專利名稱：抗醛糖還原酶相似蛋白多克隆抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種多克隆抗體的制備方法，屬于生物工程開發(fā)新型肝癌診斷、治療試劑的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤，死亡率高，僅次于胃癌、食管癌而居第三位，五年生存率為36.6％。
肝癌有一相對長的自然發(fā)展過程，其自然病程至少為24個月出現(xiàn)低濃度AFP到亞臨床肝癌診斷確立為早期階段，一般為10個月；從亞臨床期到出現(xiàn)臨床癥狀為中期階段，一般為8個月時間；自有臨床癥狀到出現(xiàn)黃疸、腹水、遠處轉(zhuǎn)移或惡液質(zhì)稱作晚期階段，時間大約4個月；自晚期到死亡，一般為個2月時間。
要想提高肝癌的五年生存率早期診斷非常重要，其中肝癌的血清標(biāo)志物是非常有用的。近幾年出現(xiàn)的一些肝癌標(biāo)志物包括AFP、γ-GT同工酶、甲胎蛋白異質(zhì)體、異常凝血酶原、血清巖藻糖苷酶、同工鐵蛋白、醛縮酶同工酶、α1-抗胰蛋白酶分子異質(zhì)體、丙酮酸激酶同工酶。這些肝癌標(biāo)志物對肝癌的早期診斷有重要意義，但其中最有價值的是AFP。AFP是當(dāng)前診斷HCC最特異的標(biāo)志物，其陽性率僅70-80％。它是胎兒時期肝臟合成的一種胚胎蛋白，當(dāng)成人肝細(xì)胞惡變后又可重新獲得這一功能。但是，在孕婦、新生兒及生殖腺(睪丸、卵巢)胚胎瘤AFP也可出現(xiàn)，這說明AFP對HCC只有相對的特異性；采用高靈敏度的檢測方法在部分肝炎、肝硬化及少數(shù)消化道腫瘤(胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌)可測得低濃度的AFP，因此對AFP的檢測結(jié)果必須聯(lián)系臨床才有診斷意義；近年來發(fā)現(xiàn)AFP陰性的HCC有上升趨勢，所以開發(fā)更新、更特異、更敏感的肝癌標(biāo)志物成為當(dāng)前緊迫的課題。
醛糖還原酶相似蛋白ARL-1(Aldose Reductase-like-1)cDNA序列，全長1.35kb，編碼316個氨基酸，分子量為34.8KD。
ARL-1為醛酮還原酶大家族的成員，該家族還包括醛糖還原酶(AldoseReductase，AR)、醛還原酶(Aldehyde Reductase，ADR)、碳酰還原酶(CarbonylReductase)、成纖維生長因子調(diào)節(jié)蛋白(FR-1)、小鼠輸精管蛋白(MVDP)、變易蛋白(斑塊17，spot17)。就氨基酸序列而言，ARL-1分別與AR、MVDP、FR-1、中國倉鼠卵巢還原酶、spot17有70.6％、81％、82％、83％、94％的同源性。ARL-1以NADPH為輔酶，能還原各種醛類和糖類化合物。
Northern blotting顯示，生理情況下ARL-1主要分布在小腸、結(jié)腸，可能與食物中醛類物質(zhì)的解毒有關(guān)。ARL-1在62.5％的原發(fā)性肝癌組織中呈高水平表達，而在肝癌旁的正常組織中則檢測不到該基因的表達，據(jù)推測ARL-1可能使無毒的醛類物質(zhì)變?yōu)橛卸局掳┑奈镔|(zhì)從而有利于肝癌的發(fā)生；使含醛基的抗癌藥還原為無毒性物質(zhì)從而失去抗癌作用，導(dǎo)致肝癌產(chǎn)生耐藥性、治療效果不好。ARL-1在62.5％的原發(fā)性肝癌組織中呈高水平表達而在肝癌旁的正常組織中則檢測不到該基因的表達，因此ARL-1有可能成為一個新的肝癌標(biāo)志物。在我們的研究中，應(yīng)用抗ARL-1多克隆抗體，采用ELISA方法檢測外周血中ARL-1抗原(1)在80％肝癌患者檢測到ARL-1抗原，在健康成人卻檢測不到；(2)在AFP陰性的肝癌患者能檢測到ARL-1抗原；(3)在AFP陽性的非肝癌患者，如懷孕早期、生殖腺胚胎瘤等，ARL-1陰性；(4)在20％的肝癌患者，ARL-1檢測不到。因此，以該多克隆抗體，檢測患者外周血中ARL-1抗原，有助于肝癌的早期診斷。
