一種衍生化測定酚類雌激素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種衍生化測定酚類雌激素的方法。該方法包括同時衍生化6種酚類雌激素，并利用超高效液相色譜?質(zhì)譜檢測器快速測定。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提高6種雌激素的靈敏度，重現(xiàn)性好，回收率符合測定要求，變異系數(shù)小、檢測成本低。
【專利說明】
一種衍生化測定酚類雌激素的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于獸藥殘留分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，通過柱前衍生化反應(yīng)，超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器同時測定雌醇和雌酚。本發(fā)明可以同時對動物組織中雌醇和雌酚類雌激素的多 殘留分析測定，也可對其他多酚類有機物進行分析測定。
【背景技術(shù)】
[0002] 雌激素是一類具有廣泛生物活性的類固醇化合物，能夠促進和維持女性相關(guān)的生 理作用，也會對內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、肌體新陳代謝、骨骼發(fā)育和皮膚等各方面發(fā)揮特 殊的作用。天然類固醇激素主要由動物的雌性或雄性性器官，腎上腺素等器官產(chǎn)生，是動物 生長發(fā)育的重要物質(zhì)之一，如雌二醇、雌三醇、雌酮等。人工合成很多類似結(jié)構(gòu)的類固醇激 素，如己烯雌酚、己烷雌酚和雙烯雌酚等，這些激素在動物體內(nèi)很難分解，通過食物鏈進入 人體后，可擾亂人體內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致男性女性化、男性生育能力下降、女性乳腺癌和卵巢 癌、女性性早熟等。歐盟已經(jīng)禁止其在動物飼養(yǎng)中的使用，我國農(nóng)業(yè)部235號公告中也規(guī)定， 己烯雌酚等雌激素在動物源性食品中不得檢出。因此快速準(zhǔn)確檢測動物組織中這些雌激素 殘留對于保障食品安全是很重要的。
[0003] 衍生化是為了彌補直接測定存在的目標(biāo)化合物不穩(wěn)定、離子化效率低等缺點，如 硅烷甲基化或者乙?；磻?yīng)把雌激素轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性成分才能進行GC-MS測定。LC-MS/MS是 雌激素藥物殘留檢測的常用技術(shù)之一，其檢測成本高，對部分難電離化合物如雌二醇、雌三 醇，需要衍生化反應(yīng)提高離子化效率，國內(nèi)外文獻均有報道（I、M . Reza Anari，Ray Bakhtiar，Bing Zhu et al，Anal·Chem·2002，74，4136-4144，2、Hiroyuki Yamada， Yasuhiro Kuwahara,2 Yasuo Takamatsu et al?Biomed.Chromatogr.2000 ?14:333-337 ? 3、Robert E-NelsonjStefan K-GrebejDennis J.O'Kane et al.,Clinical Chemistry 2004,50(2)，373-384,4、趙懷鑫，孫學(xué)軍，孫志偉等，分析化學(xué)，2009,37(2) ,187-193)。這些 方法均針對雌二醇、雌三醇目標(biāo)化合物，未見關(guān)于雌酚類雌激素衍生化反應(yīng)的報道，而且國 家沒有同時測定雌醇和雌酚的標(biāo)準(zhǔn)。
[0004] 超高效液相色譜(UPLC)作為一種新的色譜儀，涵蓋了小顆粒填料、低系統(tǒng)體積及 快速數(shù)據(jù)收集等全新技術(shù)，具有柱效高、分離時間短、溶劑消耗少等優(yōu)點。目前UPLC系統(tǒng)帶 有一款便攜式質(zhì)譜檢測器(QDa)，靈敏度和準(zhǔn)確度優(yōu)于紫外檢測器(PDA)，擺脫了常規(guī)質(zhì)譜 儀的條件優(yōu)化，操作簡便，開機抽真空時間短（只要5min)，即開即用，適合日常大批量樣品 的檢測，但對于雌醇、雌酚類化合物也存在離子化效率低、靈敏度低等缺點，直接測定只能 達到mg/kg殘留水平，不能滿足痕量檢測分析要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種通過柱前衍生化后用超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器，能 快速、低成本、靈敏度高地同時測定雌醇和雌酚類雌激素多殘留的一種衍生化測定酚類雌 激素的方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] 1. 一種衍生化測定酚類雌激素的方法，其特征在于包括以下步驟：
