專利名稱：：水產(chǎn)品養(yǎng)殖致病菌的基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因芯片，具體涉及水產(chǎn)品養(yǎng)殖致病菌的基因芯片。
背景技術(shù)：
：由于自然資源的逐漸稀缺和人們的需求增強(qiáng)，目前多數(shù)水產(chǎn)品進(jìn)行了人工養(yǎng)殖，由于水產(chǎn)品在養(yǎng)殖過(guò)程中密度較大、水體富營(yíng)養(yǎng)化和水體流動(dòng)性較差，使得各種致病菌繁殖和傳染性增大，成為水產(chǎn)品養(yǎng)殖的重要難題，目前對(duì)水產(chǎn)品養(yǎng)殖中致病菌檢測(cè)手段較缺乏，養(yǎng)殖戶們只好采用茛據(jù)經(jīng)驗(yàn)和對(duì)各種致病菌都預(yù)防和殺滅的方式灑藥，不能對(duì)癥下藥，既造成了藥品浪費(fèi)，又達(dá)不到殺滅致病菌的應(yīng)有藥量?；蛐酒ㄒ怨杵⒉Ｆ?、金屬片、陶瓷片、聚丙烯或尼龍膜等基片作為固相載體，經(jīng)氨基、醛基或巰基的表面化學(xué)修飾，將寡聚核苷酸(DNA、cDNA、rDNA片段)、多肽和細(xì)胞等生物大分子的檢測(cè)探針及對(duì)照樣品以點(diǎn)陣(微陣列)的形式分布在固相載體上。目前已有家禽和家畜疫病診斷的基因芯片，如公告號(hào)為CN1181210，授權(quán)公告日為2004年12月22日，名稱為家禽和/或家畜疫病診斷性基因芯片及其用途的中國(guó)發(fā)明專利，和公告號(hào)為CN1260371，授權(quán)公告日為2006年6月21日，名稱為豬繁殖障礙綜合癥的基因芯片及其用途的中國(guó)發(fā)明專利，就公開(kāi)了檢測(cè)豬、雞的各種疾病的基因芯片。但目前沒(méi)有對(duì)水產(chǎn)品致病菌進(jìn)行高通量、微型化和自動(dòng)化檢測(cè)的基因芯片的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種對(duì)水產(chǎn)品致病菌的檢測(cè)具有高通量、微型化和自動(dòng)化的基因芯片；該基因芯片能快速檢測(cè)判讀多個(gè)屬和種的致病菌。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為水產(chǎn)品養(yǎng)殖致病菌的基因芯片，包括經(jīng)化學(xué)修飾的固相載體，在所述固相載體上點(diǎn)陣分布有檢測(cè)探針和質(zhì)控探針，所述檢測(cè)探針包括待測(cè)弧菌屬、霍亂弧菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、副溶血性弧菌、諾卡氏菌屬、螄魚(yú)諾卡氏菌、氣單胞菌屬、嗜水性氣單胞菌、鏈球菌屬、海豚鏈球菌的特異性16SrDNA序列和/或gyrB基因序列，所述質(zhì)控探針為PCR質(zhì)控陽(yáng)性寡聚核苷酸序列SEQIDNO:39、芯片固定陽(yáng)性對(duì)照寡聚核苷酸序列SEQIDNO:40、芯片雜交陰性對(duì)照寡聚核苷酸序列SEQIDNO:41、芯片雜交陽(yáng)性對(duì)照寡聚核苷酸序列SEQIDNO:42和芯片雜交空白對(duì)照，待測(cè)弧菌屬的為SEQIDNO:1序列和SEQIDNO:2序列，待測(cè)霍亂弧菌的為SEQIDNO:3序列和SEQIDNO:4序列，待測(cè)哈維氏弧菌的為SEQIDNO:5序列，待測(cè)溶藻弧菌的為SEQIDNO:6序列和SEQIDNO:7序列，待測(cè)鰻弧菌的為SEQIDNO:8序列、SEQIDNO:9序列、SEQIDNO:10序列和SEQIDNO:11序列，待測(cè)副溶血性弧菌的為SEQIDNO:12序列，待測(cè)諾卡氏菌屬的為SEQIDNO:13序列和SEQIDNO:14序列，待測(cè)螄魚(yú)諾卡氏菌屬的為SEQIDNO:15序列和SEQIDNO:16序列，待測(cè)氣單胞菌屬的為SEQIDNO:17序列和SEQIDNO:18序列，待測(cè)嗜水性氣單胞菌屬的為SEQIDNO:19序列，待測(cè)鏈球菌屬的為SEQIDNO:20序列和SEQIDNO:21序列，待測(cè)海豚鏈球菌的為SEQIDNO:22序列和SEQIDNO:23序列。所述檢測(cè)探針還包括待測(cè)河流弧菌、創(chuàng)傷弧菌、蘇伯利氣單胞菌、黃桿菌屬、嗜冷黃桿菌和變形桿菌屬的特異性16SrDNA序列和/或gyrB基因序列，待測(cè)河流弧菌的為SEQIDNO:24序列、SEQIDNO:25序列和SEQIDNO:26序列，待測(cè)創(chuàng)傷弧菌的為SEQIDNO:27序列、SEQIDNO:28序列和SEQIDNO:29序列，待測(cè)蘇伯利氣單胞菌的為SEQIDNO:30序列，待測(cè)黃桿菌屬的為SEQIDNO:31序列和SEQIDNO:32序列，待測(cè)嗜冷黃桿菌的為SEQIDNO:33序列、SEQIDNO:34序列、SEQIDNO:35序列和SEQIDNO:36序列，待測(cè)變形桿菌屬的為SEQIDNO:37序列和SEQIDNO:38序列；這樣使基因芯片所檢測(cè)的細(xì)菌又增加了2個(gè)屬和4個(gè)菌種，基本上覆蓋了水產(chǎn)品養(yǎng)殖中的常見(jiàn)和非常見(jiàn)的致病菌。