專利名稱：電子基因芯片的制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于基因芯片(Genechip)的制備領域，具體是一種可采用電子檢測器對DNA雜交過程中電信號產(chǎn)生的變化進行定量檢測的電子基因芯片的制備方法。即本發(fā)明所得到的電子基因芯片使得采用電子檢測器來檢測基因芯片的信號得以實現(xiàn)。
基因芯片(Genechip)又稱DNA芯片(DNAChip)。它是在基因探針的基礎上研制出的，所謂基因探針只是一段人工合成的堿基序列，在探針上連接一些可檢測的物質(zhì)，根據(jù)堿基互補的原理，利用基因探針到基因混合物中識別特定基因。它將大量探針分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分析。然而，現(xiàn)有的基因芯片技術(shù)在現(xiàn)階段的應用還有很大的障礙。存在的問題主要由其檢測方法所導致，而其檢測方法是由其制備方法所決定的，具體表現(xiàn)在以下幾個方面1、基因芯片的專用設備造價和單次檢測成本都很高，一般只有大型制藥公司和經(jīng)費充足的科研院所才能承受。一套商品化的基因芯片信號檢測與分析系統(tǒng)，包括熒光掃描儀、計算機及其軟件等，大約價值20萬美元。就應用型基因芯片如診斷芯片來講，一個很普通的傳染病檢測芯片單次檢測成本就要約二百元人民幣。由于成本是能否實現(xiàn)廣泛應用的首要問題，所以現(xiàn)有基因芯片普及性應用的難度非常大。
2、現(xiàn)有基因芯片技術(shù)得到的熒光掃描信號，只能認為是一種定性或半定量的信號結(jié)果，而不能進行精確的數(shù)字化分析。這一方面對基因芯片得到的大量生物學數(shù)據(jù)的進一步分析帶來很大的不便，同時也降低了信號檢測的靈敏度與可靠性。
3、現(xiàn)有基因芯片技術(shù)要求對樣品進行復雜的預處理，主要表現(xiàn)為需對樣品進行熒光標記。對于單色熒光標記，雖然預處理過程相對簡單，但不能得到很好的信號；而四色熒光標記信號雖然較好，但預處理過程相對復雜。這種預處理過程，需要專業(yè)人員經(jīng)過專門的培訓才能夠完成。
綜上所述，現(xiàn)階段基因芯片還僅僅停留在實驗室階段，局限于科研領域，離正式投入應用還有相當大的距離。
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，為人們提供一種可采用電子檢測器對DNA雜交過程中電信號產(chǎn)生的變化進行定量檢測的電子基因芯片的制備方法，從而解決上述由熒光檢測方法帶來的一系列問題。即本發(fā)明所得到的產(chǎn)品—電子基因芯片使得采用電子檢測器來檢測基因芯片的信號得以實現(xiàn)，由此可以大幅度降低檢測成本。本發(fā)明使基因芯片技術(shù)成為一種更加低廉、更加準確、更加靈敏的完善的技術(shù)，從而實現(xiàn)平民化，進入廣泛的應用領域，為全人類造隔。
本發(fā)明的技術(shù)方案是通過下述技術(shù)方案來實現(xiàn)的。
本發(fā)明的電子基因芯片的制備方法，其特點在于
a.將DNA探針點在噴鍍有金屬薄層的載體的基點上，完成DNA的固定；b.將含有電化學活性基團的溶液點在已固定的DNA表面，使已固定的DNA樣品5’末端帶上一電化學活性基團；c.所述DNA探針的結(jié)構(gòu)是
其中，********所示為兩段可以互補配對(A與T配對，G與C配對)的DNA序列；+++++++++++++++++所示為雜交過程中待檢測的特異性DNA片段(如10-30堿基)；所述兩端的甲基(CH2)數(shù)量n較好為0～10。
上述方案中，還可以將上述帶有電化學活性基團的電子基因芯片的金屬表面進一步浸于一定濃度的SH-(CH2)6-OH溶液中過夜，使金屬表面未結(jié)合DNA的部分為醇保護，以防止基質(zhì)的非特異性吸附。同時也可以使表面的DNA排列更為有序。所述濃度為1-50mM。
上述方案中，所述載體的制備方法可以采用通用的方法，如以玻璃片、陶瓷片、塑料片或者硅片等為載體。按一定電路設計覆蓋上掩模(mask)，在載體或稱基質(zhì)上真空噴鍍上一層鈦(粘附層)，然后再噴鍍上一層很薄的金屬，較好是金，形成放置DNA探針的基點(可多至數(shù)百至數(shù)千個)以及相應的電路，完成芯片的基質(zhì)及芯片電路的制作。
