專(zhuān)利名稱(chēng)：D－天冬氨酸及l(fā)－丙氨酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及D-天冬氨酸及L-丙氨酸的制備方法，屬酶工程領(lǐng)域。
在已報(bào)道的酶法生產(chǎn)D-天冬氨酸技術(shù)中，有利用假絲酵母屬等微生物消去DL-天冬氨酸中的L-天冬氨酸而獲得D-天冬氨酸(昭56-20753)；利用基因改良獲得L-天冬氨酸-α-脫羧酶的產(chǎn)生菌，從DL-天冬氨酸同時(shí)制備D-天冬氨酸和β-丙氨酸(CN1242054A)，還有利用天冬氨酸酶和富馬酸酶聯(lián)合作用從DL-天冬氨酸中同時(shí)制備D-天冬氨酸和L-蘋(píng)果酸(平1-285193)。上述方法或者酶活很低，或者工藝復(fù)雜。
L-天冬氨酸-β-脫羧酶可催化L-天冬氨酸脫羧反應(yīng)生產(chǎn)L-丙氨酸(平2-79909、平2-242690)，可產(chǎn)生該酶的菌種有假單胞菌屬、產(chǎn)氣莢膜梭菌屬、無(wú)色桿菌屬、諾卡氏菌屬等。培養(yǎng)這些微生物，利用其產(chǎn)生的L-天冬氨酸-β-脫羧酶作用DL-天冬氨酸或其鹽，可產(chǎn)生兩種有廣泛應(yīng)用的化合物——D-天冬氨酸和L-丙氨酸。
D-天冬氨酸作為一種重要的手性化合物，在藥物合成中主要用作藥物合成的前體、中間體。包括用于合成青霉素衍生物(Aspoxicillin)、治療病毒感染用藥物——D-天冬氨酸-β-羥胺(DAH)；D-天冬氨酸的其它用途還包括抑制精氨酸基琥珀酸合成酶活性，預(yù)防或治療膿毒癥或細(xì)胞因子誘導(dǎo)的系統(tǒng)性低血壓和用作免疫抑制劑。另外，L-丙氨酸作為蛋白質(zhì)氨基酸，在氨基酸輸液中廣泛應(yīng)用，L-丙氨酸還被用作維生素B6合成的主要原料以及食品添加劑。
至今只有專(zhuān)利特公昭50-100289、昭53-1831、昭57-39791、昭57-132882中提及用L-天冬氨酸-β-脫羧酶生產(chǎn)D-天冬氨酸和L-丙氨酸。這些專(zhuān)利的共同點(diǎn)都是側(cè)重研究固定化方法和L-丙氨酸的生產(chǎn)，在提及的生產(chǎn)D-天冬氨酸過(guò)程中需要添加昂貴的輔酶磷酸吡哆醛和金屬離子Co2+，造成生產(chǎn)成本很高。
本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下措施來(lái)達(dá)到本發(fā)明采用的微生物為假單胞菌屬菌株，在富馬酸及其鹽或谷氨酸及其鹽為碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生成高活力的的L-天冬氨酸-β脫羧酶，活力為每小時(shí)每克濕細(xì)胞可轉(zhuǎn)化1×104～1×105μmol的L-天冬氨酸，或每小時(shí)每mL細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化100～2000μmolL-天冬氨酸；采用游離細(xì)胞法，將含酶細(xì)胞或培養(yǎng)液和DL-天冬氨酸或DL-天冬氨酸鹽溶液混合，32℃-45℃下進(jìn)行酶反應(yīng)，分離反應(yīng)生成物，得到高化學(xué)純度和光學(xué)純度的D-天冬氨酸和L-丙氨酸。
本發(fā)明所用的培養(yǎng)基碳源限于富馬酸及其鹽，谷氨酸及其鹽，其濃度為10～50g/L，最好為10～30g/L。氮源采用有機(jī)氮源，如蛋白胨和玉米漿，濃度分別為5～20g/L和5～50g/L。
本發(fā)明采用的是游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化，將含酶細(xì)胞或培養(yǎng)液直接和DL-天冬氨酸及其鹽溶液混合。DL-天冬氨酸及其鹽濃度為100～500g/L，100ml混合溶液中細(xì)胞濃度為0.2g～2g，32～45℃反應(yīng)24～72h。
本發(fā)明采用等電點(diǎn)與離子交換樹(shù)脂結(jié)合法分離反應(yīng)體系的D-天冬氨酸和L-丙氨酸，采用的離子交換樹(shù)脂為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，包括001×7、JK004、JK006、JK008、JK010、HD-8、HZ001、HZ016及弱堿性陰離子交換樹(shù)脂。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明采用的假單細(xì)胞屬菌株，在優(yōu)選的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可以高產(chǎn)率地生成L-天冬氨酸-β脫羧酶，而不含天冬氨酸和丙氨酸消旋酶，使反應(yīng)有高的轉(zhuǎn)化率和高的反應(yīng)速率，D-天冬氨酸以及L-丙氨酸產(chǎn)物的光學(xué)純度為100％。
