專利名稱：Fbp1基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一個新抑癌基因FBPl基因在制備腫瘤診斷、預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素多步驟的過程，涉及到癌基因的活化和抑癌基因的失活。通過檢測這些癌基因和抑癌基因的改變，可以在分子水平上早期檢測到腫瘤的發(fā)生， 從而為及時的干預(yù)治療創(chuàng)造機會。隨著腫瘤研究的不斷深入，目前腫瘤的診斷和臨床治療都已經(jīng)開始在分子水平展開。通過基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，新的腫瘤相關(guān)分子標(biāo)記正不斷被開發(fā)，腫瘤早期診斷的水平日益提高。同時，在腫瘤分子診斷的基礎(chǔ)上，開展針對腫瘤細胞的特異性治療，可以避免對正常細胞的毒副作用，增加治療劑量，提高治療效果。由于抑癌基因一般在腫瘤細胞中異常失活，因此恢復(fù)抑癌基因的功能一直以來被認為是抑制腫瘤進展的有效方法。而且，抑癌基因本身在正常組織中表達并發(fā)揮預(yù)防腫瘤發(fā)生的重要作用，因此，促進抑癌基因的表達一般對正常細胞沒有明顯毒副作用，是一種相對安全的腫瘤特異性治療方法。目前，已經(jīng)有以恢復(fù)抑癌基因表達為目的的腫瘤治療手段應(yīng)用于腫瘤的臨床治療，例如P53腺病毒等。隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的抑癌基因被發(fā)現(xiàn)和鑒定，不僅拓展了我們對腫瘤發(fā)生的認識，也為腫瘤診治手段的開發(fā)提供了更多的方向。果糖-1，6- 二磷酸作為糖酵解途徑中重要的反應(yīng)中間體受到果糖-6-磷酸酶和果糖-1，6-二磷酸酶(Fructose-1,6-bisphos-phatase, FBP)的雙重調(diào)控。已有研究表明，腫瘤細胞中果糖_6_磷酸酶水平發(fā)生上調(diào)，但FBP基因在腫瘤細胞中是否也發(fā)生變化以及其對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用，至今還不清楚。在哺乳動物細胞中存在兩種FBP基因的同工酶，其中FBP2基因只存在于肌肉中， 而FBPl基因分布更為廣泛。FBPl基因(Genbank No. NM_000507)，與腫瘤發(fā)生的關(guān)系尚未清楚，有待進一步研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種新的抑癌基因在制備腫瘤診斷、預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用。為實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，發(fā)明人提供如下技術(shù)方案 FBPl基因在制備腫瘤診斷、預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用。發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BPl基因是一種新的抑癌基因，該抑癌基因在腫瘤細胞以及腫瘤組織中特異性低表達，并且具有抑制腫瘤細胞生長的作用，因此，在篩選FBPl基因低表達的腫瘤細胞的基礎(chǔ)上，特異性恢復(fù)該抑癌基因在腫瘤細胞中的表達，有望成為腫瘤靶向治療的一種新方法和手段。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的FBPl基因在制備腫瘤診斷、預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用，其中，所述的腫瘤診斷藥物中至少包括一對特異擴增FBPl基因的引物，所述的引物由上游引物和下游引物組成，其中，所述的上游引物(hFBPl-F)具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；下游引物(hFBPl-R)具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的FBPl基因在制備腫瘤診斷、預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用，其中，所述的腫瘤診斷藥物以FBPl基因為基礎(chǔ)的檢測手段，所述的檢測手段包括 RT-PCT和實時定量PCR。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的FBPl基因在制備腫瘤診斷、預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用，其中，所述的腫瘤預(yù)防或治療藥物以FBPl基因為靶點。