上述SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:26、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37和SEQIDNO:38為16SrDNA序列。16SrRNA為所有細(xì)菌共有，是細(xì)菌進(jìn)化過(guò)程中最為保守的基因，16SrRNA基因大小適中，約1.5Kb左右，含有高度保守的基因片段，同時(shí)在不同的菌株間也含有變異的核酸片段。因其既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測(cè)序技術(shù)快速得到核酸序列，已成為理想的基因鑒定靶序列，具有屬或種的特異性。上述SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34和SEQIDNO:35屬于gyrB基因序列。gyrB基因?yàn)镈NA解旋酶B亞基蛋白(gyrB)基因，其廣范存在于各類細(xì)菌中，在水平層次上無(wú)相互轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，不隨著環(huán)境的變換而變化，且在進(jìn)化上比核糖體基因出現(xiàn)的還要早些，所以同樣可作為基因分類器(YamamotoandHarayama，1995，1996;Suzukietal.，2001;Yamamotoetal.，1999)。所述化學(xué)修飾為醛基修飾。所述的基因芯片在水產(chǎn)品養(yǎng)殖致病菌的檢測(cè)中應(yīng)用。所述基因芯片用于水產(chǎn)品養(yǎng)殖致病菌檢測(cè)的過(guò)程由檢測(cè)系統(tǒng)軟件自動(dòng)檢測(cè)，使結(jié)果分析和報(bào)告輸出一體化，達(dá)到簡(jiǎn)便快捷的優(yōu)點(diǎn)；檢測(cè)系統(tǒng)軟件由博奧生物公司開(kāi)發(fā)提供。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于水產(chǎn)品養(yǎng)殖致病菌的基因芯片，包括經(jīng)化學(xué)修飾的固相載體，在固相載體上點(diǎn)陣分布有檢測(cè)探針和質(zhì)控探針，檢測(cè)探針包括待測(cè)弧菌屬、霍亂弧菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、副溶血性弧菌、諾卡氏菌屬、螄魚(yú)諾卡氏菌、氣單胞菌屬、嗜水性氣單胞菌、鏈球菌屬、海豚鏈球菌的特異性16SrDNA序列和/或gyrB基因序列，質(zhì)控探針為PCR質(zhì)控陽(yáng)性寡聚核苷酸序列SEQIDNO:39、芯片固定陽(yáng)性對(duì)照寡聚核苷酸序列SEQIDNO:40、芯片雜交陰性對(duì)照寡聚核苷酸序列SEQIDNO:41、芯片雜交陽(yáng)性對(duì)照寡聚核苷酸序列SEQIDNO:42和芯片雜交空白對(duì)照；這樣該基因芯片具有體積小的優(yōu)點(diǎn)；該基因芯片能快速檢測(cè)判讀多個(gè)屬和種的致病菌，因此檢測(cè)上述細(xì)菌快捷和特異；加上檢測(cè)軟件后就可以自動(dòng)化檢測(cè)。因此本發(fā)明具有高通量、微型化和自動(dòng)化檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述?！?、固相載體(基片)的選取固相載體包括尼龍膜、纖維素膜、玻片、金屬片、硅片、陶瓷片、各種有機(jī)高分子制作的薄膜等，我們選擇尺寸為75.5mmX25.2mmX1.0mm的玻片作為基片；根據(jù)大批量的玻片測(cè)定結(jié)果和點(diǎn)樣儀對(duì)點(diǎn)樣基片的要求，要求長(zhǎng)寬尺寸誤差《士0.2mm，厚度誤差《士0.05mm。同時(shí)要求外觀無(wú)劃痕、無(wú)缺損。二、基片表面化學(xué)修飾玻片表面要經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾后，才能牢固地固定DNA，現(xiàn)有的玻片表面化學(xué)修飾主要有氨基修飾、醛基修飾和巰基修飾。