上述方案中，還可以進一步對芯片進行預處理，以獲得一個具有可重現(xiàn)性的，光滑的金表面，預處理可以采用常用的方法，如以下幾種方法a.用等離子體處理30分鐘后，迅速置于乙醇溶液中；b.用紫外-臭氧處理箱處理30分鐘后再用飽和堿溶液(如KOH)處理；c.用Piranha溶液(70％濃硫酸/30％雙氧水)高溫(高于90℃)處理20分鐘以上，然后在一定電位(-0.4V～-1.2V)下在堿溶液(如KOH，NaOH等)中進行電化學(循環(huán)伏安掃描)清洗。以上三種方法均為可行。清洗后的芯片保存于乙醇或其它有機溶劑中備用。
上述方案中，所述將DNA探針點在載體的基點上，完成DNA的固定的方法可以采用現(xiàn)有技術(shù)中的各種常用方法，如將制備好的DNA探針點在基點上，覆蓋表面后室溫反應超過5小時。3’-SH與Au的化學反應形成S-Au鍵，實現(xiàn)表面分子自組裝，從而完成DNA的固定。
本發(fā)明所述所述特異性DNA探針可以采用常規(guī)的固相合成方法制備并經(jīng)反相HPLC純化而得到，也可以直接從其它公司購取。在所述下列
結(jié)構(gòu)中，********所示為兩段可以互補配對(A與T配對，G與C配對)的DNA序列，如GCATGCGC與GCGCATGC；ATATCGCA與TGCGATAT等等。在未雜交狀態(tài)下，這兩段DNA能夠自身折疊，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)(Stem-loop)。研究表明，此莖環(huán)結(jié)構(gòu)對于目的基因的識別具有高度的親和性和選擇性，可以很好地區(qū)分單點突變，使本方法可用于SNPs(Single Nucleotide Polymorphisms，(單核苷酸多態(tài)性)檢測。其中+++++++++++++++++所示為雜交過程中待檢測的特異性DNA片段，其堿基數(shù)可以根據(jù)用途而設定，如可以是10～30個堿基，該段DNA決定了該芯片的用途。如該片段為HIV病毒DNA特征片段，則該芯片可用作進行AIDS的檢測；同理，如該片段為肝炎病毒DNA特征片段，則該芯片可用作進行肝炎的檢測。兩端的甲基(CH2)數(shù)量可以變化，從沒有到數(shù)十個均可。
本發(fā)明的電子基因芯片的制作工藝流程可以參見附圖2所示。
本發(fā)明的上述技術(shù)方案使基因芯片的生產(chǎn)采用了與現(xiàn)有芯片生產(chǎn)完全不同的技術(shù)，打破了美國在此領域的壟斷。該技術(shù)把成熟的微電子技術(shù)應用到基因芯片上，目前在全世界處于領先地位。本發(fā)明為人們提供了一種可采用電子檢測器對DNA雜交過程中電信號產(chǎn)生的變化進行定量檢測的電子基因芯片的制備方法。即本發(fā)明所得到的產(chǎn)品—電子基因芯片使得采用電子檢測器來檢測基因芯片的信號得以實現(xiàn)，由此可以帶來基因芯片的檢測技術(shù)發(fā)生根本性的變革，具體表現(xiàn)為1、檢測設備造價大幅度降低，用作信號檢測的電化學工作站，其造價遠遠低于現(xiàn)有基因芯片技術(shù)中使用的熒光掃描儀。2、該技術(shù)對信號的檢測是通過檢測莖環(huán)結(jié)構(gòu)(step-loop)的形成與破壞來進行。莖環(huán)結(jié)構(gòu)(step-loop)在識別目的基因時具有特殊的選擇性，可以很好的分辨單點突變。這是原有技術(shù)所不能做到的，能夠及其顯著地提高DNA雜交信號的精確性。3、本專利技術(shù)得到的電掃描信號，是一種定量的信號結(jié)果，能進行精確的數(shù)字化分析。這使對基因芯片得到的大量生物學數(shù)據(jù)的進一步分析成為可能，同時也大大提高了信號檢測的靈敏度與可靠性。4、本專利技術(shù)使得對待檢測的樣品不需要任何標記，使得預處理過程只需經(jīng)過簡單的培訓，任何人都能完成。
本發(fā)明的產(chǎn)品之所以具有上述優(yōu)點，其原理在于在雜交前，由于探針DNA兩端含有一段可完全配對的DNA序列，在自由狀態(tài)下，能形成徑環(huán)結(jié)構(gòu)(stem loop)。此時，探針的5’末端與3’末端是靠近的，而3’末端所攜帶的電化學活性基團在靠近Au表面時，能夠產(chǎn)生一個能用電化學工作站檢測的電信號。雜交完成后，由于位于探針中段的特異性DNA片段和樣品發(fā)生了DNA互補配對，形成正常的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，從而破壞了徑環(huán)結(jié)構(gòu)。此時，探針的5’末端與3’末端不再靠近，導致了原來的電化學信號的喪失。利用這個原理，能夠檢測DNA是否完成了雜交配對，也即能夠檢測在所設計的基因芯片上DNA的雜交信號。