早期肝癌可以采取手術(shù)根治，中、晚期肝癌采取聯(lián)合治療方案，其中導(dǎo)向治療是一個非常有前景的研究方向。彈頭包括化療藥物、核素、免疫毒素，但是它們對腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞都有殺傷作用。因此要解決特異性殺傷問題，ARL-1作為肝癌的特異性靶分子，抗ARL-1抗體可能成為一有用的載體。本研究中采用該抗體，應(yīng)用免疫印跡方法(1)能在75％的肝癌組織中檢測到ARL-1蛋白，僅在25％的癌旁組織檢測到該蛋白的微量表達；從表達水平來看，在62.5％的肝癌組織上調(diào)。(2)在小腸(如十二指腸)、結(jié)腸(如升結(jié)腸)、膽囊有微量ARL-1蛋白的表達；而在正常肝臟、食道、胃、直腸、腹膜、卵巢、子宮、腎、扁桃體、睪丸鞘膜、睪丸卻沒有ARL-1蛋白的表達。(3)在兩種肝癌細(xì)胞株HEPG-2、7402和人胚肝細(xì)胞株L-02檢測到ARL-1蛋白，在永生化的鱗狀上皮細(xì)胞株Hacat沒有檢測到該蛋白。(4)在小鼠輸精管、睪丸檢測到ARL-1同源蛋白，在其它各種小鼠組織(包括腦、心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、大腸、胰、輸尿管、膀胱、卵巢、子宮、脊髓、甲狀腺、皮膚、肌肉、胎盤、胚胎)沒有檢測到ARL-1同源蛋白。(5)在大鼠各種組織、成年酵母、果蠅沒有檢測到ARL-1的同源蛋白。因此，ARL-1作為肝癌的特異性靶分子，ARL-1抗體可能成為一有用的載體。

發(fā)明內(nèi)容
1、技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種抗醛糖還原酶相似蛋白多克隆抗體的制備方法，其多克隆抗體為一種新的肝癌早期診斷試劑，從而提高肝癌的早期診斷水平，為肝癌的早期治療創(chuàng)造條件；同時還作為一種新型、高特異性的載體，為肝癌的導(dǎo)向治療提供工具。
2、技術(shù)方案本發(fā)明的技術(shù)方案為醛糖還原酶相似基因(ARL-1)是一種肝癌相關(guān)基因，采用基因重組的方法表達、純化兩種ARL-1的重組蛋白ARL-(His)6、ARL-GST。將ARL-(His)6免疫家兔制備抗血清，采用親和層析的方法，以ARL-GST為配基，從血清中純化出抗ARL-1的多克隆抗體。
制備的工藝為a)ARL-1重組質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)GenBankTMHARLU37100已知序列，設(shè)計引物，擴增ARL-1基因，以合適的酶切位點將ARL-1 PCR(多聚酶鏈反應(yīng))產(chǎn)物插入質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測序等手段證明插入子正確；b)兩種ARL-1重組蛋白[ARL-(His)6、ARL-GST]的表達、純化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，當(dāng)細(xì)菌長到對數(shù)生長期時，isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(IPTG)誘導(dǎo)表達ARL-1重組蛋白，收集細(xì)菌，采用超聲波破碎，經(jīng)離心收集上清，此為粗蛋白，粗蛋白采用親和層析純化，純化產(chǎn)物采用SDS PAGE鑒定；c)抗ARL-1血清的制備選擇健康、成年、雄性家兔進行免疫。首次免疫用純化的重組蛋白ARL-(His)6加入等體積弗氏完全佐劑進行多點皮下注射；三周后加強免疫，共加強4-6次(每次間隔兩周)，從耳緣靜脈采取少量血液，經(jīng)瓊脂糖雙向擴散試驗證明陽性后，頸動脈插管收集血清，加0.1％疊氮鈉-20℃保存。