我們選擇醛基修飾得醛基基片，具體制作過(guò)程為硅羥基化的玻片用3-氨丙基三乙氧基硅烷處理，使玻片表面帶上一層末端氨基，然后用戊二醛處理，戊二醛分子兩端的醛基可以和玻片表面的氨基形成希夫堿，將它們以長(zhǎng)鏈碳橋的形式連接起來(lái)。再用NaBH4或NaCNBH3還原希夫堿形成穩(wěn)定的雙鍵。三、醛基基片性能檢測(cè)親疏水性能檢測(cè)通過(guò)接觸角測(cè)量?jī)x檢測(cè)水在基片表面的接觸角情況，接觸角在55±5°范圍的基片此項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)合格?；尘皺z測(cè)制備完成后的基片經(jīng)晶芯^LuxScanTMIOK微陣列芯片掃描儀在PMT/Power=90/900的參數(shù)下掃描，其Cy3通道熒光背景《1000;Cy5通道熒光背景《300為熒光背景合格基片。固定能力的檢測(cè)主要是通過(guò)固定在醛基基片表面的激發(fā)波長(zhǎng)為532nm的熒光標(biāo)記Oligo樣品和要雜交的Oligo樣品分別判斷醛基基片的表面化學(xué)特性和生物樣品固定能力等指標(biāo)；對(duì)于2.5uM激發(fā)波長(zhǎng)為532nm的熒光標(biāo)記的Oligo樣品，在固定化處理后經(jīng)晶芯CtuxSc纖TM10K微陣列芯片掃描儀在PMT/Power=90/750的掃描參數(shù)下，Cy3通道熒光背景210000，且雜交后10.0uM的PBH(—種Oligo樣品)Cy3通道信號(hào)^15000的基片，其固定能力合格。四、探針的制備1質(zhì)控探針的設(shè)計(jì)在芯片設(shè)計(jì)時(shí)采用了表l所示的質(zhì)控探針，這些探針均在NCBI中進(jìn)行了BLAST比對(duì)，和已知基因無(wú)明顯同源性。表1:質(zhì)控探針表5百標(biāo)基H探針名探針序列PC質(zhì)控陽(yáng)性《,》16SPBB"0201鵬GCTGCCKXXMTAGOAGT親交W性對(duì)麗CPC)Y5基園Y5CTC虹GCCCATGCCGATCC雜交明性對(duì)魔《NC)tetK基國(guó)reB-02M6S6GTTGCTTCTCGAATCAGTTraCT芯片固定陽(yáng)性對(duì)躐HexGTCACATGCGATGGATCGAGCTCCTTTATCATCGTTCCCACCTTAATOeA2檢測(cè)探針的設(shè)計(jì)從RDPIIfhttp:〃rdp.cme.msu.edu/)中下載所需要的細(xì)菌的核酸序列，分析流程為下載序列數(shù)據(jù)，整理后導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)，抽取所有細(xì)菌的通用引物所包括的序列，進(jìn)行全局聯(lián)配，根據(jù)聯(lián)配圖得到某指定細(xì)菌的特征區(qū)段，在特征區(qū)域設(shè)計(jì)種特異性探針，再進(jìn)行引物特異性檢驗(yàn)、性能評(píng)價(jià)和分級(jí)，調(diào)整Tm值和棄用特異性有問(wèn)題的探針，最終得到表2所示的檢測(cè)探針序列。在探針設(shè)計(jì)時(shí)考慮到以下原則特異性位點(diǎn)盡量在探針中間，或略靠近探針3'端，01igo探針的長(zhǎng)度一般在20bp左右，探針Tm值盡量在50-7(TC之間。探針設(shè)計(jì)完后，與NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行特異性的檢驗(yàn)，并使用Primerpremier5檢測(cè)是否有Hairpin或者dimer形成。表2:檢測(cè)探針表鑭菌名H標(biāo)基閃探針名探針序列黃ir鐘屬16SrRNAHa-l'ITGGTATTCCATGTAATCTC16SrRNAFla-2TTCCATGTAATCTCTAAGCA嗜冷黃桿菌mBFlapsy-lFta,-2TAGTCGTTTCGCCTATTTGCCACGTTTAOTCGTTTCGCCT,BFla卿-3mTCGCCAACCGCTTGAGAA腿趣A詞a,4TTAATAGTGTOTTCATG(X瓢菌屬應(yīng),AVib4CCACCTAGGCATATCCTGAC版/o16S細(xì)A鑒2CAAACCACCTGCATCCGCTT6臓rRNA霍亂豕菌,r麗A哈維R綴菌簿藻纖,B輪alg-1gpfigpB鰒弧菌,B,r應(yīng)A戰(zhàn)bang-3,r麗A轉(zhuǎn)纖瓢菌,BgnB鵬r麗AIII劍您lft菌gpBgpB,vol-2倫￥UM顧溶愈性a菌應(yīng)r應(yīng)A"Vibffflr-2諾卡氏菌JR廳,A脅l■rKNANa>2齒魚(yú)譜卡aa16SrRNANser-1Nser-2氣攀朧菌屬鵬趣AAeri纖趣AAer-2霧伯賴氣單鼸菌廳r觀AAersobria嗜水性氣單胞菌鏈球菌屬海驟鏈球菌變形桿菌JRGTCTCCGCmGATTCTCTOCTCCAGCOTCTCCGCmGATTCGATCOCTOACTOACACTCAGTTOTCCCTCTTTOACCX]GTAGGTATCATGGCOGTAGGTTTOCOTACCATTGCAGACTCAACAGCTGTOTOAATMiCGCCGTmCGTCCAOTGT緣TCCCATCXITCCTTjyiTCCACCACCTGCAT就TOACTTAATCCACCACOTTGAOGTOGOTCACOAATOAGTTTOTCTOCXmTOAAGGAAAGAAGTCGTTCAGTTTCTCTCGCCACOXJ膽AAACAAOTCGTAAGOGTCCCC(XGAAGTTOAAACCXXiTCGTCCGTOTCCCCOGCCCATCTCGCACOJATAACOTCCCTGTCGAAAOAGOTTTTCCAACCCGAACCATGCAOCCATOC扁TTCAGOCTCATAAAGACTCTAGCTCGACAGTCACATCTAACTmTCCAACCTOACAGATATTAGCTOCCA應(yīng)畫(huà)AAerhydropMaTTGATACGTATTAGOCATCA鵬翻AStr-1GCTAATACAACGCAOGTCC:16S趣ATCGGCTATOTATWHOKriyrBSlrta〗ae-1TCTCCmCCACACCACGTTTgyrBATACGACOAGCAACCTOAGGI6S趣AStrCAACTCTTTCOATTAGTOCStr，ni4TCACTGAAGAGTCTAnTGT，6S,ATAGCCAACCAGTTTC雄ATO16S細(xì)AProteus^AGAAGCCACGGTrcAAGACC3探針的合成探針在英俊生物技術(shù)有限公司合成。要在醛基化表面固定的DNA分子必須具有一個(gè)伯氨基-5'-氨基，又稱為連接氨基，具有通過(guò)6-12個(gè)碳原子間隔臂連接在5'核苷酸的磷酸基團(tuán)上的一個(gè)伯氨基。而為了使探針?lè)肿釉谛酒仙煺归_(kāi)來(lái)，利于靶標(biāo)探針的雜交，故合成時(shí)在每個(gè)探針的5'加上一個(gè)氨基和15個(gè)T。4點(diǎn)樣前的探針準(zhǔn)備合成好的探針先溶解在雙蒸水中，終濃度為40uM，然后加入到晶芯罾基因芯片點(diǎn)樣液(博奧生物，產(chǎn)品目錄號(hào)440010)中。配制探針?biāo)芤?30-60uM)，轉(zhuǎn)5ul上述核酸溶液到384孔板或96孔板中，加入5ul2X基因芯片點(diǎn)樣液，并用移液器充分混合后，即可用于基因芯片點(diǎn)樣。五、基因芯片制備1基因芯片的設(shè)計(jì)選定表3的檢測(cè)探針和質(zhì)控探針。表3:檢測(cè)探針和質(zhì)控探針選定表8探針名稱iHSi~i2基因芯片的制備將選定的檢測(cè)探針和質(zhì)控探針以表4所示的點(diǎn)陣形式分布在醛基基片上，每個(gè)芯片上有四個(gè)點(diǎn)陣，芯片的點(diǎn)樣是由博奧生物有限公司生產(chǎn)的晶芯l%martArrayerTM48微陣列芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)完成的;制備完成后的芯片經(jīng)晶芯⑩LuxSean，10K微陣列芯片掃描儀在PMT/Power=90/900的掃描參數(shù)下掃描，在同一張芯片內(nèi)，同一根針點(diǎn)樣，點(diǎn)直徑偏差小于20%。點(diǎn)陣整齊，無(wú)明顯連點(diǎn)現(xiàn)象，即證明芯片是合格HexBCNCrcQcVUMWb-2Vlbchol-2Vibchol-3VibharVibalg-IVibaJg-2Vibang-iMbang-2Vibang-3Vibang~4Vibpar-2Nac-lNacser-Nacser-2Aer-lAer-2AcrhydrophilaStMStr-2Siriniae-lStriniae"2芯片固定陽(yáng)性對(duì)照芯片雜交空白對(duì)照芯片雜交陰性對(duì)照芯片雜交陽(yáng)性對(duì)照PCR陽(yáng)性對(duì)照弧菌屬16SrRNA飄菌屬16SrRNA霍亂K菌16SrRNA霍亂瓤菌gyrB哈維ft瓢菌16SrRNA*藻*菌gyrB溶藻K菌gyrB駆B,B腦畫(huà)A腦rRNA副溶血性弧菌gyrB諾卡氏菌屬16SrRNA諾^氏菌屬16SrRNA錄魚(yú)諾卡氏虔i16SrRNA解龜諾卡氏菌16SrRNA氣單胞菌屬16SrRNA氣爭(zhēng)-胞菌屬16SrRNA嗜水性氣單胞菌16SrRNA鏈球菌屬16SrRNA鏈球菌厲16SrRNA海豚鏈球齒gyrB海豚鏈球幽gyrBrf^-lf一-.^y^J5JJ^nuf95s聲鑤鰻鰻綴的。