專利名稱：一種用變色酸衍生物比色測定血清鎂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于血清鎂比色法測定技術(shù)領(lǐng)域。
血清鎂的測定方法有原子吸收分光光度法、酶偶聯(lián)速率測定法和比色法等。原子吸收分光光度法是鎂測定的參考方法，因儀器條件限制難以普及。酶偶聯(lián)法國外文獻(xiàn)有過報導(dǎo)，國內(nèi)未見應(yīng)用?；诮饘俳j(luò)合劑顯色的比色法操作簡便，反應(yīng)迅速，其中的Calmagite法和甲基百里酚藍(lán)法(MTB)被廣泛采用。但上述兩種比色法的靈敏度、MTB法的試劑及反應(yīng)液穩(wěn)定性不甚理想。
本發(fā)明的目的是提供一種使用國內(nèi)新合成的金屬離子絡(luò)合劑2--(8′-羥基喹啉-5′-磺酸-7′-偶氮)-變色酸(8Q5SAC)進(jìn)行血清鎂測定的方法。本發(fā)明方法簡便、微量、快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，本方法靈敏度、試劑穩(wěn)定性明顯優(yōu)于Calmagite法和MTB法，適用于血清鎂的常規(guī)手工分析和生化分析儀分析。
本測定方法的實施原理8Q5SAC在堿性緩沖介質(zhì)中與血清鎂絡(luò)合呈色，波長541nm處有一主吸收峰。以乙二醇雙(α-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA)掩蔽血清鈣。反應(yīng)液吸光度與鎂濃度在一定范圍內(nèi)成正比。
材料與方法一、試劑1、緩沖液每升含甘氨酸0.1mol、NaOH 0.13mol、NaCl 0.2mol，EGTA0.2mmol NaN315mmol。
2、顯色劑每升含8Q5SAC(南昌大學(xué)合成)0.3mmol，聚乙烯吡咯烷酮5g，op乳化劑6ml3、10mmol/L鎂標(biāo)準(zhǔn)液4、鎂標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(1.0mmol/L)5、應(yīng)用試劑試劑1、2等量混合。室溫密閉遮光保存，穩(wěn)定期至少兩周。
二、儀器1、722型分光光度計
2、pH計三、方法在測定、標(biāo)準(zhǔn)、空白管中分別加人血清、鎂標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(1mmol/L)、水各0.02ml，每管加應(yīng)用試劑3ml?；靹颉ｌo置2分鐘。540nm波長，1cm光徑，空白管調(diào)零比色。
計算血清鎂(mmol/L)＝(測定A/標(biāo)準(zhǔn)A)×1式中測定A測定管吸光度；標(biāo)準(zhǔn)A標(biāo)準(zhǔn)管吸光度；1鎂標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度1mmol/L實驗結(jié)果一、吸收光譜以應(yīng)用試劑調(diào)零，鎂反應(yīng)液的吸收光譜(

圖1)在541nm和575nm處有兩個吸收峰，541nm為主峰。
以水調(diào)零，應(yīng)用試劑的吸光度從480nm-600nm為一上升坡形，541nm處空白吸光度明顯低于575nm處吸光度。
所以，選擇540nm為測試波長。
二、緩沖體系及pH的選擇分別配制以甘氨酸-NaOH和硼酸鹽為緩沖體系的系列pH應(yīng)用試劑與鎂反應(yīng)。以對應(yīng)管試劑空白調(diào)零，讀取各管吸光度，圖2。其靈敏度甘氨酸-NaOH緩沖體系在pH11.2時最高，硼酸鹽緩沖體系在pH9.8時最高，前者的靈敏度大大高于后者。
以pH11.2，終濃度25-75mmol/L的甘氨酸緩沖體系應(yīng)用試劑測鎂，甘氨酸濃度為50mmol/L時靈敏度最佳。
選擇應(yīng)用試劑緩沖體系為甘氨酸-NaOH，pH11.2，甘氨酸終濃度為50mmol/L。
三、8Q5SAC濃度選擇試劑空白吸光度與8Q5SAC濃度成正比，測試靈敏度與8Q5SAC濃度在一定范圍內(nèi)正相關(guān)，圖3，8Q5SAC濃度達(dá)0.15mmol/L以上時，靈敏度不再上升。兼顧空白吸光度和靈敏度，選擇應(yīng)用試劑中8Q5SAC終濃度0.15mmol/L。
四、EGTA濃度選擇8Q5SAC法測定血清鎂的最大干擾源是鈣。EGTA在pH11.2的反應(yīng)介質(zhì)中對鈣的選擇性明顯大于鎂。配制含系列EGTA濃度(50-150umol/L)的應(yīng)用試劑，觀察鎂靈敏度和鈣掩蔽作用。各濃度管的鎂靈敏度基本一致，EGTA濃度達(dá)75umol/L，可掩蔽樣品鈣濃度達(dá)8mmol/L。
選擇EGTA終濃度為100umol/L五、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和OP乳化劑濃度選擇聚乙烯吡咯烷酮可防止蛋白質(zhì)干擾反應(yīng)，降低空白吸光度，提高測試靈敏度，并改變反應(yīng)液吸收光譜(吸收峰由523nm、560mm移至541mm和575mm)。經(jīng)試驗聚乙烯吡咯烷酮終濃度為2.5g/L時，反應(yīng)靈敏度最高。
OP乳化劑可防止蛋白質(zhì)對反應(yīng)的干擾，降低空白吸光度，提高反應(yīng)靈敏度。OP乳化劑終濃度為3ml/L時，靈敏度最高。
