一種快速生長型轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種快速生長型轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)方法，其是將含有生長激素基因的細菌人工染色體轉(zhuǎn)入動物基因組中，并在該轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)進行表達。本發(fā)明是利用BAC自身特點，將含有豬GH基因的BAC作為載體攜帶豬自身的調(diào)控元件使GH基因以較低的拷貝數(shù)按照原組織的狀態(tài)在小鼠體內(nèi)進行表達，研究結(jié)果顯示生長激素分泌量無明顯過量超標，各項生理指標監(jiān)測表明小鼠處于正常的狀況，從而獲得了健康的，生長速度相對較快，體重增加的小鼠家系，該模型的成功建立為培育肉質(zhì)等特性明顯改善的轉(zhuǎn)基因豬新品種研究奠定了良好的基礎。
【專利說明】一種快速生長型轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種快速生長型轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬作為一種優(yōu)質(zhì)的肉用型家畜，對其瘦肉率、肉質(zhì)等主要經(jīng)濟性狀方面的育種改 良一直是研究的熱點。從傳統(tǒng)育種的角度，通常只能在飼料和生長環(huán)境上加以調(diào)節(jié)控制， 但仍受到動物自身的限制。隨著人們生活水平的提高和營養(yǎng)觀念的轉(zhuǎn)變，對豬的要求不再 僅僅是膘肥體重，而是希望對豬肉的蛋白質(zhì)、脂肪含量、風味、口感等方面進行改進。始于20 世紀80年代初的轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)，是一種通過重組DNA技術(shù)，將外源基因?qū)雱游矬w內(nèi)， 外源性基因穩(wěn)定整合在染色體基因組上并傳給下一代。轉(zhuǎn)基因技術(shù)不受有性繁殖的局限， 并且使基因能夠在種系關(guān)系相距遙遠的個體之間流動，其對特定性狀的改良、方向更明確、 更單一等這些獨特性優(yōu)勢將在育種領(lǐng)域發(fā)揮不可替代的作用。從當前的發(fā)展趨勢看，轉(zhuǎn)基 因技術(shù)對家畜品種改良的研究和應用將成為最活躍、最有實際應用價值的研究方向之一， 該技術(shù)的發(fā)展將為動物育種帶來前所未有的革命性變化。
[0003] 為了得到生長更加理想的家畜品種，可將一些和動物生長發(fā)育相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入， 將使之在肉產(chǎn)量，質(zhì)量，肥瘦組成方面更符合市場的需求。生長激素 （Growth Hormone)是 一類廣泛存在于多種動物體內(nèi)的由垂體嗜酸性細胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素，其作用是調(diào)控 新陳代謝、促進生長發(fā)育，而其宏觀表現(xiàn)為體重增加、胴體瘦肉率提高等。1982年，美國科 學家首次將大鼠生長激素基因與金屬硫蛋白基因啟動子拼接成融合基因，導入小鼠受精卵 后，獲得了轉(zhuǎn)基因"超級鼠"。這一研究的成功為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因大家畜奠定了良好的基礎。此 后，相繼出現(xiàn)轉(zhuǎn)人GH、轉(zhuǎn)豬GH、轉(zhuǎn)大鼠 GH和轉(zhuǎn)牛GH基因等外源DNA的轉(zhuǎn)基因豬，綿羊，兔， 牛，研究表明它們與非轉(zhuǎn)基因的動物相比，生長速度和飼料轉(zhuǎn)化效率有顯著提高，胴體的脂 肪率也明顯降低，但是常伴隨著健康異常的問題，例如：關(guān)節(jié)炎、應激敏感性增加、肝臟與 腎臟炎癥、胃潰瘍、生育能力降低、壽命減短等。研究這些推斷異常現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于 轉(zhuǎn)入的生長激素基因連續(xù)異位地在不同組織器官中表達，同時體內(nèi)外源生長激素遠超其自 身生理水平，自身的反饋機制也被破壞而引起。
[0004] BAC (細菌人工染色體）是一可容納約300kb的DNA片段的克隆載體，其遺傳穩(wěn)定 性好，嵌合率低，轉(zhuǎn)化率高，易操作，同時它能包括編碼區(qū)且還包含內(nèi)含子和調(diào)控區(qū)，其攜帶 的基因可以和各種酶類、轉(zhuǎn)錄因子作用，遵守基因表達和復制的機制，理論上和正常染色體 上的基因相似，因此BAC可將復雜的基因和基因家族，包括遠程的順式作用元件轉(zhuǎn)入受體 生物基因組中，使轉(zhuǎn)入的基因在一定范圍接近原有的組織狀態(tài)，減少轉(zhuǎn)基因的沉默的可能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種快速生長型轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)方法。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種快速生長型轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)方法，其是將 含有生長激素基因的細菌人工染色體轉(zhuǎn)入動物基因組中，并在該轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)進行表 達。優(yōu)選所述生長激素基因為豬生長激素基因。