[0008] (1)雌激素標(biāo)準(zhǔn)品的制備和測定
[0009] ①標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備:將17β-雌二醇，雌三醇，雌酮，己烯雌酚，己烷雌酚，雙烯雌 酚6種雌激素固體標(biāo)準(zhǔn)品分別用甲醇溶解后，分別用甲醇配成濃度為lmg/mL的6種標(biāo)準(zhǔn)儲備 液，置于_20°C冰箱儲存；
[0010] ②五個系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)液的制備:量取步驟（1)①制備的濃度為lmg/mL的17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液、濃度為lmg/mL的雌三醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液、濃度為lmg/mL的雌酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液、 濃度為lmg/mL的己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液、濃度為lmg/mL的己烷雌酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液、濃度為Img/ mL的雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液各取0.5mL混合到50mL容量瓶，用甲醇定容至50mL得混合工作液， 然后分取混合工作液用甲醇分別稀釋為混合標(biāo)準(zhǔn)液A、混合標(biāo)準(zhǔn)液B、混合標(biāo)準(zhǔn)液C、混合標(biāo) 準(zhǔn)液D、混合標(biāo)準(zhǔn)液E五個系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)液，其中：
[0011] 混合標(biāo)準(zhǔn)液A中含有的17β-雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚6 個組分的濃度均為5ng/mL;
[0012] 混合標(biāo)準(zhǔn)液B中含有的17β-雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚6 個組分的濃度均為50ng/mL;
[0013] 混合標(biāo)準(zhǔn)液C中含有的17β_雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚6 個組分的濃度均為100ng/mL;
[0014] 混合標(biāo)準(zhǔn)液D中含有的17β-雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚6 個組分的濃度均為500ng/mL;
[0015] 混合標(biāo)準(zhǔn)液E中含有的17β-雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚6 個組分的濃度均為I 〇〇〇ng/mL;
[0016] ③內(nèi)標(biāo)的制備:將氘代17β-雌二醇(d3)用甲醇溶解后，用甲醇配成濃度為lmg/mL 的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，量取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加入甲醇配制成濃度為500ng/mL的內(nèi)標(biāo)；
[0017] ④丹磺酰氯衍生試劑的制備:將固體丹磺酰氯溶解于有機溶劑，用該有機溶劑配 制成濃度為lmg/mL丹磺酰氯衍生試劑，裝入棕色瓶，置于-20°C冰箱儲存；
[0018] ⑤分別取ImL步驟(1)②配制的五個系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，在每一個混合標(biāo)準(zhǔn)液 中加入步驟（1)③所制備的濃度為500ng/mL的內(nèi)標(biāo)I OOyL，每一個混合標(biāo)準(zhǔn)液加入內(nèi)標(biāo)混合 均勻后用氮氣吹干，分別得到對應(yīng)的五個混合標(biāo)樣;混合標(biāo)準(zhǔn)液A對應(yīng)的混合標(biāo)樣記為混合 標(biāo)樣A S混合標(biāo)準(zhǔn)液B對應(yīng)的混合標(biāo)樣記為混合標(biāo)樣B \混合標(biāo)準(zhǔn)液C對應(yīng)的混合標(biāo)樣記為 混合標(biāo)樣C \混合標(biāo)準(zhǔn)液D對應(yīng)的混合標(biāo)樣記為混合標(biāo)樣D \混合標(biāo)準(zhǔn)液E對應(yīng)的混合標(biāo)樣 記為混合標(biāo)樣E ' ；
