAATAAATTGTTGTTTTGTCAGCT引物序列二5’GGGCTATAGCTCAGCTGGGAGA引物序列三5’GAAAGATAAACACCAACAACACATT引物序列四5’CGATTAGCTCCACCACTGACTTC引物序列五5’CGAAGTCAGTGGTGGAGCTAATC引物序列六5’TGGTTTAGAAAGTTTAGAGTATCTTAGTGT。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測(cè)食源性致病弧菌的方法,其特征在于，PCR反應(yīng)體系1中各組分構(gòu)成比例如下成分PCR體系預(yù)混合物引物序列一引物序列二.引物序列三引物序列四引物序列五引物序列六DNA樣品雙蒸水總體積3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的-濃度2倍10pmol/L10^mol/L10|xmol/L10拜ol/L加樣量12單0.3fiL0.6fiL0.3fiL0單9.1425，-種運(yùn)用復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測(cè)食源性致病弧菌的方法,其特征在于，熒光PCR擴(kuò)增程序及測(cè)定擴(kuò)增片段的熔解溫度程序?yàn)?1)951CIO分鐘(2)95"15秒(3)651C30秒(4)回到第(2)步，重復(fù)40次(5)95"2分(6)梯度升溫60*C至95"C每秒上升0.210,4.權(quán)利要求1所述的一種運(yùn)用復(fù)合熒光PCR技術(shù)在檢測(cè)食源性致病弧菌方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種運(yùn)用復(fù)合熒光PCR技術(shù)檢測(cè)食源性致病弧菌的方法，屬于細(xì)菌檢驗(yàn)
技術(shù)領(lǐng)域：
，主要的技術(shù)方案是設(shè)計(jì)了引物組序列。致病弧菌是食品中常見(jiàn)的致病菌，感染弧菌后影響十分嚴(yán)重。快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)食品中的致病弧菌是有效預(yù)防和控制病原菌感染的重要條件。需要檢測(cè)的食源性致病弧菌主要包括以下幾種副溶血弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌。針對(duì)上述目標(biāo)菌，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種運(yùn)用復(fù)合熒光PCR技術(shù)快速低成本的檢測(cè)副溶血弧菌、霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌的方法。該方法可以使用一管PCR反應(yīng)，能夠初篩出上述幾種病原微生物。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101113473SQ200710057580公開(kāi)日2008年1月30日申請(qǐng)日期2007年6月7日優(yōu)先權(quán)日2007年6月7日發(fā)明者佳于,寅劉,葉露萌,唐丹舟,張宏偉,李永君,鄭文杰,魏亞?wèn)|,黃熙泰申請(qǐng)人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心;南開(kāi)大學(xué)