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的FBPl基因在制備腫瘤診斷、預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用，其中，所述的腫瘤包括但不限于胃癌腫瘤。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的FBPl基因在制備腫瘤診斷、預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用，其中，所述的藥物為藥劑學(xué)上可接受的任何一種劑型，包括粉劑、注射液、膠囊、片劑或口服液等。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點
本發(fā)明提供了一種新抑癌基因在制備腫瘤診斷、預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用，以FBPl基因為基礎(chǔ)的診斷藥物可方便快捷的在分子水平上實現(xiàn)腫瘤的檢測，同時，以FBPl基因為靶點和核心的藥物可望成為腫瘤靶向治療的一種新手段。


圖1是FBPl基因在胃癌細胞中的表達分析(RT-PCR法)。FBPl基因在大部分胃癌細胞中的表達降低。圖2是FBPl基因在胃癌組織中的表達分析(RT-PCR法)。相對于正常對照組織， 腫瘤組織中的FBPl基因表達明顯下調(diào)。胃癌(Tumor)與正常胃粘膜組織(Normal)，22對， ρ < 0. Ol0圖3是FBPl基因表達載體的構(gòu)建示意圖。圖4是RT-PCR法檢測FBPl基因表達載體轉(zhuǎn)染前后的基因表達情況。圖5是應(yīng)用集落形成實驗來分析FBPl基因的抑癌功能。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染FBPl基因表達載體以恢復(fù)FBPl基因在腫瘤細胞中表達后，腫瘤細胞的集落形成能力受到明顯抑制(/7 < 0.01)。對照組是空載體(pcDNA3. 1)；數(shù)據(jù)來自3次不同的實驗(均值士標(biāo)準(zhǔn)差的形式)。圖6是應(yīng)用細胞生長曲線實驗來分析FBPl基因的抑癌功能。數(shù)據(jù)來自3次不同的實驗(均值士標(biāo)準(zhǔn)差的形式)。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染FBPl基因表達載體以恢復(fù)FBPl基因在腫瘤細胞中表達后，腫瘤細胞的生長受到明顯抑制(/7 < 0.01)。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例和說明書附圖，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。若無特別指明，實施例采用的方法為本領(lǐng)域通用技術(shù)。本發(fā)明所述的新抑癌基因FBPl基因在開發(fā)腫瘤診斷、預(yù)防和治療手段中的應(yīng)用， 可參考常規(guī)的藥物配置方法和試劑開發(fā)。藥物劑型和生物制劑為醫(yī)學(xué)上認可的任何一種劑型，例如為粉劑、注射液、膠囊、片劑或口服液。實施例中未注明具體條件的實驗方法，是按照常規(guī)條件，例如Sambrook等作者的分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商說明書建議的條件。試驗試劑Highfidelity PFU DNA聚合酶，Trizol試劑，小牛血清(FBS)，磷酸鹽緩沖液(PBS)，RPMI-1640培養(yǎng)基，青霉素-鏈霉素(P/S)和0. 25%(ff/V)胰蛋白酶/1 mM EDTA (Trypsin-EDTA)購于 Invitrogen (USA)。GoTaq 聚合酶從 Promega (USA)購得。腫瘤細胞系(AGS, Kato III，MKN28, MKN45, NCI-N87, SNUl 和 SNU16)分別從日本的 Riken BioResource Center細胞庫和美國的ATCC購買。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)使用High Capacity cDNA Reverse Transcription 試劑盒(美國 Applied Biosystem 公司)。實施例1 RT-PCR實驗檢測FBPl基因在腫瘤細胞中的表達 1.細胞培養(yǎng)
所有細胞均采用RPMI-1640培養(yǎng)基，其中含100 U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素和 10%FBS，于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。2.總RNA抽提試劑盒