表4:基因芯片點(diǎn)樣表HexHexHexPCNCQCVib-2Vibchol-2Vibchol-3VibharVibalg-1Vibang-3Vibang-4Vibpar-2Nacser-2A-1Aer-2AerhysrophiaStr-2Striniae-1Sfrini,2BCHexIfaHex六、基因芯片檢測(cè)應(yīng)用驗(yàn)證l樣品選取收集從表5中9種細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株和水產(chǎn)品致病菌樣品，從中提取基因組DNA(樣品名中-1為各細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株)。表5:標(biāo)準(zhǔn)菌株采樣菌株列表序號(hào)樣品名來(lái)源序號(hào)樣品名來(lái)源1副溶vpa-lATCC33糾715溶藻Val-2Ptl(二疣梭子蟹)2血弧vpa-2VPOl16弧菌VaI-3sbl(水產(chǎn)品)3菌vpa-3VP0217溫和Aso-1R79-"4vpa-4VP0318氣單Aso-2SXT-l(水產(chǎn)品)5vpa-5SB6(水產(chǎn)品)19胞菌Aso-3Ma(黃鱔)6嗜水a(chǎn)hy-1ATCC796620鱗魚(yú)Nsc"lJCM3360T7ahy-2h海水產(chǎn)1兮21諾卡Nse-2Pc(大黃色)8ahy-3上海水產(chǎn)2號(hào)22氏菌Nse-3Ca(烏彌)9ahy-4ayu-Ah0201(香魚(yú))23鰻弧Van-1CJX(鰻鱺)10ahy-5xs91-4-124Van-2NB]4(花鰻鱺)11海稱Sin-1Si(紅擬石首魚(yú))25Van-3XS2(鰻鱺)12鏈球Sin-2Tn(羅非魚(yú))26哈維Vha-1ATCC3386613菌Sin-3So(美國(guó)紅魚(yú))27氏弧Vha-2Lj(花鱸)14溶藻弧齒ATCC1774928齒vha-3BK-1(黑鯛)2引物的設(shè)計(jì)和合成根據(jù)細(xì)菌16SrRNA、細(xì)菌解旋酶基因gyrB設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。首先從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載基因及蛋白序列，利用序列分析軟件MUSCLE對(duì)蛋白序列進(jìn)行全局比對(duì)，尋找序列的保守區(qū)域，在保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物(表6)。上游引物5'-TAMRA標(biāo)記；探針在英俊生物技術(shù)有限公司合成。表6:PCR擴(kuò)增引物表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中N表示A/T/G/C，Y表示C/T，R表示A/G，H表示A/C/T，S表示G/C。gyrB-F/R來(lái)自于(Seoeta1.，2003)，引物設(shè)計(jì)之后，利用BLASTP，將引物設(shè)計(jì)的靶氨基酸序列與各細(xì)菌的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，以確定PCR的效果及產(chǎn)物大小。3樣品擴(kuò)增將28份樣品分別用表6所示的16S和gyrB通用引物以及表7、8所示的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到耙序列PCR產(chǎn)物。表7:PCR擴(kuò)增體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表8:PCR擴(kuò)增參數(shù)表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4用上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng)按表9所示配制雜交液，將雜交液用移液器混勻后，3000rpm離心30s，95。C熱變性3min(可在PCR儀中進(jìn)行)，驟冷冰浴lmin;用移液器將雜交液注入蓋片上的小孔，確認(rèn)雜交液覆蓋芯片上的點(diǎn)陣后，蓋緊雜交盒蓋，放入42t:恒溫水浴鍋中，雜交2h;雜交結(jié)束后，快速將芯片從雜交盒中拿出(蓋片可以重復(fù)利用)，將芯片轉(zhuǎn)移到盛放洗液I(2XSSC，0.2%SDS)的清洗盒中，雜交面朝上，放在水平搖床上清洗4min，以洗去沒(méi)有與探針特異結(jié)合的樣品。洗液I清洗結(jié)束后，迅速用鑷子將芯片轉(zhuǎn)移到盛放洗液11(0.2XSSC)的清洗盒中，雜交面朝上，放在水平搖床上清洗4min。清洗后，放在50ml錐形離心管中1500rpm離心lmin。