專利名稱：奶牛乙型肝炎pcr快速診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其是一種奶牛乙型肝炎PCR快速診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是一種全球性傳染性疾病，我國是乙肝病毒感染的高發(fā)地區(qū)，人類HBsAg 陽性率平均為10. 1%， HBV是對人類健康危害最嚴(yán)重的病毒之一，長期以來人們普遍認(rèn)為 病毒只感染人和黑猩猩，而不感染其它動物。但近年來獸醫(yī)學(xué)界有關(guān)畜禽感染HBV的報(bào)道 日益增多。國內(nèi)很多學(xué)者在牛、羊、豬和家禽等多種動物血清中檢測出人乙型肝炎病毒表面 抗原和核心抗原。乙肝病毒屬于嗜肝DNA病毒，它的基因組為3.2kb。由雙鏈的環(huán)狀DNA組 成，含有4個(gè)開讀框分別編碼乙肝病毒的表面蛋白S、核蛋白C、反轉(zhuǎn)錄酶P和X蛋白。S基 因位于核甘酸第155 833位，編碼226個(gè)蛋白，由于S基因編碼的HBsAg可以誘導(dǎo)保護(hù)性 抗體的產(chǎn)生，是乙型肝炎疫苗的主要成分，也是診斷HBV感染的主要依據(jù)之一，所以乙型肝 炎病毒S基因及表面抗原與臨床的關(guān)系的研究一直是國內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn)。ELISA HBV法檢 測血清免疫學(xué)標(biāo)志物在臨床上得到了廣泛應(yīng)用，因此，準(zhǔn)確、迅速診斷對乙肝的治療和預(yù)后 顯得極為重要。目前關(guān)于人HBV檢測技術(shù)的研究報(bào)道較多，而奶牛類HBV的PCR診斷方法 未見報(bào)道，因此急需快速、準(zhǔn)確、特異的奶牛乙型肝炎診斷試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種奶牛乙型肝炎PCR快速診斷試劑盒，它可以在快速檢 測到乙型肝炎病毒，并且準(zhǔn)確、特異。 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的奶牛乙型肝炎PCR快速診斷試劑盒，它包括40 ii L等體積混 合的引物P1 、 P2，引物P1 、 P2的濃度均為20 ii M， 40 ii L等體積混合的引物P3、 P4，引物P3、 P4的濃度均為20 ii M，緩沖液600 ii L，陰性對照20 y L， PCR酶250 y L，超純水170 y L， 50 y L 的MarkerDL2000以及陽性對照20 y L。 緩沖液為50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液。 陰性對照為超純水。 陽性對照為重組pMD18-T-HBV-S質(zhì)粒。 PCR酶的組成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1. 5mM的MgCL2以及0. 05U的 Poymerase/uL。 弓| 物P1、P2的序歹lj 分另U 為Pl :5' —GTGTTACAGGCGGGGTTTTT-3'， P2 :
5， -ACCACTGAACAAATGGCACT-3，。 引物P3、 P4的序列分別為P3 : 5' -ACCAAGGTATGTTGCCCGTT-3 ， ， P4 :5' -AAATGGCACTAGTAAACTGAGCCA-3'。
套式PCR的建立 套式PCR反應(yīng)在25iiL反應(yīng)體系中最佳反應(yīng)條件為，退火溫度55t:， Taq DNApolymeraselU，引物濃度1Oiimol/L能有效擴(kuò)增出了其目的片段，分別為509bp、240bp，引物間無非特異性片段產(chǎn)生(見圖1)。結(jié)果表明奶牛乙肝套式PCR檢測方法建立成功。
敏感性試驗(yàn) 應(yīng)用TIANamp病毒基因組DNA提取試劑盒從奶牛血清中提取的奶牛類HBV病毒 DNA，用蛋白質(zhì)核酸儀測定濃度后，經(jīng)5倍系列稀釋的病毒核酸用于套式PCR敏感性試驗(yàn)。 第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在509bp附近有DNA亮帶，奶牛類HBV模板最低檢測量為lpg(見圖 2)。在509bp附近沒有DNA亮帶，以第一次PCR產(chǎn)物作為模板進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在 240bp附近有DNA亮帶，結(jié)果建立的奶牛類HBV病毒套式PCR能檢測到初始模板0. 32fg的 病毒(見圖3)。結(jié)果表明建立的PCR敏感性高。