細胞的總RNA是用Invitrogen公司的Trizol試劑按照生產(chǎn)廠商提供的方法分離提取。該試劑是基于酸性酚一步抽提法生產(chǎn)的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要進行無 RNA酶處理，以保證實驗中無RNA酶的環(huán)境。3.總RNA的抽提
培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期，吸干培養(yǎng)液后，直接加入Iml Trizol，室溫下靜置5分鐘，收集細胞到1. 5ml離心管中。加入氯仿后，4°C離心分層；將上層水相轉(zhuǎn)入新鮮1. 5ml離心管，加入Iml異丙醇，4°C離心沉淀RNA ；用1. 5ml75%乙醇洗滌沉淀2次；用無RNA酶的去離子水溶解沉淀。抽提的RNA質(zhì)量鑒定紫外分光光度計測定260/280比值(確認比值均在1. 7-2. 0)。并在MOPS甲醛變性膠中觀察有無降解。作為對照的正常胃組織的總RNA從 Clontech公司購買。4. cDNA 的合成
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)使用美國 Applied Biosystem 公司的 High Capacity cDNA Reverse Transcription試劑盒，每個反應(yīng)使用2微克總RNA。加入2 X RT bufferlO微升和總RNAlO 微升，反應(yīng)總體積為20微升。使用ABI PCR儀進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，具體運行參數(shù)如下25°C 10分鐘；37° C 120分鐘；85° C 5分鐘；冷卻至4° C0 -20° C保存?zhèn)溆谩?. PCR
細胞FBPl的表達水平通過常規(guī)PCR法來檢測，使用美國Promega公司的GoTaq聚合酶。 反應(yīng)總體積為20微升采用1微升cDNA模板，加入2 XPCR bufferlO微升，高純?nèi)ルx子水 9微升。反應(yīng)參數(shù)如下95°C預(yù)變性2分鐘；35個循環(huán)設(shè)置如下，95°C變性30秒；55°C退火30秒，72° C延伸30秒；最后72° C延伸10分鐘。1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物(結(jié)果見圖1)。PCR使用所有引物均在Invitrogen公司合成。具體序列如下 Human FBPl 的 RT-PCR 引物
hFBPl-F (上游引物):ACAGCAGTCAAAGCCATCTC (SEQ ID Ν0· 1)；hFBPl-R (下游引物)GGTTCCACTATGATGGCGTG (SEQ ID NO. 2), Human GAPDH 的 RT-PCR 引物 hGAPDH-F :GGAGTCAACGGATTTGGT (SEQ ID NO. 3)； hGAPDH-R :GTGATGGGATTTCCATTGAT (SEQ ID NO. 4)。6.結(jié)果分析
FBPl基因在腫瘤細胞中的表達明顯下降(見圖1)。
實施例2 實時定量PCR實驗檢測FBPl基因在腫瘤組織中的表達 1.組織分離
所有標(biāo)本均經(jīng)病理確認。手術(shù)切除標(biāo)本一經(jīng)離體，迅速切取腫瘤病灶及癌旁組織，放入液氮中保存。2.總 RNA 抽提
將勻漿器等在200°C干烤4小時，去除RNA酶，冷卻；將組織從液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙將組織放入預(yù)先加入TRIzoI試劑的勻漿器中，勻漿數(shù)分鐘；將勻漿后的液體轉(zhuǎn)入無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4° C離心分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加異丙醇，4° C離心沉淀RNA ；用75%乙醇洗滌沉淀2次；風(fēng)干后無RNA酶的去離子水溶解沉淀。抽提的RNA質(zhì)量鑒定紫外分光光度計測定260/280nm比值，比值均在1. 7_20。 通過MOPS甲醛變性膠觀察有無RNA降解。3. cDNA合成均參照實施例1。4.實時定量PCR
采用定量實時RT-PCR來比較分析組織中FBPl的mRNA水平，用GAPDH作為對照。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)使用美國Applied Biosystem公司的定量RT-PCR試劑盒(Power Sybr green)。反應(yīng)總體積為20微升采用1微升cDNA模板，加入2XPCR bufferlO微升，高純?nèi)ルx子水9微升。反應(yīng)參數(shù)如下95°C預(yù)熱2分鐘；40個循環(huán)設(shè)置如下，95° C，30秒；60° C， 1分鐘；最后進行溶解曲線分析(結(jié)果見圖2)。5.結(jié)果分析