[0007] 前述的方法，其中含有豬生長激素基因的細菌人工染色體的核苷酸序列在 GenBank上的國際編號為CH242-271011，或與該序列同源性在70%以上的核苷酸序列，或在 嚴格條件下，能夠與該序列雜交的核苷酸序列。
[0008] 前述的方法，其是將含有生長激素基因的細菌人工染色體通過顯微注射法、體細 胞克隆法或精子載體法等方法轉(zhuǎn)入動物基因組中。
[0009] 前述的方法，所述動物為牛、羊、豬、馬、兔、鹿、狗等。
[0010] 本發(fā)明還提供含有國際編號CH242-271011核苷酸序列的表達載體以及含有該表 達載體的轉(zhuǎn)基因動物細胞。。
[0011] 本發(fā)明還提供含有國際編號CH242-271011核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因動物細胞。
[0012] 本發(fā)明還提供一種制備克隆胚胎的方法，其以上述的轉(zhuǎn)基因細胞為核移植供體細 胞，離體的卵母細胞為核移植受體細胞，通過核移植技術(shù)獲得克隆胚胎。
[0013] 本發(fā)明進一步提供一種制備轉(zhuǎn)基因家畜的方法，其是將上述方法制備的克隆胚胎 通過非手術(shù)法移入家畜子宮內(nèi)進行妊娠，獲得轉(zhuǎn)基因家畜。
[0014] 本發(fā)明是利用BAC自身特點，將含有豬GH基因的BAC作為載體攜帶豬自身的調(diào)控 元件使GH基因以較低的拷貝數(shù)按照原組織的狀態(tài)在小鼠體內(nèi)進行表達，研究結(jié)果顯示生 長激素分泌量無明顯過量超標，各項生理指標監(jiān)測表明小鼠處于正常的狀況，從而獲得了 健康的，生長速度相對較快，體重增加的小鼠家系，該模型的成功建立為培育肉質(zhì)等特性明 顯改善的轉(zhuǎn)基因豬新品種研究奠定了良好的基礎。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是國際編號為CH242-271011的BAC結(jié)構(gòu)示意圖。
[0016] 圖2為pGH-BAC經(jīng)Notl酶切后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；其中，A是BAC (GenBank 號：⑶466386)經(jīng)Notl酶切后脈沖電泳結(jié)果，鑒定其大小約為177kb，B是大量酶切BAC通過 脈沖電泳切膠回收目的片段。Ml:X-Hind III，M2:MidRange II PFG，箭頭 lmarkerl79kb， 箭頭2:marker9416bp，箭頭3:線性化的BAC，箭頭4:BAC載體帶。
[0017] 圖3為轉(zhuǎn)基因小鼠制備流程如圖3所示。
[0018] 圖4為PCR鑒定轉(zhuǎn)pGH-BAC基因小鼠結(jié)果。
[0019] 圖5為Southern blotting鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠及其拷貝數(shù)結(jié)果；其中，A和B表示Fq 代小鼠鑒定，C和D表示Fi代小鼠，4014bp的條帶是基因組上整合的pGH-BAC被探針雜交出 來的片段，代2、15、16、31、35、37、41、44、46、49為陽性，其相應的Fi代與原代結(jié)果一致； +表示pGH BAC為陽性對照；+(3, 10, 30)表示拷貝數(shù)，WT為野生型小鼠對照。
[0020] 圖6為RT-PCR檢測mRNA水平上pGH基因在各組織器官中的表達結(jié)果；其中A為 取Fi代13個家系的陽性小鼠的各組織器官提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行RT-PCR，其中8個 完整整合BAC家系的陽性小鼠在垂體中表達了 pGH基因；B表示列舉其中一家系pGH-mRNA 水平在各器官中的表達情況，GAPDH為小鼠持家基因，+ :豬垂體cDNA :轉(zhuǎn)基因小鼠 cDNA ; 11:心；1^肝；5:脾丄11:肺；1( :腎；？：垂體，：肌肉。
[0021] 圖7為免疫組化檢測pGH在小鼠垂體中的表達結(jié)果；其中A表示未加抗體的空白 片，B表示非轉(zhuǎn)基因小鼠的垂體片，C和D表示其中兩個家系的陽性轉(zhuǎn)基因小鼠垂體片。
[0022] 圖8為匕-49家系的轉(zhuǎn)基因小鼠與非轉(zhuǎn)基因小鼠比較；其中A表示的是匕-49家 系的小鼠從斷奶后的第三周開始每七天進行一次體重的稱量直至第十周，平均體重該家系 的轉(zhuǎn)基因小鼠相比非轉(zhuǎn)基因的小鼠有明顯的增加；B為小鼠年齡在150天時進行外觀上的 比較，左側(cè)陽性小鼠體重為：55. 55g,右側(cè)為同窩陰性小鼠,體重為：42. 41g ;C為FQ-49家系 中10周小鼠斷頸屠宰后大腿肌肉上的比較，左側(cè)為陽性轉(zhuǎn)基因小鼠，右側(cè)為同窩非轉(zhuǎn)基因 小鼠。
[0023] 圖9為轉(zhuǎn)pGH-BAC基因小鼠體重情況。