[0019] ⑥衍生化反應(yīng)和超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定
[0020] 步驟（1)⑤所述的五個混合標(biāo)樣均按如下方法進行衍生化反應(yīng):每個混合標(biāo)樣中 加入步驟（1)④制備的lmg/mL丹磺酰氯衍生試劑10~1000 yU用碳酸氫鈉或氫氧化鈉調(diào)pH 為8.0~11.0，旋渦混合30s，在溫度45°C~70°C，衍生化反應(yīng)10~30min;
[0021 ] 每個衍生化反應(yīng)后的溶液自然冷至室溫后，氮氣吹干，再加入混合液溶解，所述混 合液由0.65mL甲醇溶液和lmmol/L乙酸銨溶液0.35mL混合而成；溶解后的溶液中有機相用 濾膜過濾得濾液，所得濾液進超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定，超高效液相色譜-質(zhì)譜檢 測器測定條件如下：
[0022] 色譜柱:waters BEH C18 2.1\50臟。色譜柱溫度：35°(：。進樣體積：1(^^
[0023]流動相為甲醇：lmmol/L乙酸銨，設(shè)置梯度洗脫，梯度洗脫條件按表1:
[0024] 表1梯度洗脫備件
[0026] 設(shè)置質(zhì)譜檢測器掃描方式:選擇離子模式，按表2所示質(zhì)譜檢測器測定衍生產(chǎn)物的 條件，正負(fù)離子同時掃描，掃描質(zhì)量數(shù)范圍為m/z = 40~600,錐孔電壓15V，采樣速率8點/ 秒，毛細(xì)管電壓〇. 8kv;
[0027] 表2質(zhì)譜檢測器測定衍生產(chǎn)物的條件
[0029]⑦經(jīng)超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定得到17β_雌二醇，雌三醇，雌酮，己烯雌酚， 己烷雌酚，雙烯雌酚6種雌激素的峰面積和內(nèi)標(biāo)的峰面積，分別以6種雌激素的峰面積與內(nèi) 標(biāo)峰面積之比值為縱坐標(biāo)，步驟(1)②中的五個混合標(biāo)準(zhǔn)液的濃度值為橫坐標(biāo)，繪制對應(yīng)的 六個標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；
[0030] (2)待檢樣品檢測
[0031] ①準(zhǔn)確稱取5g動物組織待檢樣品，加入IOOyL步驟（1)③所制備的濃度為500ng/mL 的內(nèi)標(biāo)，用25mL乙腈提取，5000rpm，離心5min，收集上清液，氮氣吹干；
[0032]②加入步驟（1)④所述的lmg/mL丹磺酰氯衍生試劑IO-1000 yL后，用碳酸氫鈉或氫 氧化鈉調(diào)pH為8.0~11.0，旋渦混合30s，在溫度45°C~70°C，衍生化反應(yīng)10~30min;
[0033] ③衍生化反應(yīng)后的溶液自然冷至室溫后，氮氣吹干，再加入混合液溶解，所述混合 液由0.65mL甲醇溶液和lmmol/L乙酸銨溶液0.35mL混合而成；溶解后的溶液中有機相用濾 膜過濾得濾液，所得濾液進超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定，按步驟（1)⑥所述的超高效 液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定條件測定；
[0034] ④經(jīng)超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定，得到待檢樣品峰的保留時間和峰面積，與 步驟（1)⑥所得的6種雌激素標(biāo)樣的保留時間進行比較，確定待檢樣品中所含雌激素的種 類，與步驟(1)⑦中所對應(yīng)的雌激素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線比較，得到所含雌激素的含量。
[0035] 2.根據(jù)技術(shù)方案1所述的衍生化測定酚類雌激素的方法，其特征在于:步驟（1)④ 中所述的有機溶劑為丙酮或者苯。
[0036] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0037] 1、通過本發(fā)明的柱前衍生化反應(yīng)方法，提高了 17β_雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌 酚、己烷雌酚、雙烯雌酚以及內(nèi)標(biāo)氘代17β-雌二醇(d3)的離子化效率，靈敏度得到了提高。 [0038] 2、目前還沒有采用超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器同時對17β_雌二醇、雌三醇、雌 酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚6種雌激素多殘留的檢測，本發(fā)明采用超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器及其參數(shù)設(shè)定進行定性和定量分析，定量限可達到1~2yg/kg，結(jié)果重現(xiàn)性良 好，3個添加濃度回收率為65%~121%，6次重復(fù)實驗的變異系數(shù)小于13%。