本發(fā)明采用游離細(xì)胞法轉(zhuǎn)化DL-天冬氨酸，同時(shí)制備得到D-天冬氨酸和L-丙氨酸，操作簡(jiǎn)便，大大提高反應(yīng)速率，簡(jiǎn)化工藝流程。由于不使用昂貴的輔酶和Co2+等金屬離子，大幅度降低生產(chǎn)成本。
實(shí)施例1將假單細(xì)胞菌株NX-1培養(yǎng)在如下200ml培養(yǎng)基中富馬酸鈉0.5％，富馬酸銨1.0％，玉米漿2.0％，蛋白胨0.8％，K2HPO40.05％，MgSO4.7H2O0.01％，pH7.0，30±1℃搖瓶振蕩培養(yǎng)24h，離心得濕細(xì)胞，每克細(xì)胞L-天冬氨酸-β脫羧酶活力為1.42×104U。將細(xì)胞加入到200mL10％DL-天冬氨酸銨溶液，37℃反應(yīng)10h。反應(yīng)液中D-天冬氨酸濃度為5％，L-丙氨酸濃度為3.345％，對(duì)L-天冬氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率100％。
將反應(yīng)液用0.5％活性炭脫色，濾液調(diào)pH3.0，冷卻到5℃，析出的結(jié)晶冷水洗凈，得7.2gD-天冬氨酸。余下的母液流過(guò)001×7型樹(shù)脂(H+型)，水洗后用1％氨水溶液洗脫，分別收集D-天冬氨酸和L-丙氨酸濾液，濃縮，得2.3gD-天冬氨酸，6.0gL-丙氨酸。
D-天冬氨酸[α]D25＝-25.5°(C＝1，5NHCL)L-丙氨酸 [α]D25＝+14.4°(C＝6.46，1N HCL)Mp＝270℃(分解)實(shí)施例2將假單細(xì)胞菌株NX-1培養(yǎng)在如下200ml培養(yǎng)基中谷氨酸鈉2％，玉米漿2.0％，蛋白胨0.8％，K2HPO40.05％，MgSO4.7H2O0.01％，pH7.0，30℃±1℃搖瓶振蕩培養(yǎng)24h。測(cè)得每mL發(fā)酵液的L-天冬氨酸-β-脫羧酶活力為每小時(shí)可轉(zhuǎn)化1000μmolL-天冬氨酸。離心得細(xì)胞，和200mL20％DL-天冬氨酸銨溶液混合，32℃反應(yīng)20h。反應(yīng)液中D-天冬氨酸濃度為10％，L-丙氨酸濃度為6.69％，對(duì)L-天冬氨酸摩爾轉(zhuǎn)化率為100％。
將反應(yīng)液用活性炭脫色，濾液調(diào)pH3.0，真空濃縮到100mL，冷卻到5℃放置過(guò)夜。析出結(jié)晶，冷水洗滌，得18.6gD-天冬氨酸，[α]D25＝-25.5°(C＝1，5NHCL)。母液流過(guò)001×7型樹(shù)脂(H+)型，用1％氨水溶液洗脫，收集L-丙氨酸濾液，濃縮，得11.6gL-丙氨酸，[α]D25＝+14.4°(C＝6.46，1NHCL)Mp＝270℃(分解)。
實(shí)施例3同實(shí)施例2培養(yǎng)基配方，在1.5L發(fā)酵罐中裝入1L培養(yǎng)基，按0.5％接種量接入假單細(xì)胞菌株NX-1，攪拌轉(zhuǎn)速500r/min，通風(fēng)比1∶0.3，30+1℃培養(yǎng)18h，每mL培養(yǎng)液的L-天冬氨酸-β脫羧酶活力為每小時(shí)可轉(zhuǎn)化1500μmolL-天冬氨酸。離心得細(xì)胞，和1000mL10％DL-天冬氨酸銨溶液混合，40℃反應(yīng)8h。反應(yīng)液中D-天冬氨酸濃度為5％。L-丙氨酸濃度為3.345％，對(duì)L-天冬氨酸的摩爾轉(zhuǎn)化率為100％。
將反應(yīng)完后的反應(yīng)液離心，取出細(xì)胞，同上加入底物溶液中反應(yīng)，重復(fù)5次，結(jié)果如表1表1 細(xì)胞重復(fù)利用生產(chǎn)D-天冬氨酸的結(jié)果反應(yīng)時(shí)間生成產(chǎn)物濃度(w/v)細(xì)胞使用次數(shù) L-Asp轉(zhuǎn)化率(h)D-天冬氨酸L-丙氨酸第1次 8h 100％ 5％ 3.345％第2次 8h 100％ 5％ 3.345％第3次 8h 100％ 5％ 3.345％第4次 8h 100％ 5％ 3.345％第5次 8h 99.5％ 4.97％ 3.33％合并5次反應(yīng)液，用0.5％活性炭脫色，濾液調(diào)pH3.0，真空濃縮到2000mL，冷卻到5℃放置過(guò)夜，析出的結(jié)晶冷水洗凈，得233gD-天冬氨酸，[α]D25＝-25.5°(C＝1，5NHCL)。余下的母液流過(guò)001×7型樹(shù)脂(H+型)，水洗后用1％氨水溶液洗脫，收集L-丙氨酸濾液，濃縮，得145gL-丙氨酸。