[0024] 圖10A和圖10B分別為雄性、雌性轉(zhuǎn)pGH-BAC基因小鼠器官重量的比較。

【具體實施方式】
[0025] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0026] 以下實施例所使用的載體、試劑及其來源：
[0027] 含有豬生長激素的BAC(國際編號：CH242-271011)購自美國BAC/PAC Resource Center at Children' s Hospital Oakland Research Institute。引物合成及序列測定 由上海生工完成。實驗動物用昆明小白鼠，購自北京實驗動物中心。Taq酶、內(nèi)切酶均為 Takara公司產(chǎn)品；BAC純化及回收試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品；Q-PCR試劑盒購自Applied Biosystem 公司；MidRange PFG Marker 購自 NEB 公司；Trizol 為 Tiangen 公司產(chǎn)品，PCR 法DIG引物標記盒和地高辛雜交檢測試劑盒購于Roche公司；Southern雜交膜購自于美國 Amersham biosciences公司；抗豬GH -抗購自Accurate公司，IgG二抗購自中山金橋公 司。酶切、PCR擴增等常規(guī)分子生物學實驗操作步驟詳見《分子克?。ǖ谌妫?。實施例 中所使用的其它技術(shù)手段，若未特別指明，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0028] 實施例1豬生長激素 BAC (pGH-BAC)純化和鑒定
[0029] 1. lpGH-BAC 提取和鑒定
[0030] 根據(jù)GenBank上的豬生長激素基因（pGH)序列（GenBank號：M17704)和GenBank 上BAC的序列（GenBank號：CU466386)確定pGH基因的5'側(cè)翼序列約為75kb，3'側(cè)翼序列 約為100kb (圖1)。
[0031] BAC(國際編號：CH242-271011，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，圖中pTARBACl. 3為載體骨架， BAC攜帶了約177kb的豬基因片段，豬生長激素基因位于該BAC的中間，其5'和3'側(cè)翼序 列分別為75kb，100kb，保證了該基因周圍含有足夠多的調(diào)控元件。同時在BAC5、pGH基因、 BAC3分別設有引物p51和p52 ;GH1和GH2 ;p31和p32檢測BAC的完整性)提取參照Qiagen 大提質(zhì)粒試劑盒說明書進行，用T7和SP6引物進行末端測序比對，同時依據(jù)NCBI的序列設 計引物對BAC兩末端及GH基因進行PCR擴增，引物見表1。
[0032] 表1檢測轉(zhuǎn)pGH-BAC小鼠引物表
[0033]

【權(quán)利要求】
1. 一種快速生長型轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)方法，其特征在于，其是將含有生長激素基因的 細菌人工染色體轉(zhuǎn)入動物基因組中，并在該轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)進行表達。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生長激素基因為豬生長激素基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，含有豬生長激素基因的細菌人工染色體 的核苷酸序列在GenBank上的國際編號為CH242-271011，或與該序列同源性在70%以上的 核苷酸序列，或在嚴格條件下，能夠與該序列雜交的核苷酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，其是將含有生長激素基因的細 菌人工染色體通過顯微注射法、體細胞克隆法或精子載體法轉(zhuǎn)入動物基因組中。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述動物為牛、羊、豬、馬、兔、 鹿、狗。
6. 含有國際編號CH242-271011核苷酸序列的表達載體。
7. 含有國際編號CH242-271011核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因動物細胞。
8. 含有權(quán)利要求6所述表達載體的轉(zhuǎn)基因動物細胞。
9. 一種制備克隆胚胎的方法，其以權(quán)利要求7或8所述的轉(zhuǎn)基因細胞為核移植供體細 胞，離體的卵母細胞為核移植受體細胞，通過核移植技術(shù)獲得克隆胚胎。
10. -種制備轉(zhuǎn)基因家畜的方法，其是將權(quán)利要求9所述方法制備的克隆胚胎通過非 手術(shù)法移入家畜子宮內(nèi)進行妊娠，獲得轉(zhuǎn)基因家畜。
【文檔編號】C12N15/877GK104059924SQ201310092670
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月21日
【發(fā)明者】胡曉湘, 童佳, 張然, 李秋艷, 戴蘊平, 李寧 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學