d)抗ARL-1多克隆抗體的純化以純化的ARL-GST為配基，親和層析純化抗ARL-1多克隆抗體。純化后的抗ARL-1多克隆抗體應(yīng)用免疫印跡方法鑒定其純度及效價。
3、技術(shù)效果本發(fā)明的優(yōu)點是制造了一種肝癌特異性的多克隆抗體，可用作肝癌的早期診斷。應(yīng)用該抗體，采用ELISA方法檢測外周血中ARL-1抗原(1)在80％肝癌患者檢測到ARL-1抗原，在健康成人卻檢測不到；(2)在AFP陰性的肝癌患者能檢測到ARL-1抗原；(3)在AFP陽性的非肝癌患者，如懷孕早期、生殖腺胚胎瘤等，ARL-1陰性；(4)在20％的肝癌患者，ARL-1檢測不到。
這種肝癌特異性的多克隆抗體，以ARL-1蛋白為靶分子，可用作肝癌導(dǎo)向治療的載體。應(yīng)用該抗體，應(yīng)用免疫印跡方法(1)能在75％的肝癌組織中檢測到ARL-1蛋白，僅在25％的癌旁組織檢測到該蛋白的微量表達；從表達水平來看，在62.5％的肝癌組織上調(diào)。(2)在小腸(如十二指腸)、結(jié)腸(如升結(jié)腸)、膽囊有微量ARL-1蛋白的表達；而在正常肝臟、食道、胃、直腸、腹膜、卵巢、子宮、腎、扁桃體、睪丸鞘膜、睪丸卻沒有ARL-1蛋白的表達。(3)在兩種肝癌細(xì)胞株HEPG-2、7402和人胚肝細(xì)胞株L-02檢測到ARL-1蛋白，在永生化的鱗狀上皮細(xì)胞株Hacat沒有檢測到該蛋白。(4)在小鼠輸精管、睪丸檢測到ARL-1同源蛋白，在其它各種小鼠組織(包括腦、心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、大腸、胰、輸尿管、膀胱、卵巢、子宮、脊髓、甲狀腺、皮膚、肌肉、胎盤、胚胎)沒有檢測到ARL-1同源蛋白。(5)在大鼠各種組織、成年酵母、果蠅沒有檢測到ARL-1的同源蛋白。
本發(fā)明所述抗ARL-1多克隆抗體，可用作肝癌的早期診斷及用作肝癌導(dǎo)向治療的載體。
具體實施例方式
下面是
具體實施例方式醛糖還原酶相似基因(ARL-1)是一種肝癌相關(guān)基因，采用基因重組的方法表達、純化兩種ARL-1的重組蛋白ARL-(His)6、ARL-GST。將ARL-(His)6免疫家兔制備抗血清，采用親和層析的方法，以ARL-GST為配基，從血清中純化出抗ARL-1的多克隆抗體。
抗ARL-1多克隆抗體制備，具體如下a)ARL-1重組質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)GenBankTMHARLU37100已知序列，設(shè)計引物。5′引物cg gaa ttc atg gccacg ttt gtg gag c(含有EcoRI酶切位點)。3′引物cg ctc gag tca ata ttctgc atc gaa ggg(含有XhoI酶切位點)。擴增ARL-1基因，以EcoRI、XhoI酶切位點將PCR產(chǎn)物插入pGEX-4T-1(His)6C，經(jīng)酶切、測序等手段證明插入子正確。經(jīng)同樣的方法將ARL-1基因插入pQE-30。
b)兩種ARL-1重組蛋白[ARL-(His)6、ARL-GST]的表達純化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(IPTG)誘導(dǎo)表達ARL-1重組蛋白。具體說來，當(dāng)細(xì)菌長到A600＝0.4時，加入終濃度為0.05mM的IPTG在30℃過夜，收集細(xì)菌，采用超聲波破碎，經(jīng)離心(12,000×g，4℃)收集上清，此為粗蛋白。粗蛋白分別采用Pharmacia Biotech公司的Glutathione sepharose 4B純化ARL-GST、Clontech公司的TALONRmetal affinity resin純化ARL-(His)6(參照說明)，15％SDS PAGE顯示純化后的產(chǎn)物只有一條帶[ARL-(His)6為60.8KD、ARL-GST為35.7KD]。