L-丙氨酸[α]D25＝+14.4°(C＝6.46，1NHCL)Mp＝270℃(分解)。
采用本法和固定化方法生產(chǎn)D-天冬氨酸主要指標(biāo)比較如表2表2游離細(xì)胞法和固定化方法生產(chǎn)D-天冬氨酸主要指標(biāo)比較獲取細(xì)胞的培 反應(yīng)時(shí)間 生成D-天冬 其他養(yǎng)液體積(mL) (h) 氨酸量(g)本法 1000 40 145.0需要固定化法(昭50-200 83.3 30.50.1mMPLP，1mM100289)Co2+固定化法(昭53-200 83.3 31.0 需要0.1mMPLP1831)固定化法(昭57-1200 25 30.4 需要0.1mMPLP39791)固定化法(昭57-1200 33 30.4 需要0.1mMPLP132882)
權(quán)利要求
1.一種D-天冬氨酸及L-丙氨酸的制備方法，其特征在于本發(fā)明采用的微生物為假單胞菌屬菌株，在富馬酸及其鹽或谷氨酸及其鹽為碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生成高活力的的L-天冬氨酸-β脫羧酶；采用游離細(xì)胞法，將含酶細(xì)胞或培養(yǎng)液和DL-天冬氨酸或DL-天冬氨酸鹽溶液混合，32℃-45℃下進(jìn)行酶反應(yīng)，分離反應(yīng)生成物，得到高化學(xué)純度和光學(xué)純度的D-天冬氨酸和L-丙氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-天冬氨酸及L-丙氨酸的制備方法，其特征在于采用富馬酸及其鹽或谷氨酸及其鹽作碳源，其濃度為10-50g/L，最好為10-30g/L；蛋白胨和玉米漿作氮源，濃度分別為5～20g/L和5～50g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-天冬氨酸及L-丙氨酸的制備方法，其特征在于培養(yǎng)液的L-天冬氨酸-β-脫羧酶活性大約為每小時(shí)每mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化100-2000μmolL-天冬氨酸，或每小時(shí)每克濕細(xì)胞轉(zhuǎn)化1×104～1×105μmolL-天冬氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-天冬氨酸及L-丙氨酸的制備方法，其特征在于分離D-天冬氨酸和L-丙氨酸的方法為等電點(diǎn)法結(jié)合離子樹(shù)脂交換法，采用的離子交換樹(shù)脂為陽(yáng)離子樹(shù)交換脂，包括001×7、JK004、JK006、JK008、JK010、HD-8、HZ001、HZ016及弱堿性陰離子交換樹(shù)脂。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種D－天冬氨酸及L－丙氨酸的制備方法，屬酶工程領(lǐng)域。該制備方法是培養(yǎng)假單胞菌屬微生物，產(chǎn)生高活力的L－天冬氨酸－β脫羧酶，采用游離細(xì)胞法，將含酶細(xì)胞或培養(yǎng)液和DL－天冬氨酸或DL－天冬氨酸鹽的溶液混合，32℃－45℃下進(jìn)行酶反應(yīng)，然后用等電點(diǎn)結(jié)晶結(jié)合離子交換樹(shù)脂法分離反應(yīng)生成物，得到高化學(xué)純度和光學(xué)純度的D－天冬氨酸和L－丙氨酸。該方法實(shí)現(xiàn)了D－天冬氨酸以及L－丙氨酸同時(shí)生產(chǎn)，操作簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化時(shí)間短，生產(chǎn)成本低。
文檔編號(hào)C12P13/00GK1405317SQ0213855
公開(kāi)日2003年3月26日 申請(qǐng)日期2002年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月7日
發(fā)明者歐陽(yáng)平凱, 徐虹, 代書(shū)玲, 韋萍 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)