附

圖1為技術(shù)原理圖。
圖中1、莖環(huán)結(jié)構(gòu)；2、Au表面；3、產(chǎn)生電信號；4、電信號消失；5、與外源DNA雜交配對。
下面通過實施例進一步描述本本發(fā)明，本發(fā)明不僅限于所述實施例。
實施例一本例的制備工藝步驟為1、首先，芯片基質(zhì)選用玻璃片，硅片與陶瓷片，進行試驗。在這三種基質(zhì)覆蓋上掩模(上有一小孔及從該孔導出的電路)，真空噴鍍上一層約10nm的鈦，然后再噴鍍上一層約300nm金，形成DNA探針的固定化表面以及電路。檢測表面光滑度。經(jīng)檢測，硅片上鍍金后，表面最為光滑。選用硅片基質(zhì)繼續(xù)試驗。
2、用以下三種方法處理已鍍金的硅片a、用等離子體處理，然后迅速置于乙醇溶液中；b、用紫外-臭氧處理箱處理，再用飽和KOH處理；c.用piranha溶液(70％濃硫酸/30％雙氧水)處理30min，然后在一定電位下于0.5M KOH溶液中電化學清洗。結(jié)果表明，以上三種方法均為可行未見明顯差異。清洗后的芯片保存于乙醇中備用。
3、采用常規(guī)的固相合成方法制備并經(jīng)反相HPLC純化而得到或直接從其它公司購取下述結(jié)構(gòu)的DNA探針5＇-NH2-(CH2)3-GCG AG- -CT CGC-(CH2)6-SH-3＇其中， 為本實驗中選用的特異性DNA序列，是pUC18載體上的一段。
4、人工將制備好的DNA探針(1uL，1mM)點在基點上，覆蓋表面后室溫過夜，此步驟稱作點樣。3’-SH與Au的化學反應形成S-Au鍵，實現(xiàn)表面分子自組裝，從而完成DNA的固定。
5、將含有5uL，3mM電化學基團(羧基二茂鐵)的溶液點在已固定的DNA表面，再加入10mM EDC/10mM NHS，反應1h。
6、將硅片浸于10mM的SH-(CH2)6-OH乙醇溶液中，等待雜交。用于電信號檢測的基因芯片制作完成。
實驗中發(fā)現(xiàn)，步驟2、6可以省去，但采用后產(chǎn)品質(zhì)量更好。如采用步驟2芯片進行預處理，可以獲得一個具有可重現(xiàn)性的，光滑的金表面，有利于后面的點樣操作；采用步驟6可以使金屬表面未結(jié)合DNA的部分為醇保護，以防止基質(zhì)的非特異性吸附。同時也可以使表面的DNA排列更為有序，使產(chǎn)品應用于對DNA雜交過程中電信號產(chǎn)生的變化進行定量檢測時檢測精確度更準。
實施例二本例為實施例一的檢測應用例。
1、將實施例一的芯片取出，用電化學工作站測定基點的電信號，為9uA(對Ag/AgCl，200mv)。
2、與實施例一相應，用于雜交的DNA選用pUC18載體，提取pUC18質(zhì)粒DNA(10uL，約1ug)，沸水浴5分鐘，迅速置于冰上，使DNA變性。
3、將變性的pUC18質(zhì)粒點在基點上，37℃保溫2小時。
4、用雙蒸水清洗芯片，并將芯片置于45℃的雙蒸水中漂洗數(shù)次，約30分鐘。
5、取出芯片，再次用電化學工作站測定基點的電信號，為2uA(對Ag/AgCl，200mv，該信號為檢測本底信號)。證明芯片上由于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的破壞，電信號基團遠離Au表面，而引起了電化學信號的消失。證明樣品中含有與探針DNA序列配對的DNA序列，即含有pUC18質(zhì)粒。
實施例三本例為電子基因芯片的制備與檢測例，其中芯片的制備與處理同實施例一。簡述過程如下合成或購買結(jié)構(gòu)如下所示的DNA序列5＇-NH2-(CH2)3-ATGCGT- -ACGCAT-(CH2)6-SH-3＇ 為本實驗中選用的特異性DNA序列，與實施例1相同，是pUC18載體上的一段，與之相應，用于雜交的DNA選用pUC18載體。人工將制備好的DNA探針(1uL，1mM)點在基點上，覆蓋表面后室溫過夜。3’-SH與Au的化學反應形成S-Au鍵，實現(xiàn)表面分子自組裝，從而完成DNA的固定。
將含有5uL，3mM電化學基團(羧基二茂鐵)的溶液點在已固定的DNA表面，再加入10mM EDC/10mM NHS，反應約1h。