[0039] 3、本發(fā)明方法檢測成本低?，F(xiàn)有串聯(lián)質(zhì)譜儀器價格高達250萬元，而超高效液相色 譜-質(zhì)譜檢測器的價格70萬元，相比串聯(lián)質(zhì)譜儀器，本發(fā)明方法檢測成本低。
【附圖說明】
[0040]圖1是17β-雌二醇標(biāo)樣衍生物的色譜圖，圖中縱坐標(biāo)是強度，橫坐標(biāo)是時間。
[0041 ]圖2是雌三醇標(biāo)樣衍生物的色譜圖，圖中縱坐標(biāo)是強度，橫坐標(biāo)是時間。
[0042]圖3是雌酮標(biāo)樣衍生物和己烯雌酚標(biāo)樣衍生物的色譜圖，圖中縱坐標(biāo)是強度，橫坐 標(biāo)是時間。
[0043] 圖4是己烷雌酚標(biāo)樣衍生物的色譜圖，圖中縱坐標(biāo)是強度，橫坐標(biāo)是時間。
[0044] 圖5是雙烯雌酚標(biāo)樣衍生物的色譜圖，圖中縱坐標(biāo)是強度，橫坐標(biāo)是時間。
[0045] 圖6是內(nèi)標(biāo)標(biāo)樣衍生物的色譜圖，圖中縱坐標(biāo)是強度，橫坐標(biāo)是時間。
[0046] 圖7是牛奶加標(biāo)樣本的17β_雌二醇衍生物的色譜圖，圖中縱坐標(biāo)是強度，橫坐標(biāo)是 時間。
[0047] 圖8是牛奶加標(biāo)樣本的雌三醇衍生物的色譜圖，圖中縱坐標(biāo)是強度，橫坐標(biāo)是時 間。
[0048]圖9是牛奶加標(biāo)樣本的雌酮衍生物和己烯雌酚衍生物的色譜圖，圖中縱坐標(biāo)是強 度，橫坐標(biāo)是時間。
[0049] 圖10是牛奶加標(biāo)樣本的己烷雌酚衍生物的色譜圖，圖中縱坐標(biāo)是強度，橫坐標(biāo)是 時間。
[0050] 圖11是牛奶加標(biāo)樣本的雙烯雌酚衍生物的色譜圖，圖中縱坐標(biāo)是強度，橫坐標(biāo)是 時間。
[0051] 圖12是牛奶加標(biāo)樣本的內(nèi)標(biāo)衍生物的色譜圖，圖中縱坐標(biāo)是強度，橫坐標(biāo)是時間。
【具體實施方式】
[0052]以下實施例所用的所有原料、試劑等均為市售。各實施例中無特殊說明的為常規(guī) 方法。
[0053]實施例1衍生化反應(yīng)條件
[0054]①丹磺酰氯衍生試劑的制備:將固體丹磺酰氯溶解于丙酮溶劑，配制濃度lmg/mL 丹磺酰氯衍生試劑，裝入棕色瓶，置于-20°C冰箱儲存。
[0055] ②衍生化反應(yīng)條件1:加入步驟（1)①制備的lmg/mL丹磺酰氯衍生試劑10yL，用碳 酸氫鈉調(diào)節(jié)混合混合的pH為8.0，旋渦混合30s，在溫度45°C，衍生化反應(yīng)lOmin。
[0056] ③衍生化反應(yīng)條件2:加入步驟（1)①制備的lmg/mL丹磺酰氯衍生試劑IOOyU用碳 酸氫鈉調(diào)節(jié)混合混合的pH為9.0，旋渦混合30s，在溫度55°C，衍生化反應(yīng)lOmin。
[0057] ④衍生化反應(yīng)條件3:加入步驟（1)①制備的lmg/mL丹磺酰氯衍生試劑200yL，用碳 酸氫鈉調(diào)節(jié)混合溶液的pH為10.0，旋渦混合30s，在溫度55°C，衍生化反應(yīng)30min。
[0058] ⑤衍生化反應(yīng)條件4:加入步驟（1)①制備的lmg/mL丹磺酰氯衍生試劑500yL，用碳 酸氫鈉調(diào)節(jié)混合溶液的pH為11.0,旋渦混合30s，在溫度65°C，衍生化反應(yīng)20min。
[0059] ⑥衍生化反應(yīng)條件5:加入步驟（1)①制備的lmg/mL丹磺酰氯衍生試劑lOOOyL，用 碳酸氫鈉調(diào)節(jié)混合溶液的pH為10.0，旋渦混合30s，在溫度70°C，衍生化反應(yīng)10min。
[0060] 實施例2雌激素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備和雌激素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 [00611 (1)雌激素標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備