使樣品與探針充分反應(yīng)根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下，帶有熒光素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與基因芯片上的互補(bǔ)探針雜交結(jié)合形成穩(wěn)定的雙鏈，也間接對(duì)待測(cè)序列進(jìn)行了定性分析。表9:雜交液配制表反應(yīng)液組成體積終濃度2()X'SSC2.25ul3X10%SDS0,3ul0.2%驛二=33.75ul550XDaihardt's〗.Sul5X雜交「樸性對(duì)照0.2ulPCR產(chǎn)物7ul其中7ulPCR產(chǎn)物為以16S引物的擴(kuò)增產(chǎn)物和以gyrB引物的擴(kuò)增產(chǎn)物各3.5ul。5檢測(cè)結(jié)果和分析雜交結(jié)果用博奧生物公司開(kāi)發(fā)的海水養(yǎng)殖致病微生物基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)軟件軟件或電泳進(jìn)行了判讀，判讀結(jié)果為vpa-l、vpa-2、vpa-3、vpa-4和vpa-5均雜交弧菌屬特異性探針Vib-l、Vib-2，判讀它們均屬弧菌屬細(xì)菌，其中vpa-l、vpa-2、vpa-3、vpa-4與種特異性探針Vib-par-2雜交，非特異性雜交溶藻弧菌種特異性探針Vib-alg-2，非特異性雜交諾卡氏菌屬探針Nac-l，判讀Vib-l、Vib-2，vpa-l、vpa-2、vpa-3、vpa-4為副溶血弧菌種；vpa-5非特異性雜交溶藻弧菌種特異性探針Vib-alg-l、Vib-alg-2，且信號(hào)較強(qiáng)，判讀vpa-5為溶藻弧菌種。Ahy-l、Ahy-2、Ahy-3、Ahy-4和Ahy-5均雜交氣單胞菌屬特異性探針Aer-l、Aer-2，判讀它們均屬氣單胞菌屬細(xì)菌，Ahy-l、Ahy-2、Ahy-3與嗜水氣單胞菌種特異性探針Aerhydrophila雜交，判讀Ahy-l、Ahy-2、Ahy-3為嗜水氣單胞菌種。Sin-l、Sin-2和Sin-3均雜交鏈球菌屬特異性探針Str-l、Str-2和海豚鏈球菌種特異性探針Striniae-1、Striniae-2，判讀Sin-l、Sin-2和Sin-3為鏈球菌海豚鏈球菌種細(xì)菌。Val-1、Val-2和Val-3均雜交弧菌屬特異性探針Vib-l、Vib-2及溶藻弧菌種特異性探針Vibalg-l、Vibalg-2，判讀Val-1、Val-2和Val-3弧菌屬溶藻弧菌種細(xì)菌。Aso-l、和Aso-3均雜交氣單胞菌屬特異性探針Aer-l、Aer-2，Aso-2與弧菌屬探針Vib-2、諾卡氏菌屬探針Nac-l、Nac-2、螄魚(yú)諾卡氏菌中探針Nacser-l、Nacser-2有非特異雜交，判讀Aso-l和Aso-3為氣單胞菌屬細(xì)菌，Aso-2可能有污染。Nse-1、Nse-2和Nse-3均雜交諾卡氏菌屬特異性探針Nac-l、Nac-2和螄魚(yú)諾卡氏菌種特異性探針Nacser-l、Nacser-2，判讀Nse-1、Nse-2和Nse-3為諾卡氏菌屬螄魚(yú)諾卡氏菌種細(xì)菌。Van-1、Van-2和Van-3均雜交弧菌屬特異性探針Vib-l、Vib-2和鰻弧菌種特異性探針Vibang-l、Vibang-2、Vibang-3、Vibang-4，判讀Van-l、Van-2和Van-3為弧菌屬鰻弧菌種細(xì)菌。Vha-l、Vha-2和Vha-3均雜交弧菌屬特異性探針Vib-l、Vib-2和哈維氏弧菌種特異性探針Vibhar，判讀Vha-l、Vha-2和Vha-3為弧菌屬哈維氏弧菌種細(xì)菌。上述實(shí)例的基因芯片中也可以增加檢測(cè)河流弧菌、創(chuàng)傷弧菌、蘇伯利氣單胞菌、黃桿菌屬、嗜冷黃桿菌和變形桿菌屬的檢測(cè)探針，具體設(shè)計(jì)、制備如上相同。11從以上實(shí)施例中可以看出本發(fā)明具有對(duì)水產(chǎn)品致病菌進(jìn)行高通量、微型化和自動(dòng)化檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，且檢測(cè)的特異性較好。序列表<110>寧波大學(xué)、寧波博奧生物工程有限公司、博奧生物有限公司<120>水產(chǎn)品養(yǎng)殖致病菌的基因芯片<160>7<170>PatentInversion3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1CCACCTAGGCATATCCTGAC20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>2CAAACCACCTGCATGCGCTT20<210>3<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>3CTCCAGCGTCTCCGCTAGATTC22<210>4<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