特異性試驗(yàn) 以人HBV、奶牛類HBV、 CBPP、 TB， BVDV反轉(zhuǎn)錄為cDNA為模板，應(yīng)用引物P_l、 P_l、 P-2、 P-3、 P-4分別進(jìn)行第1次PCR擴(kuò)增和套式PCR反應(yīng)。結(jié)果，以人HBV、奶牛類HBV DNA 均擴(kuò)增出各病毒的特異性條帶，以BVDV、CBPP、TB為模板分別進(jìn)行套式PCR反應(yīng)均未擴(kuò)增出 條帶(見圖4、圖5)。結(jié)果表明建立的PCR特異性強(qiáng)。
試劑盒的保存期檢測 將試劑盒保存在4°C 、_20°C分別于1月、3月、6月、1年，對陽性樣品進(jìn)行檢測，4°C 保存1年條帶較淡，_201:保存1月、3月、6月、1年條帶亮度無影響。 根據(jù)GenBank中人HBV S基因，設(shè)計(jì)了 2對引物，通過對PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化， 建立了檢測奶牛類HBV的套式PCR診斷方法。結(jié)果表明，該方法第1次PCR擴(kuò)增的敏感性 是lpg，第2次PCR敏感性是0. 32fg，擴(kuò)增產(chǎn)物分別為509bp、240bp，而牛病毒性腹瀉病毒 (BVDV)、牛傳染性胸膜肺炎(CBPP)、牛結(jié)核桿菌(TB)的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。本試劑盒具有 很好的特異性，其敏感性比常規(guī)PCR(第1次PCR)提高了 5M咅，為獸醫(yī)臨床診斷奶牛類HBV 提供一種快速、準(zhǔn)確的方法，并為開展大規(guī)模的奶牛類HBV流行病學(xué)調(diào)查與疫情監(jiān)測提供 技術(shù)依據(jù)。同時(shí)目前未見奶牛類HBV病毒大量培養(yǎng)的報(bào)道，奶牛類HBV難以獲得大量病原 體。本研究得到HBV-S質(zhì)粒作為PCR的陽性模板，用于臨床檢測具有很高的安全性和應(yīng)用 價(jià)值。 由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明采用PCR對樣品進(jìn)行檢測，通過檢測結(jié)果與陰 性對照及陽性對照比較，可以得到檢測結(jié)論，從而起到快速檢測樣品中所含有的奶牛乙型 肝炎病毒的目的。本發(fā)明檢測結(jié)果準(zhǔn)確、特異，檢測方式簡單，使用效果好。


附圖1為HBV套式PCR電泳結(jié)果；M :DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 :人HBV PCR產(chǎn)物；2 :奶牛HBV PCR產(chǎn)物；3 :人HBV PCR 產(chǎn)物；4 :奶牛HBV PCR產(chǎn)物；5 :空白水對照。
附圖2為第1次PCR擴(kuò)增的敏感試驗(yàn)；M :DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 :奶牛HBV PCR產(chǎn)物2 :空白水對照；3 9 : 5—1 5—7
稀釋的病毒DNA PCR結(jié)果。 附圖3為第2次PCR擴(kuò)增的敏感試驗(yàn)； M :DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 :奶牛HBV PCR產(chǎn)物2 :空白水對照；3 9 : 5—7 5—12 稀釋的病毒DNA PCR結(jié)果；
附圖4為第1次PCR擴(kuò)增的特異性試驗(yàn)；M :DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1 :人HBV PCR產(chǎn)物;2 :奶牛HBV PCR產(chǎn)物;3 :BVDV PCR
產(chǎn)物;4 :CBPP PCR產(chǎn)物;5 :TB PCR產(chǎn)物;6 :陰性對照; 附圖5為第1次PCR擴(kuò)增的特異性試驗(yàn)；M :DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1 :人HBV PCR產(chǎn)物;2 :奶牛HBV PCR產(chǎn)物;3 :BVDV PCR