[0062]①標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備:將如下6種雌激素固體標(biāo)準(zhǔn)品：17β_雌二醇，雌三醇，雌酮， 己烯雌酚，己烷雌酚，雙烯雌酚，分別用甲醇溶解，分別配成濃度為lmg/mL的如下6種標(biāo)準(zhǔn)儲 備液：
[0063] lmg/mL的17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液；
[0064] lmg/mL的雌三醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液；
[0065] lmg/mL的雌酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液；
[0066] lmg/mL的己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液；
[0067] lmg/mL的己烷雌酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液；
[0068] lmg/mL的雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液；
[0069] 以上6種標(biāo)準(zhǔn)儲備液均置于_20°C冰箱儲存。
[0070] ②五個系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)液的制備:量取步驟⑴①制備的濃度為lmg/mL的17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液、濃度為lmg/mL的雌三醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液、濃度為lmg/mL的雌酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液、 濃度為lmg/mL的己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液、濃度為lmg/mL的己烷雌酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液、濃度為Img/ mL的雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液各取0.5mL混合到50mL容量瓶，用甲醇定容至50mL得混合工作液， 然后分取混合工作液用甲醇分別稀釋為混合標(biāo)準(zhǔn)液A、混合標(biāo)準(zhǔn)液B、混合標(biāo)準(zhǔn)液C、混合標(biāo) 準(zhǔn)液D、混合標(biāo)準(zhǔn)液E 5個不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，其中：
[0071] 混合標(biāo)準(zhǔn)液A中含有的17β-雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚6 個組分的濃度均為5ng/mL;
[0072] 混合標(biāo)準(zhǔn)液B中含有的17β_雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚6 個組分的濃度均為50ng/mL;
[0073] 混合標(biāo)準(zhǔn)液C中含有的17β_雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚6 個組分的濃度均為100ng/mL;
[0074] 混合標(biāo)準(zhǔn)液D中含有的17β_雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚6 個組分的濃度均為500ng/mL;
[0075] 混合標(biāo)準(zhǔn)液E中含有的17β_雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚6 個組分的濃度均為I 〇〇〇ng/mL。
[0076] ③內(nèi)標(biāo)的制備:將氘代17β_雌二醇(d3)用甲醇溶解后，用甲醇配成濃度為lmg/mL 的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，量取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加入甲醇配制成濃度為500ng/mL的內(nèi)標(biāo)。
[0077] ④丹磺酰氯衍生試劑的制備:將固體丹磺酰氯溶解于丙酮中，用丙酮配制成濃度 為lmg/mL丹磺酰氯衍生試劑，裝入棕色瓶，置于-20°C冰箱儲存。