c)抗ARL-1血清的制備選擇健康、成年、雄性家兔進行免疫。首次免疫采用0.4mg純化后的重組蛋白ARL-(His)6加入等體積弗氏完全佐劑進行多點皮下注射；三周后用0.16mg的ARL-(His)6加等體積的弗氏不完全佐劑加強免疫，共加強4次(每次間隔兩周)，從耳緣靜脈采取少量血液，經(jīng)瓊脂糖雙向擴散試驗證明陽性后，頸動脈插管收集血清，加0.1％疊氮鈉-20℃保存。
d)抗ARL-1多克隆抗體的純化以純化的ARL-GST為配基，Pharmacia Biotech公司的CNBr-activatedsepharose 4B純化抗ARL-1多克隆抗體(參照說明)。純化后的抗ARL-1多克隆抗體只與ARL-1重組蛋白以及轉(zhuǎn)有ARL-1基因的細(xì)菌產(chǎn)物顯示特異性條帶(34.8KD)，而分別轉(zhuǎn)有上述兩種空栽質(zhì)粒pGEX-4T-1(His)6C、pQE-30的大腸桿菌BL21都是陰性的。
權(quán)利要求
1.一種抗醛糖還原酶相似蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于醛糖還原酶相似基因(ARL-1)是一種肝癌相關(guān)基因，采用基因重組的方法表達、純化兩種ARL-1的重組蛋白ARL-(His)6、ARL-GST，將ARL-(His)6免疫家兔制備抗血清，采用親和層析的方法，以ARL-GST為配基，從血清中純化出抗ARL-1的多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗醛糖還原酶相似蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于制備的工藝為a)ARL-1重組質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)GenBankTMHARLU37100已知序列，設(shè)計引物，擴增ARL-1基因，以合適的酶切位點將ARL-1 PCR產(chǎn)物插入質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測序等手段證明插入子正確；b)兩種ARL-1重組蛋白[ARL-(His)6、ARL-GST]的表達、純化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，當(dāng)細(xì)菌長到對數(shù)生長期時，isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(IPTG)誘導(dǎo)表達ARL-1重組蛋白，收集細(xì)菌，采用超聲波破碎，經(jīng)離心收集上清，此為粗蛋白，粗蛋白采用親和層析純化，純化產(chǎn)物采用SDS PAGE鑒定；c)抗ARL-1血清的制備選擇健康、成年、雄性家兔進行免疫。首次免疫用純化的重組蛋白ARL-(His)6加入等體積弗氏完全佐劑進行多點皮下注射；三周后加強免疫，共加強4-6次(每次間隔兩周)，從耳緣靜脈采取少量血液，經(jīng)瓊脂糖雙向擴散試驗證明陽性后，頸動脈插管收集血清，加0.1％疊氮鈉-20℃保存；d)抗ARL-1多克隆抗體的純化以純化的ARL-GST為配基，親和層析純化抗ARL-1多克隆抗體。純化后的抗ARL-1多克隆抗體應(yīng)用免疫印跡方法鑒定其純度及效價。
全文摘要
抗醛糖述原酶相似蛋白多克隆抗體的制備方法，是一種多克隆抗體的制備方法，屬于生物工程開發(fā)新型肝癌診斷、治療試劑的技術(shù)領(lǐng)域。采用基因重組的方法表達、純化兩種ARL－1的重組蛋白ARL－(His)
文檔編號C12N15/70GK1403482SQ0213841
公開日2003年3月19日 申請日期2002年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月11日
發(fā)明者金俊飛, 謝維 申請人:東南大學(xué)