將硅片浸于10mM的SH-(CH2)6-OH乙醇溶液中，等待雜交。用于電信號檢測的基因芯片制作完成。
將芯片取出，用電化學工作站測定基點的電信號，為8.7uA(vs.Ag/AgCl，200mv)。
提取pUC18質(zhì)粒DNA(10uL，約1ug)，沸水浴5分鐘左右，迅速置于冰上，使DNA變性。
將變性的pUC18質(zhì)粒點在基點上，約37℃保溫2小時左右。
用ddH2O清洗芯片，并將芯片置于45℃的ddH2O中漂洗數(shù)次，約30分鐘。
取出芯片，再次用電化學工作站測定基點的電信號，為2uA(對Ag/AgCl，200mv，該信號為檢測本底信號)。證明芯片上由于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的破壞，電信號基團遠離Au表面，而引起了電化學信號的消失。證明樣品中含有與探針DNA序列配對的DNA序列，即含有pUC18質(zhì)粒。
本實施例與實施例一相比，僅在形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列發(fā)生變化，結(jié)果表明，該專利方法中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)域的DNA序列可以進行變化。
實施例四本例仍為電子基因芯片的制備與檢測例，其中芯片的制備與處理同實施例一。簡述過程如下合成或購買結(jié)構(gòu)如下所示的DNA序列5 ＇-NH2-(CH2)3-GCG AG- -CT CGC-(CH2)6-SH-3＇ 為本實驗中選用的特異性DNA序列，是短小芽孢桿菌堿性蛋白酶基因中的一段，與之相應，用于雜交的DNA選用含有這段基因的質(zhì)粒載體。
人工將制備好的DNA探針(1uL，1mM)點在基點上，覆蓋表面后室溫過夜。
將含有5uL，3mM電化學基團(羧基二茂鐵)的溶液點在已固定的DNA表面，再加入10mM EDC/10mM NHS，反應1h。
將硅片浸于10mM的SH-(CH2)6-OH乙醇溶液中，等待雜交。用于電信號檢測的基因芯片制作完成。
將芯片取出，用電化學工作站測定基點的電信號，為10uA(vs.Ag/AgCl，200mv)。
提取含有短小芽孢桿菌堿性蛋白酶基因的質(zhì)粒DNA(10uL，約1ug)，沸水浴5分鐘，迅速置于冰上，使DNA變性。
將變性的質(zhì)粒點在基點上，37℃保溫2小時。
用ddH2O清洗芯片，并將芯片置于45℃的ddH2O中漂洗數(shù)次，約30分鐘。
取出芯片，再次用電化學工作站測定基點的電信號，為2uA(對Ag/AgCl，200mv，該信號為檢測本底信號)。證明芯片上由于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的破壞，電信號基團遠離Au表面，而引起了電化學信號的消失。證明樣品中含有與探針DNA序列配對的DNA序列，即含有短小芽孢桿菌堿性蛋白酶基因。
本實施例與實施例一相比，僅在待檢測的特異性DNA序列發(fā)生變化，結(jié)果表明，該專利方法中的特異性DNA區(qū)域的序列可以進行變化，即該專利方法可以用來檢測多種特異性DNA的存在。
實施例五本例仍為電子基因芯片的制備與檢測例，其中芯片的制備與處理同實施例一。簡述過程如下合成或購買結(jié)構(gòu)如下所示的DNA序列5＇-NH2-(CH2)3-GCG AG- -CTCGC-(CH2)6-SH-3＇ 為本實驗中選用的特異性DNA序列，是短小芽孢桿菌堿性蛋白酶基因中的一段，與之相應，用于雜交的DNA選用含有這段基因的PCR產(chǎn)物。
人工將制備好的DNA探針(1uL，1mM)點在基點上，覆蓋表面后室溫過夜。3’-SH與Au的化學反應形成S-Au鍵，實現(xiàn)表面分子自組裝，從而完成DNA的固定。
將含有5uL，3mM電化學基團(羧基二茂鐵)的溶液點在已固定的DNA表面，再加入10mM EDC/10mM NHS，反應1h。
將硅片浸于10mM的SH-(CH2)6-OH乙醇溶液中，等待雜交。用于電信號檢測的基因芯片制作完成。
將芯片取出，用電化學工作站測定基點的電信號，為10uA(vs.Ag/AgCl，200mv)。
將短小芽孢桿菌堿性蛋白酶基因的PCR產(chǎn)物(5uL，約0.5ug)沸水浴5分鐘，迅速置于冰上，使DNA變性。
將變性的pUC18質(zhì)粒點在基點上，37℃保溫2小時。