產(chǎn)物;4 :CBPP PCR產(chǎn)物;5 :TB PCR產(chǎn)物;6 :陰性對照。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施例方式奶牛乙型肝炎PCR快速診斷試劑盒，它包括40 L等體積 混合的引物Pl、 P2，引物Pl、 P2的序列分別為PI :5' -GTGTTACAGGCGGGGTTTTT-3'， P2 :5， -ACCACTGAACAAATGGCACT-3'，引物Pl、 P2的濃度均為20 ii M， 40 ii L等體積混 合的引物P3、 P4，引物P3、 P4的序列分另U為P3 :5' -ACCAAGGTATGTTGCCCGTT-3' ， P4 : 5' -AAATGGCACTAGTAAACTGAGCCA-3'，引物P3、P4的濃度均為20 ii M，采用50mM的Tris-HcL 及150mM的NaCL的混合溶液600 y L作為緩沖液，采用20 y L超純水作為陰性對照，250 y L 天根生化科技(北京)有限公司的PCR MasterMix產(chǎn)品的PCR酶，它組成包括lOmM的 Tris-HcL、50mM的KCL、1. 5mM的MgCL2、25mM的dNTP Mixture以及0. 05U的Poymerase/uL， 超純水170 ii L ;50 ii L的MarkerDL2000 ;采用20 y L重組pMD18_T-HBV_S質(zhì)粒作為陽性對 昭。
權(quán)利要求
一種奶牛乙型肝炎PCR快速診斷試劑盒，其特征在于它包括40μL等體積混合的引物P1、P2，引物P1、P2的濃度均為20μM，40μL等體積混合的引物P3、P4，引物P3、P4的濃度均為20μM，緩沖液600μL，陰性對照20μL，PCR酶250μL，超純水170μL，50μL的MarkerDL2000以及陽性對照20μL。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛乙型肝炎PCR快速診斷試劑盒，其特征在于緩沖液為 50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛乙型肝炎PCR快速診斷試劑盒，其特征在于陰性對照 為超純水。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛乙型肝炎PCR快速診斷試劑盒，其特征在于陽性對照 為重組pMD18-T-HBV-S質(zhì)粒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛乙型肝炎PCR快速診斷試劑盒，其特征在于PCR酶的組 成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1. 5mM的MgCL2、25mM的dNTP Mixture以及0. 05U 的Poymerase/uL。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛乙型肝炎PCR快速診斷試劑盒，其特征在于引物P1、P2 的序列分別為Pl :5' —GTGTTACAGGCGGGGTTTTT-3'， P2 :5' -ACCACTGAACAAATGGCACT—3'。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的奶牛乙型肝炎PCR快速診斷試劑盒，其特征在于引物P3、P4 的序列分別為P3 :5' -ACCAAGGTATGTTGCCCGTT-3，， P4 :5' -AAATGGCACTAGTAAACTGAGCCA-3，。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種奶牛乙型肝炎PCR快速診斷試劑盒，它包括40μL等體積混合的引物P1、P2，引物P1、P2的濃度均為20μM，40μL等體積混合的引物P3、P4，引物P3、P4的濃度均為20μM，緩沖液600μL，陰性對照20μL，PCR酶250μL，超純水170μL，50μL的MarkerDL2000以及陽性對照20μL。本發(fā)明采用PCR對樣品進(jìn)行檢測，通過檢測結(jié)果與陰性對照及陽性對照比較，可以得到檢測結(jié)論，從而起到快速檢測樣品中所含有的奶牛乙型肝炎病毒的目的。本發(fā)明檢測結(jié)果準(zhǔn)確、特異，檢測方式簡單，使用效果好。
文檔編號C12Q1/70GK101760567SQ20101030084
公開日2010年6月30日 申請日期2010年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日
發(fā)明者余波, 冉懋韜, 艾玉萍, 蔡一鳴, 譚詩文 申請人:貴州省畜牧獸醫(yī)研究所