[0078] ⑤分別取ImL步驟(1)②配制的五個系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，在每一個混合標(biāo)準(zhǔn)液 中加入步驟（1)③所制備的濃度為500ng/mL的內(nèi)標(biāo)I OOyL，每一個混合標(biāo)準(zhǔn)液加入內(nèi)標(biāo)混合 均勻后用氮氣吹干，分別得到對應(yīng)的五個混合標(biāo)樣;混合標(biāo)準(zhǔn)液A對應(yīng)的混合標(biāo)樣記為混合 標(biāo)樣A S混合標(biāo)準(zhǔn)液B對應(yīng)的混合標(biāo)樣記為混合標(biāo)樣B \混合標(biāo)準(zhǔn)液C對應(yīng)的混合標(biāo)樣記為 混合標(biāo)樣C \混合標(biāo)準(zhǔn)液D對應(yīng)的混合標(biāo)樣記為混合標(biāo)樣D \混合標(biāo)準(zhǔn)液E對應(yīng)的混合標(biāo)樣 記為混合標(biāo)樣E'。
[0079] (2)衍生化反應(yīng)和超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定
[0080] ①步驟（1)⑤所述的五個混合標(biāo)樣均按如下方法進行衍生化反應(yīng):每個混合標(biāo)樣 中加入步驟（1)④制備的lmg/mL丹磺酰氯衍生試劑200yL，用碳酸氫鈉調(diào)pH為10.0，旋渦混 合30s，在溫度60°C，衍生化反應(yīng)10min;
[0081 ] 每個衍生化反應(yīng)后的溶液自然冷至室溫后，氮氣吹干，再加入混合液溶解，所述混 合液由0.65mL甲醇溶液和lmmol/L乙酸銨溶液0.35mL混合而成；溶解后的溶液中有機相用 濾膜過濾得濾液，所得濾液進超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定，超高效液相色譜-質(zhì)譜檢 測器測定條件如下：
[0082] 色譜柱:waters BEH C18 2.1\50臟。色譜柱溫度：35°(：。進樣體積：1(^^
[0083]流動相為甲醇：lmmol/L乙酸銨，設(shè)置梯度洗脫，梯度洗脫條件按表1:
[0084] 弄1梯庶洗脫備件
[0086] 設(shè)置質(zhì)譜檢測器掃描方式:選擇離子模式，按表2所示質(zhì)譜檢測器測定衍生產(chǎn)物的 條件，正負(fù)離子同時掃描，掃描質(zhì)量數(shù)范圍為m/z = 40~600,錐孔電壓15V，采樣速率8點/ 秒;毛細(xì)管電壓〇. 8kv;
[0087] 表2質(zhì)譜檢測器測定衍生產(chǎn)物的條件
[0089] ②經(jīng)超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定得到17β_雌二醇，雌三醇，雌酮，己烯雌酚， 己烷雌酚，雙烯雌酚6種雌激素的峰面積和內(nèi)標(biāo)的峰面積，每個標(biāo)準(zhǔn)工作曲線按如下方法繪 制：
[0090] 以混合標(biāo)樣A'至混合標(biāo)樣E'中的每種雌激素的5個濃度對應(yīng)的峰面積分別與內(nèi)標(biāo) 峰面積之比所得到的5個比值為縱坐標(biāo)，以步驟（1)②中的五個混合標(biāo)準(zhǔn)液的濃度值5ng/ mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL為橫坐標(biāo)，繪制對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；詳見表 3〇
[0091] 6個標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為5~1000ng/mL，相關(guān)系數(shù)R2M). 995，6種雌激素衍生產(chǎn) 物有很好的線性關(guān)系，表明本發(fā)明方法和儀器條件合理可行。
[0092] 17β_雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、雙烯雌酚衍生物和內(nèi)標(biāo)衍生物的 色譜圖見圖1-圖6。
[0093]表3 6種雌激素回歸方程，相關(guān)系數(shù)及濃度范圍 L 〇〇95 J 買施例3午奶樣本檢測
[0096] (1)牛奶樣本的提取
[0097]市場隨機選擇牛奶為實驗樣本，并對上述6種雌激素殘留同時進行檢測。共設(shè)3個 添加濃度，分別為2，10，50yg/kg。分別設(shè)一個空白樣本，每個濃度重復(fù)6次，進行重復(fù)性實 驗，分別計算回收率和變異系數(shù)。
[0098] (2)衍生化反應(yīng)