>4CATCGCTGACTGACACTGAGTTGT24<210>5<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>5CCCTCTTTGACCCGTAGGTAT21<210>6<211>200106]<212>DNA0107]<213>人工合成0108]<400>60109]CATGGCGGTAGGTTTGCGTA200110]<210>70111]<211>200112]<212>DNA0113]<213>人工合成0114]<400>70115]CCATTGCAGACTCAACAGCT200116]<210>80117]<211>200118]<212>DNA0119]<213>人工合成0120]<400>8:0121]GTGTGAATAGCGCCGTTACG20:0122]<210>9:0123]<211>20:0124]<212>DNA:0125]<213>人工合成:0126]<400>9:0127]TCCACGGSTAATCCCATCGTC20:0128]<210>10:0129]<211>19:0130]<212>DNA:0131]<213>人工合成:0132]<400>10:0133]CTTAATCCACCACCTGCAT19:0134]<210>11:0135]<211>19:0136]<212>DNA<213>人工合成<400>11ATCTGACTTAATCCACCAC19<210>12<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>12CCGTCGTCCGTGTCCCC17<210>13<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>13GGCCCATCTCGCACCGATAA20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>14CGTCCCTGTCGAAAGAGGTT20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>15TTCCAACCCGAACCATGCAG20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>16CCATGCAGTTCAGGCTCATA20<210>17<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>17AAGACTCTAGCTGGACAGT19<210>18<211>19<212>DNA<213>八人工合成<400>18CACATCTAACTTATCCAAC19<210>19<211>20<210>32<211>2016<212>DNA<213>人工合成<400>32TTCCATGTAATCTCTAAGCA20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>33TAGTCGTTTCGCCTATTTGC20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>34CACGTTTAGTCGTTTCGCCT20<210>35<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>35TATCGCCAACCGCTTGAGAA20<210>36<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>36TTAATAGTGTGTTGATGCC:L9<210>37<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>37TAGCCAACCAGTTTCAGATG20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3817CN20<210>39<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>39GCTGCCTCCCGTAGGAGT18<210>40<211>50<212>DNA<213>人工合成<400>40GTCACATGCGATGGATCGAGCTCCTTTATCATCGTTCCCA40CCTTAATGCA50<210>41<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>41GTTGCTTCTGGAATGAGTTTGCT23<210>42<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>42CTCATGCCCATGCCGATGC1918權(quán)利要求水產(chǎn)品養(yǎng)殖致病菌的基因芯片，包括經(jīng)化學(xué)修飾的固相載