六、干擾試驗下列物質(zhì)含量鈉1.2mol/L，鉀80mmol/L，鈣10mmol/L，高鐵離子300umol/L，亞鐵離子50umol/L，銅50umol/L，鋅50umol/L，血紅蛋白10g/L，總膽紅素386umol/L，對本法均無有意義的干擾。
七，回收試驗鎂濃度0.86mmol/L的混合血清1ml，分別加入10mmol/L鎂標(biāo)準(zhǔn)液50、80、100ul，測得值分別為1.28，1.50，1.66mmol/L?；厥章室来螢?8.8％，97.6％、98.2％，平均回收率98.2％。
八、線性試驗可接受的線性范圍0-3mmol/L。圖4。
九、重復(fù)性試驗n x s cv％低值 批內(nèi)200.86 0.023 2.67批間100.87 0.026 2.99高值 批內(nèi)201.51 0.029 1.92批間101.53 0.039 2.55十 對照試驗26份樣品鎂濃度0.63-1.86mmol/L本法(X)與Calmagite法(Y，TRACE試劑，批號60535)平行測定，r＝0.996Y^=0.948X^+0.041,]]>t＝1.163，P＞0.2。本法(X)與MTB法(Z，科華試劑，批號960811)平行測定，r＝0.983Z^=1.260X^-0.232,]]>t＝1.082，P＞0.2。
三種方法平行測定1mmol/L鎂標(biāo)準(zhǔn)液(方法標(biāo)準(zhǔn)液0.05ml，試劑7.5ml混勻5分鐘，1cm光徑，水調(diào)零比色)結(jié)果見下表
本法與Calmagite法空白吸光度(A空白)基本一致。靈敏度是Calmagite法的2.5倍，是MTB法的4.3倍。
十一、顯色時間及穩(wěn)定性即刻顯色，顯色穩(wěn)定時間2分鐘至l5小時。
十二、正常參考值測定65例正常成人血清鎂，x=0.89mmol/L，s＝0.11，x±1.96s為0.67-1.11mmol/L。
本發(fā)明確定的用8Q5SAC進(jìn)行血清鎂比色測定方法，實驗結(jié)果證明該法簡便、微量、快速，準(zhǔn)確性、重復(fù)性、線性和抗干擾能力等各項指標(biāo)均達(dá)到滿意效果。本法完全可以用于血清鎂的常規(guī)分析。本方法的優(yōu)點是設(shè)計利用8Q5SAC的靈敏特性，研究優(yōu)化反應(yīng)條件，使測鎂靈敏度明顯高于目前常用的MTB法和Calmagite法，分別高4.3倍和2.5倍，從而使得血清鎂比色法測試分辨力低，精度較差的問題有較大改變。本方法的另一優(yōu)點是所用試劑穩(wěn)定。雙試劑可長期貯存，應(yīng)用試劑的穩(wěn)定性(可達(dá)兩周)也優(yōu)于Calmagite法(4天)和MTB法(5小時)。因此本法不僅能使手工操作更加簡便，而且通過適當(dāng)編排即能運用于具有雙試劑功能的生化分析儀，也能方便地運用于單試劑功能的生化分析儀。本方法的再一優(yōu)點是主要試劑材料8Q5SAC由國內(nèi)合成，而且方法性能優(yōu)于依靠進(jìn)口試劑的Calmagite法。
權(quán)利要求
1.一種比色測定血清鎂的方法，本發(fā)明的特征是以2-(8′-羥基喹啉-5′-磺酸-7′-偶氮)-變色酸(8Q5SAC)作為金屬離子絡(luò)合劑，在堿性緩沖介質(zhì)中與血清鎂絡(luò)合呈色，以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和OP乳化劑作抗蛋白干擾劑和反應(yīng)增色劑，在波長541nm處有一主吸收峰，以乙二醇雙(α-氨基乙基)醚四乙酸(EGTA)掩蔽血清鈣，反應(yīng)液吸光度與鎂濃度在0—3mmol/L范圍內(nèi)成正比。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于選擇應(yīng)用試劑中8Q5SAC終濃度為0.15mmol/L。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于選擇應(yīng)用試劑堿性緩沖介質(zhì)為甘氨酸-NaOH，甘氨酸終濃度為50mmol/L，pH為11.2。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于選擇應(yīng)用試劑PVP終濃度為2.5g/L，OP乳化劑終濃度為3ml/L。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于選擇應(yīng)用試劑EGTA終濃度為100umol/L。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于選擇540nm為測試波長。
全文摘要
一種比色法測定血清鎂的方法。原有的比色測定血清鎂的方法是Calmagite法和MTB法，但測度分辨力低，精度較差。本發(fā)明方法采用2-(8’-羥基喹啉-5’-磺酸-7’-偶氨)-變色酸(8Q
文檔編號G01N21/78GK1167259SQ9611722
公開日1997年12月10日 申請日期1996年12月17日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月17日
發(fā)明者陳力平, 黃雅娟, 周雪, 胡康林, 田云 申請人:中國人民解放軍第101醫(yī)院