[0099] 準(zhǔn)確稱取5g樣本，加入實施例2步驟（1)③所制備的濃度為500ng/mL的內(nèi)標(biāo)100yL， 經(jīng)提取凈化之后收集洗脫液，氮氣吹干，加入體積200yL實施例2步驟（1)④制備的lmg/mL丹 磺酰氯衍生試劑，用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH為10，旋渦混合30s，在溫度60 °C下反應(yīng)時間為30min， 得衍生化產(chǎn)物。取出自然冷至室溫后，氮氣吹干，再加入混合液溶解，所述混合液由0.65mL 甲醇溶液和lmmol/L乙酸銨溶液0.35mL混合而成，溶解后的溶液中有機相用濾膜過濾得濾 液，所得濾液進超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定，測定條件按照實施例2中步驟(2)①所述 的超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定條件。
[0100] (3)檢測結(jié)果
[0101] 檢測結(jié)果見表4。六種雌激素在2-50yg/kg的添加濃度范圍內(nèi)的定量限為l-2yg/ kg，回收率范圍為68%-121%，RSD范圍為4.3%-13.8%，表明本發(fā)明方法對于6種雌激素的 檢測靈敏度低，穩(wěn)定性較好。
[0102] 表4 6種雌激素的回收率，RSD，定量限n = 6
【主權(quán)項】
1. 一種衍生化測定酪類雌激素的方法，其特征在于包括W下步驟： (1)雌激素標(biāo)準(zhǔn)品的制備和測定 ① 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備:將17β-雌二醇，雌Ξ醇，雌酬，己締雌酪，己燒雌酪，雙締雌酪6種 雌激素固體標(biāo)準(zhǔn)品分別用甲醇溶解后，分別用甲醇配成濃度為Img/mL的6種標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置 于-20°C冰箱儲存； ② 五個系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)液的制備:量取步驟（1)①制備的濃度為Img/mL的17β-雌二 醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液、濃度為Img/mL的雌Ξ醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液、濃度為Img/mL的雌酬標(biāo)準(zhǔn)儲備液、濃度 為Img/mL的己締雌酪標(biāo)準(zhǔn)儲備液、濃度為Img/mL的己燒雌酪標(biāo)準(zhǔn)儲備液、濃度為Img/mL的 雙締雌酪標(biāo)準(zhǔn)儲備液各取0.5mL混合到50mL容量瓶，用甲醇定容至50血得混合工作液，然后 分取混合工作液用甲醇分別稀釋為混合標(biāo)準(zhǔn)液A、混合標(biāo)準(zhǔn)液B、混合標(biāo)準(zhǔn)液C、混合標(biāo)準(zhǔn)液 D、混合標(biāo)準(zhǔn)液E五個系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)液，其中： 混合標(biāo)準(zhǔn)液A中含有的17β-雌二醇、雌Ξ醇、雌酬、己締雌酪、己燒雌酪、雙締雌酪6個組 分的濃度均為5ng/ni; 混合標(biāo)準(zhǔn)液B中含有的17β-雌二醇、雌Ξ醇、雌酬、己締雌酪、己燒雌酪、雙締雌酪6個組 分的濃度均為50ng/ni; 混合標(biāo)準(zhǔn)液C中含有的17β-雌二醇、雌Ξ醇、雌酬、己締雌酪、己燒雌酪、雙締雌酪6個組 分的濃度均為10化g/ni; 混合標(biāo)準(zhǔn)液D中含有的17β-雌二醇、雌Ξ醇、雌酬、己締雌酪、己燒雌酪、雙締雌酪6個組 分的濃度均為50化g/ni; 混合標(biāo)準(zhǔn)液E中含有的17β-雌二醇、雌Ξ醇、雌酬、己締雌酪、己燒雌酪、雙締雌酪6個組 分的濃度均為1 OOOng/ni; ③ 內(nèi)標(biāo)的制備：將気代17β-雌二醇（d3)用甲醇溶解后，用甲醇配成濃度為Img/mL的內(nèi) 標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，量取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加入甲醇配制成濃度為50化g/mL的內(nèi)標(biāo)； ④ 丹橫酷氯衍生試劑的制備:將固體丹橫酷氯溶解于有機溶劑，用該有機溶劑配制成 濃度為Img/mL丹橫酷氯衍生試劑，裝入棟色瓶，置于-20°C冰箱儲存； ⑤ 分別取ImL步驟（1)②配制的五個系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，在每一個混合標(biāo)準(zhǔn)液中加 入步驟(1)③所制備的濃度為50化g/mL的內(nèi)標(biāo)10化L，每一個混合標(biāo)準(zhǔn)液加入內(nèi)標(biāo)混合均勻 