體，在所述固相載體上點(diǎn)陣分布有檢測(cè)探針和質(zhì)控探針，其特征在于所述檢測(cè)探針包括待測(cè)弧菌屬、霍亂弧菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、副溶血性弧菌、諾卡氏菌屬、鰤?mèng)~諾卡氏菌、氣單胞菌屬、嗜水性氣單胞菌、鏈球菌屬、海豚鏈球菌的特異性16SrDNA序列和/或gyrB基因序列，所述質(zhì)控探針為PCR質(zhì)控陽(yáng)性寡聚核苷酸序列SEQIDNO39、芯片固定陽(yáng)性對(duì)照寡聚核苷酸序列SEQIDNO40、芯片雜交陰性對(duì)照寡聚核苷酸序列SEQIDNO41、芯片雜交陽(yáng)性對(duì)照寡聚核苷酸序列SEQIDNO42和芯片雜交空白對(duì)照，待測(cè)弧菌屬的為SEQIDNO1序列和SEQIDNO2序列，待測(cè)霍亂弧菌的為SEQIDNO3序列和SEQIDNO4序列，待測(cè)哈維氏弧菌的為SEQIDNO5序列，待測(cè)溶藻弧菌的為SEQIDNO6序列和SEQIDNO7序列，待測(cè)鰻弧菌的為SEQIDNO8序列、SEQIDNO9序列、SEQIDNO10序列和SEQIDNO11序列，待測(cè)副溶血性弧菌的為SEQIDNO12序列，待測(cè)諾卡氏菌屬的為SEQIDNO13序列和SEQIDNO14序列，待測(cè)鰤?mèng)~諾卡氏菌屬的為SEQIDNO15序列和SEQIDNO16序列，待測(cè)氣單胞菌屬的為SEQIDNO17序列和SEQIDNO18序列，待測(cè)嗜水性氣單胞菌屬的為SEQIDNO19序列，待測(cè)鏈球菌屬的為SEQIDNO20序列和SEQIDNO21序列，待測(cè)海豚鏈球菌的為SEQIDNO22序列和SEQIDNO23序列。2.如權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述檢測(cè)探針還包括待測(cè)河流弧菌、創(chuàng)傷弧菌、蘇伯利氣單胞菌、黃桿菌屬、嗜冷黃桿菌和變形桿菌屬的特異性16SrDNA序列和/或gyrB基因序列，待測(cè)河流弧菌的為SEQIDNO:24序列、SEQIDNO:25序列和SEQIDNO:26序列，待測(cè)創(chuàng)傷弧菌的為SEQIDNO:27序列、SEQIDNO:28序列和SEQIDNO:29序列，待測(cè)蘇伯利氣單胞菌的為SEQIDNO:30序列，待測(cè)黃桿菌屬的為SEQIDNO:31序列和SEQIDNO:32序列，待測(cè)嗜冷黃桿菌的為SEQIDNO:33序列、SEQIDNO:34序列、SEQIDNO:35序列和SEQIDNO:36序列，待測(cè)變形桿菌屬的為SEQIDNO:37序列和SEQIDNO:38序列。3.如權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述化學(xué)修飾為醛基修飾。4.權(quán)利要求1所述的基因芯片在檢測(cè)水產(chǎn)品養(yǎng)殖致病菌中的應(yīng)用。5.如權(quán)利要求4所述的基因芯片的應(yīng)用，其特征在于所述基因芯片的檢測(cè)水產(chǎn)品養(yǎng)殖致病菌過(guò)程由檢測(cè)系統(tǒng)軟件自動(dòng)檢測(cè)。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了水產(chǎn)品養(yǎng)殖致病菌的基因芯片，包括經(jīng)化學(xué)修飾的固相載體，在固相載體上點(diǎn)陣分布有檢測(cè)探針和質(zhì)控探針，檢測(cè)探針包括待測(cè)弧菌屬、霍亂弧菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、副溶血性弧菌、諾卡氏菌屬、鰤?mèng)~諾卡氏菌、氣單胞菌屬、嗜水性氣單胞菌、鏈球菌屬、海豚鏈球菌的特異性16SrDNA序列和/或gyrB基因序列，質(zhì)控探針為PCR陽(yáng)性、芯片固定陽(yáng)性對(duì)照、芯片雜交陰性對(duì)照、芯片雜交陽(yáng)性對(duì)照和芯片雜交空白對(duì)照；這樣該基因芯片具有體積少和高通量的優(yōu)點(diǎn)，能同時(shí)檢測(cè)弧菌屬、諾卡氏菌屬、氣單胞菌屬和鏈球菌屬的已知和未細(xì)菌，也能檢測(cè)具體的多個(gè)種類的細(xì)菌，并且檢測(cè)上述細(xì)菌快捷和特異，加上檢測(cè)軟件后就可以自動(dòng)化檢測(cè)。文檔編號(hào)C12R1/01GK101691608SQ20091009934公開(kāi)日2010年4月7日申請(qǐng)日期2009年6月3日優(yōu)先權(quán)日2009年6月3日發(fā)明者史雨紅,張亮,李明云,李長(zhǎng)紅,陳炯申請(qǐng)人:寧波大學(xué);寧波博奧生物工程有限公司;博奧生物有限公司