FBPl基因在胃癌腫瘤組織中的表達明顯下降(見圖2)。實施例3 FBPl cDNA的克隆和表達載體的構(gòu)建 1.克隆專用cDNA的合成
逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)使用美國 Invitrogen 公司的 SuperScipt III First Synthesis System for RT-PCR試劑盒，每個反應(yīng)使用2微克總RNA。反應(yīng)總體積為20微升10 X RT buffer 2 微升，總 RNA 5 微升，01igodT20 引物 1 微升，IOmM dNTPl 微升，25mM MgCl2 4 微升，0. IM DTT 1微升，RNaseOUT 1微升，SuperScript III逆轉(zhuǎn)錄酶1微升，高純?nèi)ルx子水 4微升。使用ABI PCR儀進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，具體運行參數(shù)如下25°C 10分鐘；37°C 120分鐘；85°C 5分鐘；冷卻至4°C。_20°C保存?zhèn)溆谩?0°C 50分鐘，85°C 5分鐘，冷卻至4°C后加入RNaseH，37°C孵育20分鐘。-20° C保存?zhèn)溆谩?. FBPl cDNA 的克隆
全長FBPl基因的開放閱讀框采用RT-PCR的方法從正常胃組織的總RNA中擴增獲得， 其中聚合酶連反應(yīng)(PCR)使用美國Invitrogen公司的highfidelity PFU DNA聚合酶。反應(yīng)總體積為50微升5XPCR緩沖液10微升，IOmMdNTP 1微升，引物各1微升，PFU酶0. 4微升，cDNA模板5微升，高純?nèi)ルx子水32. 6微升。PCR反應(yīng)參數(shù)如下96° C預(yù)變性4分鐘； 反應(yīng)37個循環(huán)95°C變性30秒；58° C退火30秒；72° C延伸1分鐘。運用TOPO技術(shù)，連接到TOPO PCR Blunt載體(美國Invitrogen公司)。具體步驟如下取新鮮PCR產(chǎn)物2微升，加入TOPO載體1微升，試劑盒中氯化鈉溶液1微升，高純無離子水2微升。室溫下孵育10分鐘后。 開始細菌轉(zhuǎn)化將TOPO反應(yīng)產(chǎn)物加入冰浴融化的感受態(tài)細菌中，冰浴孵育半小時，42° C熱休克90秒，加入試劑盒中SOB培養(yǎng)液1毫升，37° C低速培養(yǎng)1小時，再將細菌培養(yǎng)液接種在含青霉素培養(yǎng)LB板中繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)過夜。第二天，挑取克隆培養(yǎng)，經(jīng)測序選擇正確克隆。3. FBPl的克隆引物
FBPl-cFGCCACCATGGATTACAAGGATGACGATGACAAGGATTGTTACAGAACTTC (SEQ ID NO. 5) FBPl-cR: GTTAGAGTTTTGTTGACATGATGA (SEQ ID NO. 6) 4. FBPl表達載體的構(gòu)建(圖3)
抽提正確克隆的質(zhì)粒，用EcoR I酶切后，經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離回收目的片段，連入線性化的pcDNA3. 1。連接反應(yīng)如下載體1微升，回收插入子5微升，連接酶緩沖液2微升， T4 DNA連接酶1微升(Roche Applied Science公司產(chǎn)品)。16°C連接過夜。過夜連接產(chǎn)物參照步驟2中的細菌轉(zhuǎn)化程序進行轉(zhuǎn)化和細菌接種。挑取克隆培養(yǎng)，經(jīng)酶切和測序雙鑒定后，保存正確克隆，使用Qiagen公司的質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，用于基因轉(zhuǎn)染。5.結(jié)果分析
經(jīng)RT-PCR法測定FBPl在表達載體轉(zhuǎn)染后腫瘤細胞中明顯表達，證實FBPl的哺乳動物表達載體構(gòu)建成功(見圖4)。實施例4集落形成法分析FBPl基因的抑癌功能 1.操作過程
利用克隆形成實驗(Colony Fomation Assay)來檢測FBPl基因?qū)δ[瘤癌細胞生長的作用。100000個細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜，使用德國Roche Applied Science 公司的FUGENE 6試劑轉(zhuǎn)染FBPl質(zhì)粒，并使用空的pcDNA3. 1載體作為對照。轉(zhuǎn)染48小時后，轉(zhuǎn)染的細胞均分成分成三組重新接種，并使用含有400微克每毫升G418的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)10-15天，形成的克隆先用甲醇固定，然后用龍膽紫染色，大于等于50個細胞的克隆被統(tǒng)計用于分析。2.結(jié)果分析