后用氮氣吹干，分別得到對應(yīng)的五個混合標(biāo)樣;混合標(biāo)準(zhǔn)液A對應(yīng)的混合標(biāo)樣記為混合標(biāo)樣 ，混合標(biāo)準(zhǔn)液B對應(yīng)的混合標(biāo)樣記為混合標(biāo)樣8\混合標(biāo)準(zhǔn)液C對應(yīng)的混合標(biāo)樣記為混合 標(biāo)樣C\混合標(biāo)準(zhǔn)液D對應(yīng)的混合標(biāo)樣記為混合標(biāo)樣D\混合標(biāo)準(zhǔn)液Ε對應(yīng)的混合標(biāo)樣記為 混合標(biāo)樣E' ； ⑥ 衍生化反應(yīng)和超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定 步驟（1)⑤所述的五個混合標(biāo)樣均按如下方法進行衍生化反應(yīng):每個混合標(biāo)樣中加入 步驟（1)④制備的Img/mL丹橫酷氯衍生試劑10~1000化，用碳酸氨鋼或氨氧化鋼調(diào)抑為8.0 ~11.0，旋滿混合30s，在溫度45°C~70°C，衍生化反應(yīng)10~30min; 每個衍生化反應(yīng)后的溶液自然冷至室溫后，氮氣吹干，再加入混合液溶解，所述混合液 由0.65mL甲醇溶液和Immol/L乙酸錠溶液0.35mL混合而成;溶解后的溶液中有機相用濾膜 過濾得濾液，所得濾液進超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定，超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器 測定條件如下： 色譜柱:waters肥Η C18 2.1X50mm。色譜柱溫度:35°C。進樣體積 流動相為甲醇：Immol/L乙酸錠，設(shè)置梯度洗脫，梯度洗脫條件按表1: 表1梯度洗脫條件設(shè)置質(zhì)譜檢測器掃描方式：選擇離子模式，按表2所示質(zhì)譜檢測器測定衍生產(chǎn)物的條 件，正負(fù)離子同時掃描，掃描質(zhì)量數(shù)范圍為m/z = 40~600,錐孔電壓15V，采樣速率8點/秒， 毛細(xì)管電壓〇.8kv; 表2質(zhì)譜檢測器測定衍生產(chǎn)物的條件⑦經(jīng)超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定得到17β-雌二醇，雌Ξ醇，雌酬，己締雌酪，己燒 雌酪，雙締雌酪6種雌激素的峰面積和內(nèi)標(biāo)的峰面積，分別W6種雌激素的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰 面積之比值為縱坐標(biāo)，步驟(1)②中的五個混合標(biāo)準(zhǔn)液的濃度值為橫坐標(biāo)，繪制對應(yīng)的六個 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線； (2)待檢樣品檢測 ① 準(zhǔn)確稱取5g動物組織待檢樣品，加入1(Κ)化步驟（1)③所制備的濃度為50化g/mL的內(nèi) 標(biāo)，用25mL乙臘提取，500化pm，離屯、5min，收集上清液，氮氣吹干； ② 加入步驟（1)④所述的Img/mL丹橫酷氯衍生試劑10-100化L后，用碳酸氨鋼或氨氧化 鋼調(diào)抑為8.0~11.0，旋滿混合30s，在溫度45°C~70°C，衍生化反應(yīng)10~30min; ③ 衍生化反應(yīng)后的溶液自然冷至室溫后，氮氣吹干，再加入混合液溶解，所述混合液由 0.65mL甲醇溶液和Immol/L乙酸錠溶液0.35mL混合而成;溶解后的溶液中有機相用濾膜過 濾得濾液，所得濾液進超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定，按步驟（1)⑥所述的超高效液相 色譜-質(zhì)譜檢測器測定條件測定； ④ 經(jīng)超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定，得到待檢樣品峰的保留時間和峰面積，與步驟 (1)⑥所得的6種雌激素標(biāo)樣的保留時間進行比較，確定待檢樣品中所含雌激素的種類，與 步驟(1)⑦中所對應(yīng)的雌激素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線比較，得到所含雌激素的含量。2.根據(jù)技術(shù)方案1所述的衍生化測定酪類雌激素的方法，其特征在于:步驟（1)④中所 述的有機溶劑為丙酬或者苯。
【文檔編號】G01N30/88GK105842379SQ201610387235
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年6月2日
【發(fā)明人】劉宏程, 黎其萬, 林濤, 李寧, 邵金良, 汪祿祥
【申請人】云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所