用ddH2O清洗芯片，并將芯片置于45℃的ddH2O中漂洗數(shù)次，約30分鐘。
取出芯片，再次用電化學工作站測定基點的電信號，為2uA(對Ag/AgCl，200mv，該信號為檢測本底信號)。證明芯片上由于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的破壞，電信號基團遠離Au表面，而引起了電化學信號的消失。證明樣品中含有與探針DNA序列配對的DNA序列，即含有短小芽孢桿菌堿性蛋白酶基因。
本實施例與實施例四相比，僅在樣品的來源發(fā)生變化，實施例四中樣品為提取的質(zhì)粒DNA，本實施例中樣品為PCR的產(chǎn)物。結(jié)果表明，該專利方法所需樣品可來自多種不同的方法。
權(quán)利要求
1.一種電子基因芯片的制備方法，其特征在于制備步驟為a.將DNA探針點在噴鍍有金屬薄層的載體的基點上，完成DNA的固定；b.將含有電化學活性基團的溶液點在已固定的DNA表面，使已固定的DNA樣品5’末端帶上一電化學活性基團；所述DNA探針的結(jié)構(gòu)是
其中，********所示為兩段可以互補配對(A與T配對，G與C配對)的DNA序列；+++++++++++++++++所示為雜交過程中待檢測的特異性DNA片段(如10-30堿基)；所述兩端的甲基(CH2)數(shù)量n較好為0～10。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電子基因芯片的制備方法，其特征在于將上述帶有電化學活性基團的電子基因芯片的金屬表面進一步浸于SH-(CH2)6-OH溶液中過夜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電子基因芯片的制備方法，其特征在于所述SH-(CH2)6-OH溶液的濃度為1-50mM
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電子基因芯片的制備方法，其特征在于所述載體的制備方法是以玻璃片、陶瓷片、塑料片或者硅片為載體，按一定電路設計覆蓋上掩模(mask)，在載體或稱基質(zhì)上真空噴鍍上一層鈦(粘附層)，然后再噴鍍上一層很薄的金屬，形成放置DNA探針的基點(可多至數(shù)百至數(shù)千個)以及相應的電路。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的電子基因芯片的制備方法，其特征在于所述金屬是金。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的電子基因芯片的制備方法，其特征在于進一步對芯片進行預處理，預處理方法是a.用等離子體處理30分鐘后，迅速置于乙醇溶液中；或b.用紫外-臭氧處理箱處理30分鐘后再用飽和堿溶液(如KOH)處理；或c.用Piranha溶液(70％濃硫酸/30％雙氧水)高溫(高于90℃)處理20分鐘以上，然后在一定電位(-0.4V～-1.2V)下在堿溶液(如KOH，NaOH等)中進行電化學(循環(huán)伏安掃描)清洗。清洗后的芯片保存于乙醇或其它有機溶劑中備用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電子基因芯片的制備方法，其特征在于所述DNA探針點在載體的基點上完成DNA的固定的方法是將制備好的DNA探針點在基點上，覆蓋表面后室溫反應超過5小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電子基因芯片的制備方法，其特征在于所述制備工藝流程為a.在硅片或玻片上鍍金，制作基點與電路；b.進行預處理；c.將DNA點樣在基點上；d.合成電化學基閉；e.表面保護；f.完成芯片的制備。
全文摘要
本發(fā)明是一種電子基因芯片的制備方法,其特點是a.將DNA探針點在噴鍍有金屬薄層的載體的基點上,完成DNA的固定；b.將含有電化學活性基團的溶液點在已固定的DNA表面,使已固定的DNA樣品5’末端帶上一電化學活性基團；所述DNA探針的結(jié)構(gòu)是:5′－NH
文檔編號C12Q1/68GK1422960SQ01129100
公開日2003年6月11日 申請日期2001年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月23日
發(fā)明者黃慶, 樊春海 申請人:黃慶, 樊春海