在AGS和MKN28細胞中，當(dāng)外源轉(zhuǎn)入FBPl基因后，腫瘤細胞形成克隆的能力被明顯抑制(見圖5)。實施例5細胞生長曲線法分析FBPl的功能 1.操作過程
利用細胞生長曲線實驗來檢測FBPl基因?qū)δ[瘤細胞生長的作用?；蜣D(zhuǎn)染同實施例 4。轉(zhuǎn)染細胞用含有400微克每毫升G418的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選，獲得的穩(wěn)定細胞株在12孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)并連續(xù)4-5天使用臺酚藍染色進行活細胞計數(shù)，所得結(jié)果如圖6所示，穩(wěn)定表達FBPl基因的細胞株的增殖能力顯著低于對照的空載體細胞株。2.結(jié)果分析當(dāng)外源轉(zhuǎn)入FBPl基因后，腫瘤細胞的生長能力被明顯抑制(見圖6)。結(jié)論
FBPl基因在腫瘤細胞和腫瘤組織中表達下降；通過克隆FBPl cDNA,構(gòu)建FBPl基因的哺乳動物表達載體，發(fā)現(xiàn)恢復(fù)FBPl基因在腫瘤細胞中的表達，可以抑制腫瘤細胞的生長。 以上結(jié)果表明FBP1基因是一個新的抑癌基因。檢測FBPl基因的表達可以用于腫瘤的診斷。而恢復(fù)FBPl基因的抑癌功能可以達到治療腫瘤的目的。因此，F(xiàn)BPl基因在腫瘤的診斷、預(yù)防以及治療中均有一定的應(yīng)用價值。盡管發(fā)明人已經(jīng)對本發(fā)明的技術(shù)方案做了較為詳細的闡述和列舉，應(yīng)當(dāng)理解，對于本領(lǐng)域一個熟練的技術(shù)人員來說，對上述實施例作出修改和/或變通或者采用等同的替代方案是顯然的，都不能脫離本發(fā)明精神的實質(zhì)，本發(fā)明中出現(xiàn)的術(shù)語用于對本發(fā)明技術(shù)方案的闡述和理解，并不能構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
權(quán)利要求
1.FBPl基因在制備腫瘤診斷、預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FBPl基因在制備腫瘤診斷、預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤診斷藥物中至少包括一對特異擴增FBPl基因的引物，所述的引物由上游引物和下游引物組成，其中，所述的上游引物具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；下游引物具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FBPl基因在制備腫瘤診斷、預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤診斷藥物以FBPl基因為基礎(chǔ)的檢測手段，所述的檢測手段包括RT-PCT 和實時定量PCR。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FBPl基因在制備腫瘤診斷、預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤預(yù)防或治療藥物以FBPl基因為靶點。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FBPl基因在制備腫瘤診斷、預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤包括胃癌腫瘤。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的FBPl基因在制備腫瘤診斷、預(yù)防或治療藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為藥劑學(xué)上可接受的任何一種劑型，包括粉劑、注射液、膠囊、 片劑或口服液。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一個新抑癌基因FBP1基因在制備腫瘤診斷、預(yù)防和治療藥物中的應(yīng)用。該抑癌基因在腫瘤細胞以及腫瘤組織中特異性低表達，并且具有抑制腫瘤細胞生長的作用，因此篩選低表達該抑癌基因的腫瘤，特異性恢復(fù)該抑癌基因在腫瘤細胞中的表達，為腫瘤靶向治療提供了一種新方法。
文檔編號A61P35/00GK102443634SQ20111036527
公開日2012年5月9日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者劉昕, 王嫻, 金洪傳 申請人:浙江大學(xué)